CN115141892B 一种大麻哈鱼放流效果的评估方法 （吉林省水产科学研究院(吉林省渔业生态环境及水产品质量监督检测中心)）

(12)发明专利1195号限公司37201陈蝉娟李冠颖本发明公开了一种大麻哈鱼放流效果的评最大似然值法对放流大麻哈鱼和洄游大麻哈鱼21.一种大麻哈鱼放流效果的评估方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)采集大麻哈鱼样本：包括放流大麻哈鱼和洄游大麻哈鱼样本；(2)筛选出15个微卫星标记位点；(3)提取放流和洄游大麻哈鱼样本的DNA,利用15对微卫星标记位点的引物对DNA进行(3)洄游来源归属判定：以最大似然值法对放流大麻哈鱼和洄游大麻哈鱼基因型进行比对，将基因型完全匹配的洄游个体判定为放流的大麻哈鱼；(4)放流效果评估：对鉴定为放流的大麻哈鱼做好标记，计算其占回捕大麻哈鱼的比例，即增殖放流回捕率=标记个体数/回捕总个数；所述15对微卫星标记位点的引物序列如微卫星位点引物序列12345678AGGGAAGATAAGTGGTTCC92.如权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述步骤(1)中采集大麻哈鱼鱼鳞或鱼3.如权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述步骤(3)中，确定微卫星位点基因分型具体为：对引物进行荧光标记，合成带FAM荧光标记的引物对，对样品进行毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测；将PCR产物置于全自动基因测序仪上进行SSR多态性分析，再通过检测荧光标记，所得数据被自动收集，利用分析软件自动统计分析数据，得出等位基因片段和峰高峰面积，然后再计算出等位基因频率、观测杂合度、期待杂合度、多态信息含量的相关遗传学参数，最终确定微卫星位点基因分型。3技术领域[0001]本发明属于水产养殖和分子生物学技术领域，具体地说，尤其涉及一种大麻哈鱼放流效果的评估方法。背景技术[0002]大麻哈鱼是典型的溯河洄游性经济鱼类，在我国分布于黑龙江省和吉林省图们江[0003]我国为增加大麻哈鱼野生资源量，每年向图们江支流珲春河、密江河放流40-50万尾鱼苗，为明确大麻哈鱼归属问题，证明我国的鱼源国地位，迫切需要一种有效方法来明确大麻哈鱼洄游来源。[0004]目前我国尚未有对大麻哈鱼增殖放流效果评估的方法，传统标记方法无法准确判断其归属。随着分子生物学的不断发展，基于DNA序列的微卫星标记因其多态性信息丰富，多态信息含量丰富，符合孟德尔遗传规律，便于检测等优点，是检测洄游大麻哈鱼种群归属[0005]但是，现有技术中针对大马哈鱼结合分子生物学方法的溯源技术研究目前并不成发明内容[0006]本发明的目的是提供一种大麻哈鱼放流效果的评估方法，以弥补现有技术的不[0007]为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：[0008]一种大麻哈鱼放流效果的评估方法，该方法包括以下步骤：[0009](1)采集大麻哈鱼样本：包括放流大麻哈鱼和洄游大麻哈鱼样本；[0010](2)筛选微卫星标记位点；[0011](3)提取放流和洄游大麻哈鱼样本的DNA,确定微卫星位点基因分型；[0012](3)洄游来源归属判定：以最大似然值法对放流大麻哈鱼和洄游大麻哈鱼基因型进行比对，将基因型完全匹配的洄游个体判定为放流的大麻哈鱼；[0013](4)放流效果评估：对鉴定为放流的大麻哈鱼做好标记，计算其占回捕大麻哈鱼的比例，即增殖放流回捕率=标记个体数/回捕总个数。[0014]进一步的，所述步骤(1)中，每年10-11月，在吉林省珲春市图们江河口采集洄游大麻哈鱼；用消毒剪子或镊子采集大麻哈鱼鱼鳞或鱼鳍组织；组织样品放置于95%乙醇溶液4微卫星位点引物序列123456789对引物进行荧光标记，合成带FAM荧光标记的引物对，对样品进行毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测；将PCR产物置于全自动基因测序仪上进行SSR多态性分析，该系统采用荧光标记、毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测技术；[0019]通过检测荧光标记，所得数据被自动收集，利用分析软件自动统计分析数据，得出等位基因片段和峰高峰面积，然后再计算出等位基因频率(F)、观测杂合度(HO)、期待杂合度(HE)、多态信息含量(PIC)等相关遗传学参数，最终确定微卫星位点基因分型。[0021]为解决一直以来无法识别洄游大麻哈鱼的来源问题，本发明利用微卫星标记新方法能够推算洄游大麻哈鱼种群中人工放流的个体占比数，进而明确了洄游大麻哈鱼归属地，为证明鱼源国提供了有力证据；同时有利于促进大麻哈鱼种质资源保护和可持续发展，提高养殖企业和渔民经济效益和养殖热情。5[0022]经实际验证，本发明能够准确追溯大麻哈鱼洄游来源，为大麻哈鱼增殖放流效果评估提供了绿色新方法。通过此发明填补了大麻哈鱼增殖放流效果评估方面的空白。附图说明[0023]图1为大麻哈鱼微卫星位点基因分型结果的示例图一。[0024]图2为大麻哈鱼微卫星位点基因分型结果的示例图二。具体实施方式[0025]下面结合实施例对本发明所述的技术方案作进一步地描述说明。[0026]实施例1[0027]一种大麻哈鱼放流效果的评估方法，该方法包括以下步骤：[0028]1.样品制备[0029]大麻哈鱼为溯河洄游性鱼类，10月-11月在吉林省延边州珲春市图们江河口溯河产卵。因此每年自10月开始，采集大麻哈鱼鱼鳞和鱼鳍组织，于95%乙醇溶液中，4℃保存备[0030]2.微卫星位点标记[0031]2.1DNA提取与扩增[0032]留取的大麻哈鱼组织(鱼鳞和鱼鳍)需做好预处理，用液氮研磨直至呈粉末状。大改变。95℃预变性5min。95℃变性30s,退火30s(不同微卫星位点所需的最佳退火温度不同，规程中提供的10个微卫星位点退火温度范围在56-61℃),72℃延伸10min,共进行35个循[0033]2.2微卫星位点筛选[0034]从相关文献或数据库中搜索大麻哈鱼DNA序列和EST序列获得SSR序列，进而设计引物；本实施例提供的15对微卫星引物是经过多次试验验证，能够有效确定大麻哈鱼基因[0035]当然选择其它大麻哈鱼微卫星位点，要进行微卫星标记位点评估，至少采用含50个个体的大麻哈鱼种群进行评估，评估参数包括等位基因数(NA)、观测杂合度(HO)、期待杂合度(HE)、多态信息含量(PIC)、哈-温平衡检测(HWE)等，要求所筛选的微卫星标记获得高度多态性，即多态信息含量(PIC)应大于0.5。[0036]表1筛选的15对大麻哈鱼微卫星标记6微卫星位点引物序列123456789[0038]2.3.基因型检测与分析[0039]取适量PCR产物，上样于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。扩增反应成功后，根据上述筛选结果，对引物进行荧光标记，合成带FAM荧光标记的引物对，对样品进行毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测。将PCR产物置于全自动基因测序仪上进行SSR多态性分析，该系统采用荧光标记、毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测技术将PCR产物稀释15倍，稀释的PCR产物8ul,稀释的分子量内标2ul(分子量内标4ul,用甲酰胺1ml稀释),加入96孔板中，上[0040]通过检测荧光标记，所得数据被自动收集，利用分析软件自动统计分析数据，得出等位基因片段和峰高峰面积，然后再计算出等位基因频率(F)、观测杂合度(HO)、期待杂合度(HE)、多态信息含量(PIC)等相关遗传学参数，确定微卫星位点基因分型，将数据汇总后进行整理。图1和图2所示为微卫星位点基因分型结果示例图，代表每尾大麻哈鱼样本在不同的微卫星位点下基因片段大小不同，图中能够清晰地展示出大麻哈鱼个体在不同位点的基因分型结果。7[0041]表2微卫星位点基因分型的数据汇总结果123456123456[0043]从表2中可以看出，15个微卫星位点的基因分型数据表现出高度多态性，体现较高的遗传多样性水平，证明了微卫星标记用于大麻哈鱼增殖放流效果评估方法的可行性。[0044]3.洄游来源归属判定[0045]利用Cervus3.0分析软件或其他专业分析软件，计算各个位点的等位基因数(Na)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、多态信息含量(PIC)、无效等位基因频率(Fnull)、Hardy-Weinberg平衡、非亲排除率(NEP)和累积非亲排除率(CEP)等参数。以最大似然值法对放流大麻哈鱼和洄游大麻哈鱼基因型进行比对，将基因型完全匹配的洄游个体判定为我国放流的大麻哈鱼。[0046]根据亲代和子代之间基因分型比对结果，微卫星位点无错配，LOD值大于0和95%置信区间内自信度显著的条件下，认定为亲子关系，即符合该条件的回捕样本为人工放流[0047]4.放流效果评估结果计算记录[0048]对鉴定为放流的大麻哈鱼做好标记，计算其占回捕大麻哈鱼的比例，即增殖放流回捕率=标记个体数/回捕总个数。利用此方法计算，成功计算出2014年以来，吉林省图们江大麻哈鱼种群增殖放流回捕率为1.41%。该方法可准确对吉林省洄游大麻哈鱼放流效果[004