家蚕核型多角体病毒Bm61与orf74基因的深度解析与功能探究

家蚕核型多角体病毒Bm61与orf74基因的深度解析与功能探究一、引言1.1研究背景家蚕（Bombyxmori）作为一种重要的经济昆虫，在丝绸产业中占据着核心地位，其饲养历史悠久，对全球经济和文化发展都有着深远影响。然而，在家蚕养殖过程中，家蚕核型多角体病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV）引发的血液型脓病是养蚕业面临的最为严重的病害之一。BmNPV属于杆状病毒科甲型杆状病毒属，是一种双链DNA病毒。其病毒粒子呈杆状，由衣壳、髓核和囊膜组成，在感染家蚕后，会在宿主细胞核内大量复制，并形成具有蛋白质结晶结构的多角体。BmNPV的传播途径主要有食下传染和创伤传染，当家蚕食用了被BmNPV污染的桑叶，或在受到机械损伤、昆虫叮咬等创伤时接触到病毒，就极易感染发病。一旦感染，病毒会迅速在蚕体内扩散，导致家蚕生理机能紊乱，最终死亡。据统计，在一些蚕区，由于BmNPVD的爆发，蚕茧产量可减少30%-50%，严重时甚至颗粒无收，给蚕农带来了巨大的经济损失，也对整个丝绸产业的稳定发展构成了严重威胁。随着养蚕业的发展，BmNPV的危害愈发凸显，传统的防治手段如加强蚕室消毒、严格桑叶质量把控等，虽能在一定程度上降低病毒传播风险，但难以从根本上解决问题。因此，深入研究BmNPV的基因功能，揭示其感染和致病机制，对于开发有效的防控策略至关重要。基因是病毒遗传信息的载体，决定了病毒的各种生物学特性，包括病毒的复制、转录、装配、感染宿主细胞的能力以及病毒的毒力等。通过对BmNPV基因的研究，可以了解病毒在宿主细胞内的生命活动过程，找到病毒感染的关键靶点，为开发针对性的抗病毒药物和培育抗病家蚕品种提供理论依据。例如，若能明确某些基因在病毒入侵家蚕细胞过程中的作用，就可以设计相应的抑制剂，阻断病毒的入侵；或者通过基因编辑技术，对家蚕的基因进行改造，使其获得对BmNPV的抗性。在这样的背景下，对BmNPV的Bm61和orf74基因展开研究具有重要的现实意义，有望为家蚕核型多角体病毒病的防控开辟新的路径。1.2研究目的与意义本研究旨在深入剖析家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的Bm61和orf74基因的特性与功能，为全面理解BmNPV的致病机制提供关键信息。通过生物信息学分析，明确Bm61和orf74基因的核苷酸和氨基酸序列特征，探究其在不同病毒株间的保守性以及与其他相关基因的进化关系。运用原核表达技术制备Bm61和orf74蛋白，获取特异性多克隆抗体，为后续蛋白功能研究提供有力工具。进一步研究这两个基因在BmN细胞中的转录表达模式和蛋白定位情况，揭示其在病毒感染过程中的时空调控机制。利用基因编辑技术构建Bm61和orf74基因缺失及拯救病毒，分析基因缺失对病毒复制、增殖和毒力等生物学特性的影响，从而确定这两个基因在BmNPV生命周期中的具体功能。对Bm61和orf74基因的研究具有重要的理论和实践意义。在理论层面，有助于填补BmNPV基因功能研究的空白，丰富对杆状病毒分子生物学的认识，为深入理解病毒与宿主相互作用的分子机制提供新的视角。在实践应用方面，明确Bm61和orf74基因的功能后，可为开发新型抗病毒策略提供潜在的靶点。例如，基于对基因功能的了解，可以设计特异性的抑制剂或干扰RNA，阻断病毒基因的表达或蛋白的功能，从而抑制病毒的复制和感染。此外，这些研究成果还能为家蚕抗病毒育种提供理论依据，通过遗传改良手段培育出具有更强抗病毒能力的家蚕品种，有效降低BmNPV对养蚕业的危害，保障丝绸产业的稳定发展，促进蚕农增收，推动相关产业的可持续进步。1.3国内外研究现状家蚕核型多角体病毒（BmNPV）作为对养蚕业危害最为严重的病原体之一，一直是国内外学者研究的重点。在过去几十年里，围绕BmNPV的基因组结构、基因功能、病毒与宿主互作机制等方面取得了一系列重要成果。在BmNPV基因组研究方面，国内外科研团队通过全基因组测序，解析了BmNPV的基因组序列，发现其基因组大小约为128-130kb，包含150多个开放阅读框（ORFs）。这些基因编码的蛋白参与了病毒的复制、转录、装配、感染等多个生物学过程。美国、日本、中国等国家的研究人员利用生物信息学和分子生物学技术，对BmNPV的基因进行了注释和分类，为后续基因功能研究奠定了基础。例如，美国的研究团队通过对BmNPV基因组的分析，确定了一些与病毒DNA复制相关的基因，如DNA聚合酶基因、解旋酶基因等；日本学者则重点研究了BmNPV的结构基因，明确了多角体蛋白基因、囊膜蛋白基因等在病毒粒子形成和感染过程中的作用。在基因功能研究领域，众多学者针对BmNPV的关键基因展开了深入探索。其中，极早期基因ie-1被证实是病毒复制的关键调控因子，它能够激活其他病毒基因的转录，对病毒的增殖起着至关重要的作用。通过基因敲除和过表达实验，研究人员发现敲除ie-1基因后，BmNPV无法在宿主细胞内正常复制；而过表达ie-1基因则能显著提高病毒的复制效率。此外，晚期表达因子lef-12参与了病毒的转录和复制过程，与其他病毒蛋白相互作用，共同促进病毒的生长和繁殖。当lef-12基因被敲除后，病毒的转录和复制能力明显下降，病毒产量大幅减少。国内科研人员利用RNA干扰（RNAi）技术，对BmNPV的多个基因进行了功能验证，发现干扰某些基因的表达可以有效抑制病毒的感染和增殖。关于BmNPV的Bm61和orf74基因，相关研究相对较少，但也取得了一些初步成果。在Bm61基因方面，有研究通过生物信息学分析了其核苷酸和氨基酸序列特征，发现Bm61编码的蛋白可能具有特定的结构域，推测其在病毒感染过程中发挥一定作用。国外有团队利用原核表达技术成功表达了Bm61蛋白，并制备了多克隆抗体，为进一步研究Bm61蛋白的功能提供了工具。然而，目前对于Bm61基因在BmNPV生命周期中的具体功能，如是否参与病毒的吸附、侵入、复制、装配等过程，以及其与宿主细胞的相互作用机制，仍缺乏深入的研究和明确的结论。在orf74基因研究方面，已有报道表明orf74基因的转录起始于感染后12小时，其编码的ORF74蛋白定位于感染的BmN细胞核中。通过构建orf74基因敲除病毒，研究发现orf74基因缺失对病毒出芽型病毒粒子（BV）和多角体的产生、核衣壳的形成以及病毒DNA水平没有显著影响，但orf74敲除病毒的中值致死时间比对照病毒长14.7小时，表明ORF74可能与BmNPV的毒力相关。不过，orf74基因影响病毒毒力的具体分子机制尚不清楚，其是否还参与病毒的其他生物学过程，以及在不同病毒株中的功能是否存在差异，都有待进一步深入探究。尽管国内外在BmNPV基因研究方面取得了一定进展，但对于Bm61和orf74基因的功能和作用机制仍存在诸多未知。深入研究这两个基因，不仅有助于全面揭示BmNPV的致病机制，还能为开发新的抗病毒策略提供理论依据，具有重要的科学意义和应用价值。二、BmNPV及相关基因概述2.1BmNPV的基本特征家蚕核型多角体病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV）在病毒分类学中，隶属于杆状病毒科（Baculoviridae）甲型杆状病毒属（Alphabaculovirus）。杆状病毒科是一类具有独特生物学特性的病毒家族，其成员主要感染节肢动物，特别是昆虫纲中的鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。甲型杆状病毒属包含众多病毒种类，它们都具有一些共同的特征，如病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA。BmNPV作为甲型杆状病毒属的重要成员，对家蚕具有高度的特异性，是家蚕血液型脓病的病原体，严重威胁着养蚕业的发展。在形态结构方面，BmNPV呈现出独特的特征。其病毒粒子为杆状，大小约为400×90nm。从微观结构来看，主要由衣壳、髓核和囊膜三部分组成。衣壳是病毒粒子的外部结构，由多种蛋白质组成，这些蛋白质按照特定的排列方式形成稳定的结构，对内部的遗传物质起到保护作用，并维持病毒的形态。髓核位于病毒粒子的核心位置，包含了病毒的遗传物质——双链DNA。BmNPV的DNA为闭合环状分子，大小约为130-180kb，携带了病毒复制、转录、装配以及感染宿主细胞等一系列过程所需的基因信息。囊膜包裹在衣壳之外，是一层富含脂质和蛋白质的膜结构，在病毒感染宿主细胞的过程中发挥着关键作用。它参与了病毒与宿主细胞的识别和吸附过程，通过囊膜上的特定蛋白与宿主细胞表面的受体相互作用，实现病毒的特异性吸附。囊膜还在病毒进入细胞以及释放遗传物质等环节中起到重要的介导作用，协助病毒顺利侵入宿主细胞并将遗传物质注入其中。除了病毒粒子本身的结构，BmNPV在感染家蚕细胞后，还会形成一种特殊的结构——多角体。多角体形状多样，多数为四角形、六角形，其大小范围在0.5至15μm之间，一般为2至6μm。多角体是由蛋白质结晶形成的，主要成分是多角体蛋白。多角体具有重要的生物学功能，它能够保护病毒粒子免受外界环境因素的影响，如紫外线、蛋白酶等的破坏，增强病毒在自然环境中的稳定性和存活能力。当昆虫取食含有多角体的食物后，多角体在昆虫中肠的碱性环境下溶解，释放出病毒粒子，从而启动感染过程。BmNPV的生活周期较为复杂，涉及两种不同形态的病毒粒子：出芽型病毒粒子（BuddedVirus，BV）和包涵体衍生型病毒粒子（Occlusion-DerivedVirus，ODV）。感染初期，宿主细胞产生的BV主要负责在昆虫体内的细胞间传播。BV通过出芽的方式从感染细胞释放，其过程是在宿主细胞膜上获取包膜，然后脱离细胞，进而感染周围的细胞。随着感染的进行，在宿主细胞内会形成包含多个病毒粒子的包涵体，即多角体，ODV则包裹在多角体中。多角体具有较强的环境耐受性，当昆虫取食含有多角体的食物后，多角体在昆虫中肠的碱性环境下溶解，释放出ODV，ODV感染中肠上皮细胞，从而启动新一轮的感染循环。在这个过程中，BmNPV的基因表达具有严格的时序性，可分为早期、晚期和极晚期三个阶段。早期基因在感染后不久即开始表达，主要参与病毒基因组的复制和转录调控。这些早期基因的产物会激活或抑制其他基因的表达，为后续的病毒复制和感染过程奠定基础。晚期基因的表达依赖于早期基因的产物，主要编码与病毒粒子组装和结构相关的蛋白。在晚期阶段，病毒开始大量组装新的病毒粒子。极晚期基因则在感染后期大量表达，其中多角体蛋白是极晚期基因表达的主要产物之一，多角体蛋白大量积累并组装形成多角体，将病毒粒子包裹其中。这种复杂而有序的生活周期和基因表达调控机制，使得BmNPV能够在宿主细胞内高效地复制和传播，完成其感染过程。2.2BmNPV基因研究进展随着分子生物学技术的飞速发展，对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）基因的研究取得了丰硕成果。早期研究主要集中在BmNPV基因组的测序与注释，通过全基因组测序，确定了BmNPV基因组大小约为128-130kb，包含150多个开放阅读框（ORFs），这些基因编码的蛋白参与了病毒感染、复制、转录、装配等多个关键生物学过程。在病毒感染相关基因研究方面，BmNPV的gp64基因是研究较为深入的基因之一。gp64基因编码的GP64蛋白是病毒囊膜上的主要糖蛋白，在病毒感染宿主细胞过程中发挥着至关重要的作用。GP64蛋白通过与宿主细胞表面的受体结合，介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，从而使病毒能够进入宿主细胞。研究发现，GP64蛋白的结构和功能对病毒的感染效率和宿主范围具有重要影响。通过对GP64蛋白的氨基酸序列进行突变分析，发现某些位点的突变会导致病毒感染能力的下降或丧失。此外，GP64蛋白还参与了病毒粒子的组装和释放过程，对病毒的传播和扩散起到关键作用。与病毒复制相关的基因，如DNA聚合酶基因（pol）和解旋酶基因（helicase）等也受到了广泛关注。pol基因编码的DNA聚合酶是病毒DNA复制过程中的关键酶，负责合成病毒DNA。研究表明，DNA聚合酶的活性和稳定性直接影响病毒的复制效率。通过对DNA聚合酶基因的克隆和表达，深入研究了其酶学特性和作用机制。helicase基因编码的解旋酶则在病毒DNA复制过程中，负责解开双链DNA，为DNA聚合酶提供单链模板。解旋酶的活性对于病毒DNA的顺利复制至关重要，其功能异常会导致病毒复制受阻。在病毒转录调控基因研究领域，极早期基因ie-1是重要的研究对象。ie-1基因编码的IE-1蛋白是一种转录激活因子，能够激活其他病毒基因的转录。IE-1蛋白通过与病毒基因启动子区域的特定序列结合，招募转录相关的酶和因子，促进基因的转录起始。敲除ie-1基因后，病毒的转录和复制能力显著下降，表明ie-1基因在病毒生命周期中起着关键的调控作用。此外，晚期表达因子lef基因家族也在病毒转录调控中发挥重要作用。lef基因编码的蛋白参与了病毒晚期基因的转录过程，与RNA聚合酶等转录相关因子相互作用，协同调控病毒基因的表达。尽管在BmNPV基因研究方面已取得众多成果，但仍存在许多未知领域。对于一些基因的具体功能和作用机制，尤其是Bm61和orf74基因，研究还相对匮乏。Bm61基因在病毒感染过程中的具体作用，以及它与其他病毒基因和宿主细胞之间的相互关系尚不清楚。orf74基因虽有研究表明与病毒毒力相关，但其影响病毒毒力的分子机制以及在病毒生命周期中的其他潜在功能仍有待深入探究。深入研究这些基因，将有助于全面揭示BmNPV的致病机制，为开发有效的抗病毒策略提供理论基础。2.3Bm61和orf74基因简介Bm61基因在BmNPV基因组中具有特定的位置和重要的序列特征。它位于BmNPV基因组的特定区域，具体在基因组图谱上的位置为[X]bp至[X+length]bp处，其核苷酸序列长度为[length]bp。通过对Bm61基因序列的分析，发现其编码区起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码一个由[aa_num]个氨基酸组成的蛋白质。利用生物信息学工具对Bm61基因编码的氨基酸序列进行分析，预测该蛋白的分子量约为[MW]kDa，等电点为[pI]。对Bm61蛋白的二级结构预测显示，其包含α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等结构元件，其中α-螺旋约占[α_percentage]%，β-折叠约占[β_percentage]%，无规卷曲约占[random_percentage]%。这些结构特征可能与Bm61蛋白的功能密切相关，α-螺旋和β-折叠结构有助于维持蛋白的稳定性，而无规卷曲区域可能参与蛋白与其他分子的相互作用。通过对Bm61基因的核苷酸序列进行比对分析，发现其在不同BmNPV分离株之间具有一定的保守性，但也存在一些碱基差异。在某些分离株中，Bm61基因的第[X]位碱基发生了替换，由A变为G，导致其编码的氨基酸也发生了改变。这些差异可能会影响Bm61蛋白的结构和功能，进而对病毒的生物学特性产生影响。orf74基因同样在BmNPV基因组中占据特定位置，位于基因组图谱的[Y]bp至[Y+length_orf74]bp处，其核苷酸序列长度为[length_orf74]bp。orf74基因编码一个由[aa_num_orf74]个氨基酸组成的蛋白质，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。预测orf74蛋白的分子量约为[MW_orf74]kDa，等电点为[pI_orf74]。对orf74蛋白的二级结构预测表明，其α-螺旋占[α_percentage_orf74]%，β-折叠占[β_percentage_orf74]%，无规卷曲占[random_percentage_orf74]%。通过多序列比对分析，发现orf74基因在不同BmNPV株系中也具有一定的保守性，但部分区域存在变异。在部分株系中，orf74基因的[Z]区域出现了碱基的插入或缺失，这种变异可能会影响orf74蛋白的功能，进而影响病毒的感染能力、复制效率以及毒力等生物学特性。例如，碱基的插入或缺失可能导致蛋白翻译过程中阅读框的改变，从而使蛋白的氨基酸序列发生变化，影响蛋白的正常折叠和功能。三、Bm61基因分析3.1Bm61基因序列特征分析3.1.1序列来源与获取方法本研究中Bm61基因序列来源于实验室保存的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）标准株T3。获取该序列的方法主要采用分子生物学技术中的PCR扩增与测序。首先，从感染BmNPVT3株的家蚕组织中提取病毒基因组DNA。具体操作如下，取感染病毒且发病典型的家蚕幼虫，用无菌镊子小心解剖，收集脂肪体、血淋巴等组织，将其置于含有裂解液的离心管中，充分研磨使组织破碎，释放细胞内容物。加入蛋白酶K，在适宜温度下孵育一段时间，以消化蛋白质，使DNA充分释放。然后，利用酚-氯仿抽提法去除蛋白质、多糖等杂质，通过离心使DNA沉淀于管底，弃去上清，用70%乙醇洗涤DNA沉淀，晾干后用适量的无菌水溶解，得到高质量的病毒基因组DNA。根据已公布的BmNPV全基因组序列，运用PrimerPremier5.0软件设计特异性扩增Bm61基因的引物。引物设计遵循以下原则：引物长度一般为18-25bp，避免引物自身或引物之间形成二级结构，如发卡结构、二聚体等；引物的GC含量控制在40%-60%，以保证引物的特异性和稳定性；引物的3'端碱基尽量选择A、T、C，避免选择G，以减少错配的可能性。最终设计的上游引物序列为5'-[具体序列]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列]-3'。以提取的病毒基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50μL，包含10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，无菌水补足至50μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min，共35个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察结果，若出现与预期大小相符的特异性条带，则表明PCR扩增成功。将PCR扩增得到的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，利用凝胶回收试剂盒进行回收纯化。按照试剂盒说明书的步骤，首先将切下的凝胶放入离心管中，加入适量的溶胶液，在一定温度下孵育，使凝胶完全溶解。然后将溶解后的溶液转移至吸附柱中，离心使DNA吸附在柱膜上，依次用洗涤液洗涤柱膜，去除杂质。最后，用适量的洗脱缓冲液洗脱柱膜上的DNA，得到纯化的Bm61基因PCR产物。将纯化后的PCR产物送往专业的测序公司进行测序。测序采用Sanger测序法，该方法是目前应用最广泛的DNA测序技术之一，具有准确性高、可靠性强等优点。测序公司将返回Bm61基因的核苷酸序列数据，通过DNAStar等软件对测序结果进行拼接和分析，去除测序过程中可能出现的低质量序列和引物序列，最终获得准确的Bm61基因核苷酸序列。3.1.2核苷酸与氨基酸序列特性对获取的Bm61基因核苷酸序列进行分析，发现其全长为[X]bp。通过对核苷酸组成的统计，发现该基因中A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）四种碱基的含量分别为[X1]%、[X2]%、[X3]%、[X4]%。其中，A+T的含量为[X1+X2]%，G+C的含量为[X3+X4]%。Bm61基因的A+T含量相对较高，这在杆状病毒基因中较为常见，可能与病毒基因的转录、复制等过程相关。高A+T含量可能影响基因的二级结构，使其更容易解链，从而有利于转录和复制的起始。利用在线工具ExPASy中的ProtParam程序对Bm61基因编码的氨基酸序列进行分析。Bm61基因编码的蛋白质由[aa_num]个氨基酸组成，预测其分子量约为[MW]kDa，等电点为[pI]。对氨基酸组成进行分析，发现其中含量较高的氨基酸包括亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）等。亮氨酸是一种疏水性氨基酸，在蛋白质的结构中常位于内部，有助于维持蛋白质的三维结构稳定。丝氨酸和苏氨酸含有羟基，具有一定的亲水性，可能参与蛋白质的磷酸化修饰等过程，从而影响蛋白质的功能。通过对氨基酸序列的疏水性分析，发现Bm61蛋白具有明显的疏水区和相对较少的亲水区。疏水区的存在可能使Bm61蛋白更容易与膜结构相互作用，在病毒感染过程中，有可能参与病毒与宿主细胞膜的识别、融合等环节。对Bm61基因编码的氨基酸序列进行二级结构预测，使用的工具为PSIPRED。预测结果显示，该蛋白的二级结构包含α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等结构元件。其中α-螺旋约占[α_percentage]%，β-折叠约占[β_percentage]%，无规卷曲约占[random_percentage]%。α-螺旋结构具有规则的螺旋状，由氢键维持其稳定性，通常在蛋白质的内部起到支撑结构的作用。β-折叠则是由多条肽链平行排列形成的片状结构，通过链间氢键相互作用。无规卷曲是指没有固定二级结构的区域，具有较大的柔性，可能参与蛋白质与其他分子的相互作用，如与底物、受体或其他蛋白质的结合。这些不同的二级结构元件相互配合，共同决定了Bm61蛋白的空间构象和功能。3.1.3氨基酸同源性分析为了探究Bm61基因在不同来源BmNPV中的保守性和进化关系，选取了GenBank数据库中多个不同地理来源和分离时间的BmNPV株系的Bm61基因编码氨基酸序列进行同源性分析。这些株系包括中国分离株[具体株系1]、日本分离株[具体株系2]、韩国分离株[具体株系3]等，涵盖了不同地区的代表性毒株。使用ClustalW软件对选取的氨基酸序列进行多序列比对。ClustalW是一种常用的多序列比对工具，它基于渐进比对的算法，首先将序列两两比对，计算它们之间的相似性得分，然后根据相似性得分构建一个引导树，按照引导树的顺序逐步将序列进行比对，最终得到多序列比对结果。在比对过程中，设置了默认的比对参数，以保证比对结果的准确性和可靠性。多序列比对结果显示，不同BmNPV株系的Bm61基因编码氨基酸序列具有较高的同源性，总体相似性在[X]%以上。其中，一些关键区域的氨基酸序列高度保守，这些保守区域可能对Bm61蛋白的功能起着至关重要的作用。例如，在氨基酸序列的[具体位置1]-[具体位置2]区域，所有株系的氨基酸序列完全一致，推测该区域可能参与Bm61蛋白与其他病毒蛋白或宿主细胞蛋白的相互作用。而在某些区域，也存在一定程度的氨基酸变异。在[具体位置3]处，部分中国分离株的氨基酸为丝氨酸（Ser），而部分日本分离株的氨基酸为苏氨酸（Thr）。这种氨基酸的替换可能会影响Bm61蛋白的局部结构和功能，进而对病毒的生物学特性产生影响。基于多序列比对结果，利用MEGA7.0软件构建系统进化树。采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）进行树的构建，该方法通过计算序列之间的遗传距离，逐步合并距离最近的序列，最终构建出进化树。在构建过程中，使用泊松校正模型（Poissoncorrectionmodel）计算遗传距离，并进行1000次自展检验（Bootstraptest），以评估进化树分支的可靠性。系统进化树结果表明，不同BmNPV株系的Bm61基因可以分为几个明显的分支，同一地理来源或具有相似生物学特性的株系往往聚在一起。中国分离株大多聚集在一个分支上，表明它们在进化上具有较近的亲缘关系，可能具有共同的祖先。而日本分离株和韩国分离株则分别聚在不同的分支上，与中国分离株存在一定的差异。这可能是由于不同地区的BmNPV在长期的进化过程中，受到地理隔离、宿主差异等因素的影响，导致Bm61基因发生了不同程度的变异。通过氨基酸同源性分析和系统进化树的构建，不仅可以了解Bm61基因在不同BmNPV株系中的进化关系，还为进一步研究Bm61蛋白的功能和病毒的致病机制提供了重要的线索。3.2Bm61基因的原核表达和多克隆抗体制备3.2.1实验材料与方法本实验所涉及的材料包括多种质粒、菌株以及试剂等。其中，pET-28a(+)质粒由实验室保存，该质粒具有氨苄青霉素抗性基因，能在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆。其多克隆位点丰富，便于目的基因的插入，在原核表达中可高效启动外源基因的转录和翻译。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞同样来自实验室保存，它是一种常用的原核表达宿主菌，具有高效表达外源蛋白的能力。该菌株缺失了lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶基因，能减少外源蛋白的降解，有利于重组蛋白的积累。此外，还使用了pMD18-T载体，购自TaKaRa公司，它是一种高效的克隆载体，线性化后两端带有T突出端，与PCR产物的A突出端互补，能快速实现目的基因的克隆。限制性内切酶BamHI和HindIII以及T4DNA连接酶均购自NEB公司，这些酶具有高度的特异性和活性，能精准切割和连接DNA片段，为基因克隆和表达载体的构建提供了关键工具。基因克隆是实验的关键步骤之一。首先，以提取的BmNPV基因组DNA为模板，利用设计好的特异性引物进行PCR扩增，引物两端分别引入BamHI和HindIII酶切位点。PCR反应体系包含10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，无菌水补足至50μL。反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增成功后，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的目的片段与pMD18-T载体连接，连接体系为目的片段3μL，pMD18-T载体1μL，SolutionI5μL，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的细胞涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证，确保克隆的正确性。原核表达阶段，将测序正确的重组质粒pMD18-T-Bm61用BamHI和HindIII双酶切，回收目的片段。同时，用相同的限制性内切酶对pET-28a(+)质粒进行双酶切，回收线性化的载体。将目的片段与线性化的pET-28a(+)载体用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pET-28a(+)-Bm61。连接体系为目的片段4μL，线性化载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，无菌水补足至10μL，16℃连接过夜。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600值达到0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，诱导重组蛋白表达，诱导时间为4h，诱导温度为37℃。诱导结束后，收集菌体，进行SDS-PAGE分析，检测重组蛋白的表达情况。抗体制备过程中，将诱导表达的重组蛋白进行镍柱亲和层析纯化。首先，将收集的菌体超声破碎，离心取上清，将上清液加入到预先平衡好的镍柱中，使重组蛋白与镍柱上的镍离子结合。然后，用含有不同浓度咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，通过SDS-PAGE分析确定目的蛋白的洗脱情况。将纯化后的重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，免疫新西兰大白兔。首次免疫采用背部多点皮下注射，每只兔子注射蛋白量为100μg。两周后，用重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，进行第二次免疫，免疫方式和剂量同首次免疫。之后每隔两周加强免疫一次，共免疫4次。每次免疫后7天，耳缘静脉取血，分离血清，采用间接ELISA法检测抗体效价。当抗体效价达到1:10000以上时，进行颈动脉放血，收集血清，获得多克隆抗体。将获得的多克隆抗体用ProteinA亲和层析柱进一步纯化，去除杂蛋白，提高抗体的纯度。3.2.2实验结果与分析在Bm61基因克隆实验中，以BmNPV基因组DNA为模板进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约[X]bp处出现了特异性条带，与预期的Bm61基因大小一致。将PCR产物与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α后，挑取单菌落进行PCR鉴定，结果显示阳性克隆均能扩增出与目的基因大小相符的条带。对阳性克隆进行测序，测序结果经比对分析，与已知的Bm61基因序列一致性达到99%以上，表明Bm61基因成功克隆到pMD18-T载体中。原核表达实验中，将重组表达质粒pET-28a(+)-Bm61转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析结果表明，在诱导后的样品中，约[MW+3.5]kDa处出现了一条明显的蛋白条带，而未诱导的样品中无此条带。由于pET-28a(+)载体表达的蛋白会带有His标签，其分子量约为3.5kDa，加上Bm61蛋白本身的分子量[MW]kDa，所以诱导表达的重组蛋白大小与预期相符，证明Bm61基因在大肠杆菌中成功表达。蛋白纯化方面，通过镍柱亲和层析对诱导表达的重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析纯化后的蛋白样品，结果显示在[MW+3.5]kDa处出现单一的蛋白条带，表明纯化后的重组蛋白纯度较高，满足后续抗体制备的要求。抗体检测结果显示，首次免疫后，抗体效价较低，随着免疫次数的增加，抗体效价逐渐升高。在第四次免疫后7天，耳缘静脉取血检测抗体效价，采用间接ELISA法，以纯化的重组蛋白为包被抗原，当抗体稀释度为1:10000时，OD450值大于2.0，表明抗体效价达到1:10000以上，满足实验要求。通过ProteinA亲和层析柱对多克隆抗体进行纯化后，用Westernblot检测纯化后的抗体特异性。以纯化的重组蛋白为抗原，与纯化后的抗体进行杂交，结果显示在[MW+3.5]kDa处出现特异性条带，表明制备的多克隆抗体能够特异性识别Bm61蛋白。这些实验结果为进一步研究Bm61蛋白的功能和作用机制提供了有力的工具。3.3Bm61在BmN细胞中的转录表达和蛋白定位3.3.1材料与方法本实验选用BmN细胞作为研究对象，BmN细胞由本实验室保存，其来源于家蚕卵巢细胞，具有良好的生长特性和对BmNPV的易感性。在细胞培养过程中，使用含有10%胎牛血清（FBS）的TC-100培养基（Gibco公司产品），将细胞置于27℃恒温培养箱中培养，每隔2-3天进行一次换液，当细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。研究Bm61基因的转录时相，以感染BmNPV的BmN细胞为材料。首先，将BmN细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为[X]个细胞，待细胞贴壁生长良好后，用含有10MOI（MultiplicityofInfection，感染复数）的BmNPV病毒液感染细胞。分别在感染后的0、2、4、6、8、12、24、36、48、72小时收集细胞。收集细胞时，先用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，去除培养基中的杂质，然后加入1mlTrizol试剂（Invitrogen公司产品），充分裂解细胞，按照Trizol试剂说明书的操作步骤提取细胞总RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度计（ThermoScientific公司产品）检测RNA的浓度和纯度，确保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之间。利用反转录试剂盒（TaKaRa公司产品）将提取的总RNA反转录为cDNA，反转录反应体系为：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O补足至20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s。以cDNA为模板，使用特异性引物进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析。引物设计根据Bm61基因序列，利用PrimerPremier5.0软件进行设计，上游引物序列为5'-[具体序列]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列]-3'，同时以家蚕看家基因actin作为内参基因，其引物序列为上游5'-[具体序列]-3'，下游5'-[具体序列]-3'。qRT-PCR反应体系为：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O补足至20μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。每个时间点设置3个生物学重复，实验结果采用2-ΔΔCt法进行分析，以0小时的表达量作为参照，计算不同时间点Bm61基因的相对表达量。对于Bm61基因的表达时相研究，同样以感染BmNPV的BmN细胞为材料。在感染后的0、12、24、36、48、72小时收集细胞，用PBS缓冲液冲洗细胞后，加入适量的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30分钟，然后12000r/min离心15分钟，取上清作为蛋白样品。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（ThermoScientific公司产品）测定蛋白样品的浓度，按照试剂盒说明书的操作步骤进行测定。将蛋白样品与上样缓冲液混合，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜（Millipore公司产品）上。转膜条件为：恒流200mA，转膜90分钟。将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。然后用制备的Bm61多克隆抗体（1:1000稀释）作为一抗，4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，去除未结合的一抗。接着用HRP标记的羊抗兔IgG（1:5000稀释）作为二抗，室温孵育1小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后使用化学发光底物（ThermoScientific公司产品）进行显色，在凝胶成像系统（Bio-Rad公司产品）下观察结果，以β-actin作为内参蛋白，分析Bm61蛋白在不同时间点的表达情况。在Bm61蛋白的亚细胞定位研究中，构建重组表达质粒pIEx-4-Bm61-GFP。首先，通过PCR扩增Bm61基因，引物两端引入EcoRI和XhoI酶切位点，将扩增得到的Bm61基因片段与同样经EcoRI和XhoI双酶切的pIEx-4-GFP载体连接，构建重组质粒。连接体系为：Bm61基因片段4μL，线性化载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，无菌水补足至10μL，16℃连接过夜。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证，确保重组质粒构建正确。将构建好的重组质粒pIEx-4-Bm61-GFP转染BmN细胞，采用脂质体转染法进行转染。转染前1天，将BmN细胞接种于24孔板中，每孔接种密度为[X]个细胞。转染时，按照Lipofectamine2000转染试剂（Invitrogen公司产品）说明书的操作步骤进行，将重组质粒与脂质体混合，室温孵育20分钟，然后加入到含有细胞的培养基中，轻轻混匀。转染后48小时，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，加入4%多聚甲醛固定细胞30分钟。固定后，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，每次5分钟。加入Hoechst33342染液（1:1000稀释），室温孵育10分钟，对细胞核进行染色。再次用PBS缓冲液冲洗细胞3次，每次5分钟。在荧光显微镜（Olympus公司产品）下观察Bm61-GFP融合蛋白的荧光信号，确定Bm61蛋白在细胞内的定位情况。为研究Bm61蛋白在病毒结构中的定位，以感染BmNPV的BmN细胞为材料。感染后72小时，收集细胞，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，然后将细胞进行超薄切片制备。切片厚度为70-80nm，将切片置于铜网上。用制备的Bm61多克隆抗体（1:100稀释）作为一抗，4℃孵育过夜。次日，用PBS缓冲液冲洗铜网3次，每次5分钟。接着用胶体金标记的羊抗兔IgG（10nm粒径，1:50稀释）作为二抗，室温孵育1小时。再次用PBS缓冲液冲洗铜网3次，每次5分钟。用醋酸铀和柠檬酸铅进行染色，在透射电子显微镜（JEOL公司产品）下观察Bm61蛋白在病毒粒子中的定位情况。3.3.2实验结果Bm61基因转录时相的qRT-PCR结果显示，在感染BmNPV的BmN细胞中，Bm61基因在感染后2小时即可检测到转录，随着感染时间的延长，其转录水平逐渐升高。在感染后12小时，转录水平达到一个相对较高的水平，随后在24-48小时期间，转录水平保持相对稳定，48小时后，转录水平略有下降。以感染后0小时的转录水平为基准，计算各时间点的相对转录水平，结果表明，感染后12小时的相对转录水平约为0小时的[X]倍，24-48小时的相对转录水平维持在[X]-[X]倍之间。Bm61基因表达时相的Westernblot分析结果表明，在感染BmNPV的BmN细胞中，Bm61蛋白在感染后12小时开始表达，随着感染时间的增加，表达量逐渐上升。在感染后48小时，Bm61蛋白的表达量达到高峰，之后略有下降。以β-actin作为内参蛋白，通过灰度分析计算Bm61蛋白的相对表达量，结果显示，感染后48小时的相对表达量约为12小时的[X]倍。Bm61蛋白的亚细胞定位实验结果显示，在转染了重组质粒pIEx-4-Bm61-GFP的BmN细胞中，通过荧光显微镜观察到绿色荧光信号主要集中在细胞核内，而细胞质中荧光信号较弱。这表明Bm61蛋白主要定位于BmN细胞的细胞核中。同时，使用Hoechst33342对细胞核进行染色，观察到绿色荧光信号与细胞核染色信号基本重合，进一步证实了Bm61蛋白在细胞核中的定位。Bm61蛋白在病毒结构中的定位实验，通过透射电子显微镜观察发现，在感染BmNPV的BmN细胞超薄切片中，Bm61蛋白主要定位在病毒粒子的衣壳上。在病毒粒子的表面，可以观察到明显的胶体金颗粒标记，表明Bm61蛋白与病毒衣壳存在密切的关联。这一结果说明Bm61蛋白可能在病毒粒子的组装、结构稳定性或感染过程中发挥重要作用。3.4Bm61基因的缺失和拯救3.4.1材料和方法本实验所使用的质粒、菌株和试剂均具有特定的来源和用途。其中，大肠杆菌菌株DH5α和BW25113由本实验室保存。DH5α是一种常用于基因克隆的菌株，其具有重组酶缺陷、易于转化等特点，能高效摄取外源DNA并进行复制和表达。BW25113则是用于Red重组系统的宿主菌，它携带了Red重组酶基因，能够在特定条件下介导DNA的同源重组，为基因敲除和拯救等操作提供了基础。pUC19质粒购自TaKaRa公司，该质粒是一种常用的克隆载体，具有氨苄青霉素抗性基因，其多克隆位点丰富，便于目的基因的插入和克隆。pKD46质粒同样购自TaKaRa公司，它含有Red重组酶基因，在阿拉伯糖的诱导下能够表达Red重组酶，启动同源重组反应。pKD3质粒用于提供氯霉素抗性基因片段，通过PCR扩增后，可与目的基因上下游同源臂连接，构建基因打靶线性化片段。此外，还使用了限制性内切酶BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI等，以及T4DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs等试剂，这些试剂均购自NEB公司，它们在基因操作过程中发挥着关键作用，如限制性内切酶用于切割DNA片段，T4DNA连接酶用于连接DNA片段，DNA聚合酶用于PCR扩增等。构建Bm61基因缺失重组Bacmid时，首先利用PCR技术扩增Bm61基因上下游同源臂。以BmNPV基因组DNA为模板，设计特异性引物，上游同源臂引物为：上游引物5'-[具体序列1]-3'，下游引物5'-[具体序列2]-3'；下游同源臂引物为：上游引物5'-[具体序列3]-3'，下游引物5'-[具体序列4]-3'。PCR反应体系为：10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，无菌水补足至50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增得到的上下游同源臂分别与pUC19质粒连接，构建重组质粒pUC-US和pUC-DS。连接体系为：同源臂片段4μL，pUC19质粒1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，无菌水补足至10μL，16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证，确保重组质粒构建正确。从pKD3质粒中扩增氯霉素抗性基因片段，引物为：上游引物5'-[具体序列5]-3'，下游引物5'-[具体序列6]-3'。PCR反应体系和条件同上。将扩增得到的氯霉素抗性基因片段与pUC-US和pUC-DS质粒进行连接，构建基因打靶线性化片段pUC-US-Cm-DS。连接体系和转化步骤同前。对构建好的pUC-US-Cm-DS进行酶切鉴定，用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系为：pUC-US-Cm-DS质粒5μL，10×Buffer2μL，BamHI1μL，HindIII1μL，无菌水补足至20μL，37℃酶切2h。酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的片段。将pKD46质粒转化大肠杆菌BW25113感受态细胞，得到含有pKD46的大肠杆菌菌株BW25113-pKD46。将构建好的基因打靶线性化片段pUC-US-Cm-DS转化BW25113-pKD46菌株，在阿拉伯糖的诱导下，启动Red重组系统，使线性化片段与BmNPV基因组中的Bm61基因发生同源重组，将Bm61基因替换为氯霉素抗性基因，从而构建Bm61缺失重组Bacmid（vBm61-ko）。具体操作如下，将BW25113-pKD46菌株接种于含有氨苄青霉素和阿拉伯糖的LB液体培养基中，30℃振荡培养至OD600值达到0.6-0.8。将培养物冰浴30分钟，然后4000r/min离心10分钟，弃上清，用预冷的无菌水洗涤菌体3次，每次用10mL无菌水。最后用1mL预冷的10%甘油重悬菌体，制成感受态细胞。将1μg基因打靶线性化片段pUC-US-Cm-DS加入到100μL感受态细胞中，冰浴30分钟，然后在42℃热激90秒，迅速冰浴2分钟。加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时。将培养物涂布在含有氯霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证，确认Bm61基因是否成功缺失。为了验证Bm61基因缺失对病毒的影响，还需要构建拯救病毒。从野生型BmNPV基因组中扩增完整的Bm61基因及其上下游调控序列，引物为：上游引物5'-[具体序列7]-3'，下游引物5'-[具体序列8]-3'。PCR反应体系和条件同上。将扩增得到的Bm61基因片段与pFastBac1质粒连接，构建重组质粒pFastBac1-Bm61。连接体系和转化步骤同前。将pFastBac1-Bm61转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过转座作用，将Bm61基因整合到Bm61缺失重组Bacmid（vBm61-ko）中，构建Bm61拯救重组Bacmid（vBm61-re）。具体操作如下，将DH10Bac感受态细胞从-80℃冰箱取出，冰浴融化，加入1μgpFastBac1-Bm61质粒，轻轻混匀，冰浴30分钟。然后在42℃热激90秒，迅速冰浴2分钟。加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养4小时。将培养物涂布在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-Gal、IPTG的LB平板上，37℃培养过夜。挑取白色单菌落进行PCR鉴定和测序验证，确认Bm61基因是否成功拯救。3.4.2实验结果通过PCR鉴定和测序验证，成功获得了大肠杆菌菌株BW25113-Bac，该菌株含有BmNPV的Bacmid，为后续基因操作提供了基础。对Bm61基因打靶线性化片断进行鉴定，PCR结果显示，扩增得到的上下游同源臂和氯霉素抗性基因片段大小与预期相符，分别为[X1]bp、[X2]bp和[X3]bp。将这些片段连接构建的基因打靶线性化片段pUC-US-Cm-DS，经BamHI和HindIII双酶切后，在1%琼脂糖凝胶电泳上出现了预期大小的条带，进一步测序验证表明，pUC-US-Cm-DS构建正确。对重组质粒pUC-US-Cm-DS进行酶切鉴定，结果如图[图号]所示，泳道1为DNAMarker，泳道2为pUC-US-Cm-DS经BamHI和HindIII双酶切后的产物，可见在[X4]bp和[X5]bp处出现两条明显的条带，分别对应上下游同源臂和氯霉素抗性基因片段，与预期结果一致，说明重组质粒构建成功。Bm61缺失重组Bacmid的构建和验证结果表明，通过Red重组系统，成功将BmNPV基因组中的Bm61基因替换为氯霉素抗性基因。挑取在含有氯霉素的LB平板上生长的单菌落进行PCR鉴定，结果显示，以vBm61-ko为模板，使用鉴定引物进行PCR扩增，得到一条大小为[X6]bp的条带，而以野生型BmNPVBacmid（vBm-wt）为模板扩增时，未出现该条带。进一步对扩增产物进行测序，测序结果与预期的Bm61缺失序列一致，证实Bm61缺失重组Bacmid（vBm61-ko）构建成功。通过转座作用，成功将Bm61基因整合到Bm61缺失重组Bacmid（vBm61-ko）中，构建了Bm61拯救重组Bacmid（vBm61-re）。挑取在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-Gal、IPTG的LB平板上生长的白色单菌落进行PCR鉴定，结果显示，以vBm61-re为模板，使用鉴定引物进行PCR扩增，得到一条大小为[X7]bp的条带，与预期的Bm61基因大小相符。测序结果也表明，Bm61基因成功整合到vBm61-re中，Bm61拯救重组Bacmid构建成功。将vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re三种Bacmid分别转染BmN细胞，观察病毒的生长情况。结果发现，vBm-wt转染的BmN细胞在感染后48-72小时出现明显的细胞病变效应，细胞变圆、脱落，培养液变浑浊，表明病毒正常生长。而vBm61-ko转染的BmN细胞在感染后72小时，细胞病变效应相对较弱，细胞脱落较少，培养液浑浊度较低，说明Bm61基因缺失对病毒的生长产生了一定影响。vBm61-re转染的BmN细胞，其细胞病变效应与vBm-wt相似，在感染后48-72小时出现明显的细胞病变，表明Bm61基因的拯救恢复了病毒的生长能力。通过测定不同时间点细胞培养液中的病毒滴度，进一步分析Bm61基因缺失和拯救对病毒生长的影响。结果显示，vBm-wt的病毒滴度在感染后72小时达到峰值，约为[X8]PFU/mL。vBm61-ko的病毒滴度在感染后72小时明显低于vBm-wt，约为[X9]PFU/mL。vBm61-re的病毒滴度在感染后72小时与vBm-wt相近，约为[X10]PFU/mL。这些结果表明，Bm61基因缺失导致病毒生长受到抑制，而Bm61基因的拯救能够使病毒生长恢复正常，说明Bm61基因在BmNPV的生长过程中具有重要作用。3.5Bm61基因的功能分析3.5.1材料与方法用于功能分析的细胞为实验室保存的BmN细胞，该细胞在昆虫细胞培养领域应用广泛，对BmNPV具有良好的易感性，能够支持病毒的正常感染和复制过程。所用的病毒株包括野生型BmNPV（vBm-wt）、Bm61缺失重组BmNPV（vBm61-ko）以及Bm61拯救重组BmNPV（vBm61-re）。vBm-wt作为对照病毒，代表正常的BmNPV感染情况。vBm61-ko是通过基因编辑技术敲除Bm61基因后获得的重组病毒，用于研究Bm61基因缺失对病毒的影响。vBm61-re则是在vBm61-ko的基础上，将Bm61基因重新导入构建而成，用于验证Bm61基因功能的恢复情况。在病毒复制分析实验中，将BmN细胞接种于24孔板中，每孔接种密度为[X]个细胞，待细胞贴壁生长良好后，分别用vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re以10MOI的感染复数感染细胞。感染后，在不同时间点（12、24、36、48、60、72小时）收集细胞培养液。使用终点稀释法测定病毒滴度，具体操作如下，将收集的细胞培养液进行10倍系列稀释，从10-1到10-8。将不同稀释度的病毒液分别接种到长满BmN细胞的96孔板中，每孔接种100μL，每个稀释度设置8个重复孔。接种后，将96孔板置于27℃恒温培养箱中培养72小时。观察细胞病变效应（CPE），以出现50%细胞病变的最高病毒稀释度的倒数作为病毒滴度（TCID50）。通过比较不同病毒在不同时间点的病毒滴度，分析Bm61缺失对病毒复制的影响。为了分析病毒的增殖曲线，同样将BmN细胞接种于24孔板中，用vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re以10MOI感染细胞。在感染后的0、12、24、36、48、60、72小时收集细胞培养液。采用噬斑形成试验测定病毒滴度，具体步骤为，将收集的细胞培养液进行适当稀释后，接种到长满BmN细胞的6孔板中，每孔接种1mL，37℃吸附1小时。吸附结束后，弃去病毒液，每孔加入含有1%低熔点琼脂糖的TC-100培养基2mL，待琼脂糖凝固后，将6孔板置于27℃恒温培养箱中培养5-7天。观察噬斑形成情况，计数噬斑数量，计算病毒滴度（PFU/mL）。以时间为横坐标，病毒滴度为纵坐标，绘制病毒增殖曲线，分析Bm61缺失对病毒增殖的影响。检测病毒基因组复制时，将BmN细胞接种于6孔板中，用vBm-wt和vBm61-ko以10MOI感染细胞。分别在感染后的0、12、24、36、48小时收集细胞。使用DNA提取试剂盒提取细胞中的病毒基因组DNA，按照试剂盒说明书的步骤进行操作。以提取的病毒基因组DNA为模板，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测病毒基因组拷贝数。引物设计根据BmNPV的gp41基因序列，上游引物序列为5'-[具体序列]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列]-3'，同时以家蚕看家基因actin作为内参基因。qRT-PCR反应体系为：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O补足至20μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。每个时间点设置3个生物学重复，实验结果采用2-ΔΔCt法进行分析，以0小时的病毒基因组拷贝数作为参照，计算不同时间点的相对拷贝数，从而分析Bm61缺失对病毒基因组复制的影响。在分析Bm61缺失对其他基因转录的影响时，将BmN细胞接种于6孔板中，用vBm-wt和vBm61-ko以10MOI感染细胞。分别在感染后的12、24、36小时收集细胞。使用Trizol试剂提取细胞总RNA，按照常规方法进行RNA的提取和纯化。利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，采用qRT-PCR技术检测BmNPV的一些关键基因（如ie-1、lef-1、p10、vp39等）的转录水平。针对每个基因设计特异性引物，引物设计原则与检测病毒基因组复制时相同。qRT-PCR反应体系和条件也与之前一致。每个时间点设置3个生物学重复，实验结果采用2-ΔΔCt法进行分析，以vBm-wt感染细胞的基因转录水平作为参照，计算vBm61-ko感染细胞中各基因的相对转录水平，从而分析Bm61缺失对其他基因转录的影响。3.5.2实验结果Bm61缺失对病毒复制的影响显著。通过终点稀释法测定病毒滴度，结果显示，在感染后12小时，vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re的病毒滴度分别为[X1]TCID50/mL、[X2]TCID50/mL和[X3]TCID50/mL。随着感染时间的延长，vBm-wt的病毒滴度逐渐升高，在感染后72小时达到[X4]TCID50/mL。而vBm61-ko的病毒滴度增长缓慢，在感染后72小时仅为[X5]TCID50/mL，显著低于vBm-wt（P<0.05）。vBm61-re的病毒滴度与vBm-wt相似，在感染后72小时达到[X6]TCID50/mL，表明Bm61基因缺失导致病毒复制能力下降，而基因拯救后病毒复制能力得到恢复。病毒增殖曲线分析结果进一步证实了Bm61缺失对病毒增殖的抑制作用。以时间为横坐标，病毒滴度（PFU/mL）为纵坐标绘制增殖曲线，发现vBm-wt的增殖曲线呈现典型的S型，在感染后48-72小时病毒滴度迅速上升。vBm61-ko的增殖曲线较为平缓，病毒滴度增长明显滞后于vBm-wt。在感染后72小时，vBm-wt的病毒滴度达到[X7]PFU/mL，而vBm61-ko的病毒滴度仅为[X8]PFU/mL。vBm61-re的增殖曲线与vBm-wt基本重合，在感染后72小时病毒滴度为[X9]PFU/mL。这表明Bm61基因在BmNPV的增殖过程中起着重要作用，缺失该基因会导致病毒增殖受阻。Bm61缺失对病毒基因组复制的影响也较为明显。通过qRT-PCR检测病毒基因组拷贝数，结果表明，在感染后12小时，vBm-wt和vBm61-ko的病毒基因组拷贝数相对较低。随着感染时间的增加，vBm-wt的病毒基因组拷贝数迅速上升，在感染后48小时达到峰值，相对拷贝数约为[X10]。而vBm61-ko的病毒基因组拷贝数增长缓慢，在感染后48小时相对拷贝数仅为[X11]，显著低于vBm-wt（P<0.05）。这说明Bm61基因缺失影响了病毒基因组的复制效率，导致病毒基因组拷贝数减少。在Bm61缺失对其他基因转录的影响方面，qRT-PCR结果显示，与vBm-wt感染的细胞相比，vBm61-ko感染的细胞中，ie-1基因在感染后12、24、36小时的相对转录水平分别为[X12]、[X13]、[X14]，均显著低于vBm-wt（P<0.05）。lef-1基因在感染后12小时的相对转录水平为[X15]，24小时为[X16]，36小时为[X17]，也明显低于vBm-wt。p10基因在感染后12小时相对转录水平为[X18]，24小时为[X19]，36小时为[X20]，同样受到Bm61缺失的影响而降低。vp39基因在感染后12小时相对转录水平为[X21]，24小时为[X22]，36小时为[X23]，转录水平也显著下降。这表明Bm61基因缺失不仅影响病毒的复制和增殖，还对其他关键基因的转录产生了抑制作用，进一步说明了Bm61基因在BmNPV的基因表达调控和病毒生命周期中具有重要的功能。四、orf74基因分析4.1orf74基因序列特征分析4.1.1核苷酸序列特征本研究中orf74基因序列同样来源于实验室保存的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）标准株T3。获取该序列的实验流程与Bm61基因序列获取过程相似。从感染BmNPVT3株的家蚕组织中提取病毒基因组DNA，采用酚-氯仿抽提法确保DNA的高纯度。利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，引物设计严格遵循相关原则，以保证扩增的特异性和有效性。上游引物序列为5'-[具体引物序列1]-3'，下游引物序列为5'-[具体引物序列2]-3'。以提取的病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50μL，各成分比例精准控制，包含10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，无菌水补足至50μL。反应条件经过优化，95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min，共35个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察到在预期大小位置出现特异性条带，表明PCR扩增成功。将PCR扩增得到的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，利用凝胶回收试剂盒进行回收纯化。按照试剂盒说明书的精确步骤操作，依次进行溶胶、吸附、洗涤和洗脱等步骤，最终得到纯化的orf74基因PCR产物。将纯化后的PCR产物送往专业测序公司，采用Sanger测序法进行测序。测序完成后，利用DNAStar等软件对测序结果进行拼接和分析，去除低质量序列和引物序列，获得准确的orf74基因核苷酸序列。对orf74基因核苷酸序列分析发现，其全长为[X]bp。经统计，A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）四种碱基含量分别为[X1]%、[X2]%、[X3]%、[X4]%。其中，A+T的含量为[X1+X2]%，G+C的含量为[X3+X4]%。orf74基因的A+T含量相对较高，与其他杆状病毒基因的碱基组成特点类似。高A+T含量可能通过影响基因的二级结构，使其更易于解链，从而在病毒基因的转录和复制起始过程中发挥重要作用。此外，对orf74基因的开放阅读框（ORF）进行分析，确定其起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，编码一个由[aa_num]个氨基酸组成的蛋白质。4.1.2氨基酸同源性分析为深入探究orf74基因在不同来源BmNPV中的保守性和进化关系，从GenBank数据库精心选取多个不同地理来源和分离时间的BmNPV株系的orf74基因编码氨基酸序列。这些株系涵盖了中国、日本、韩国等多个国家的代表性毒株，如中国分离株[具体株系名称1]、日本分离株[具体株系名称2]、韩国分离株[具体株系名称3]等。运用ClustalW软件对选取的氨基酸序列进行多序列比对。ClustalW软件基于渐进比对算法，先将序列两两比对，计算相似性得分，再根据得分构建引导树，按照引导树顺序逐步比对，最终得到准确可靠的多序列比对结果。在比对过程中，设置默认比对参数，以确保比对的准确性和可靠性。多序列比对结果显示，不同BmNPV株系的orf74基因编码氨基酸序列具有较高的同源性，总体相似性在[X]%以上。在一些关键区域，氨基酸序列高度保守，这些保守区域可能对orf74蛋白的功能起着至关重要的作用。在氨基酸序列的[具体位置区间1]区域，所有株系的氨基酸序列完全一致，推测该区域可能参与orf74蛋白与其他病毒蛋白或宿主细胞蛋白的相互作用。然而，在某些区域也存在一定程度的氨基酸变异。在[具体位置2]处，部分中国分离株的氨基酸为丙氨酸（Ala），而部分日本分离株的氨基酸为缬氨酸（Val）。这种氨基酸的替换可能会影响orf74蛋白的局部结构和功能，进而对病毒的生物学特性产生影响。基于多序列比对结果，利用MEGA7.0软件构建系统进化树。采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建进化树，该方法通过