小白菊内酯对人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞作用及机制探究

小白菊内酯对人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞作用及机制探究一、引言1.1研究背景与意义前列腺癌作为全球范围内男性泌尿系统中较为常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着男性的生命健康。近年来，随着人口老龄化进程的加速以及生活方式的转变，前列腺癌的发病率呈现出显著的上升趋势。在中国，前列腺癌的发病率也同样呈现出逐年递增的态势，已然成为危害男性健康的重要公共卫生问题。据相关统计数据显示，前列腺癌在男性恶性肿瘤发病率中的排名逐渐攀升，对患者的生活质量和寿命造成了严重影响。在前列腺癌的发展进程中，雄激素在肿瘤的生长和发展过程中扮演着至关重要的角色。早期阶段，大部分前列腺癌对雄激素具有依赖性，雄激素剥夺疗法（ADT）是一种常见且有效的治疗手段。通过降低体内雄激素水平或阻断雄激素与受体的结合，能够抑制肿瘤细胞的生长和增殖，从而在一定程度上控制病情的发展。然而，随着治疗时间的延长，相当一部分患者会逐渐发展为雄激素非依赖性前列腺癌（AIPC），也被称为激素抵抗型前列腺癌（HRPC）。一旦进入这一阶段，肿瘤细胞不再依赖雄激素进行生长，传统的雄激素剥夺疗法便失去了原有的效果，这使得前列腺癌的治疗面临着巨大的挑战。目前，针对雄激素非依赖性前列腺癌的治疗手段相对有限，且疗效不尽如人意。化疗虽然是一种常用的治疗方法，但化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成严重的损害，导致患者出现一系列严重的不良反应，如恶心、呕吐、脱发、免疫力下降等，这不仅降低了患者的生活质量，还可能影响患者对后续治疗的耐受性和依从性。放疗在局部控制肿瘤方面具有一定的作用，但也存在着对周围正常组织的辐射损伤等问题，并且对于已经发生转移的肿瘤，放疗的效果往往受到限制。免疫治疗作为一种新兴的治疗方法，虽然在某些癌症的治疗中取得了一定的突破，但在雄激素非依赖性前列腺癌的治疗中，其疗效仍有待进一步提高和验证。小白菊内酯（Parthenolide，PTL）作为一种从传统中药材小白菊中提取的倍半萜烯内酯类化合物，在近年来的研究中逐渐崭露头角。大量的研究表明，小白菊内酯具有多种生物活性，在抗肿瘤领域表现出了巨大的潜力。它不仅能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，还能抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，并且对肿瘤血管生成也具有一定的抑制作用。更为重要的是，与传统的化疗药物相比，小白菊内酯具有相对较低的细胞毒性，这为其在肿瘤治疗中的应用提供了更为广阔的前景。然而，目前关于小白菊内酯对雄激素非依赖性前列腺癌作用机制的研究仍相对较少，且大多数研究仅停留在表面，对于其具体的作用靶点和信号传导通路尚未完全明确。深入研究小白菊内酯对人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞的体外作用及其机制，不仅能够进一步揭示小白菊内酯的抗肿瘤作用机制，为其在前列腺癌治疗中的应用提供坚实的理论基础，还能够为开发新型、高效、低毒的前列腺癌治疗药物开辟新的思路和方向。这对于提高雄激素非依赖性前列腺癌的治疗效果，改善患者的预后和生活质量，具有极为重要的临床意义和社会价值。1.2国内外研究现状在肿瘤研究领域，小白菊内酯的抗肿瘤活性已成为国内外学者关注的焦点之一。国外对小白菊内酯的研究起步相对较早，早期研究主要集中在其对多种肿瘤细胞系的生长抑制作用上。有研究发现，小白菊内酯能够有效抑制乳腺癌细胞的增殖，通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，降低乳腺癌细胞的活力，并且在动物模型中也显示出了对肿瘤生长的抑制效果。在对胃癌细胞的研究中，同样证实了小白菊内酯可以通过影响细胞内的信号传导通路，抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力，展现出良好的抗肿瘤潜力。国内的研究也在近年来逐渐增多，研究方向更加多元化。除了对常见肿瘤的研究外，还涉及到一些相对少见肿瘤的探索。在肝癌的研究中，国内学者通过实验发现小白菊内酯可以调节肝癌细胞内的氧化还原平衡，诱导肝癌细胞发生凋亡，并且能够抑制肿瘤血管的生成，从而减少肿瘤的营养供应，抑制肿瘤的生长和转移。同时，在白血病等血液系统肿瘤的研究中，小白菊内酯也表现出了一定的活性，能够影响白血病细胞的分化和凋亡，为白血病的治疗提供了新的思路。然而，针对小白菊内酯对雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞的研究，目前仍处于初步阶段。国外仅有少数研究报道了小白菊内酯对前列腺癌细胞的作用，但这些研究大多仅观察了细胞增殖的变化，对于细胞凋亡、迁移、侵袭以及具体的分子机制等方面的研究还不够深入。国内在此方面的研究则更为有限，虽然有一些初步的实验表明小白菊内酯可能对Du-145细胞具有抑制作用，但缺乏系统性的研究，对于其作用的具体靶点和信号通路尚未明确，也没有深入探讨小白菊内酯与其他治疗方法联合应用的可能性。此外，在小白菊内酯的药物开发方面，由于其稳定性较差、水溶性低等问题，限制了其在临床上的应用，目前国内外对于如何优化小白菊内酯的制剂，提高其生物利用度和稳定性的研究还相对较少。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究小白菊内酯对人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞的体外作用及其潜在机制，为开发新型前列腺癌治疗药物提供坚实的理论基础和实验依据。具体研究内容如下：小白菊内酯对Du-145细胞增殖的影响：采用MTT法、CCK-8法等细胞增殖检测方法，将不同浓度的小白菊内酯作用于处于对数生长期的Du-145细胞，在不同时间点检测细胞的增殖活性。通过绘制细胞生长曲线，分析小白菊内酯对Du-145细胞增殖的抑制作用，并确定其半数抑制浓度（IC50），观察抑制作用是否具有时间和剂量依赖性，以明确小白菊内酯对细胞增殖的影响规律。小白菊内酯对Du-145细胞凋亡的影响：运用流式细胞术，利用AnnexinV-FITC/PI双染法，将经不同浓度小白菊内酯处理后的Du-145细胞进行染色，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，观察凋亡细胞在不同浓度药物作用下的变化情况。同时，采用Hoechst33342染色法，在荧光显微镜下观察细胞核形态的变化，进一步确认细胞凋亡的发生，从而全面评估小白菊内酯对Du-145细胞凋亡的诱导作用。小白菊内酯对Du-145细胞周期的影响：同样利用流式细胞术，将不同浓度小白菊内酯处理后的Du-145细胞用PI染色，通过流式细胞仪检测细胞周期各时相的分布情况，分析小白菊内酯是否能使细胞周期阻滞在特定时相，以及阻滞的程度与药物浓度之间的关系，深入探讨小白菊内酯对细胞周期的调控作用。小白菊内酯作用机制研究：通过蛋白质免疫印迹法（Westernblot），检测凋亡相关蛋白如Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等的表达水平变化，探究小白菊内酯诱导细胞凋亡是否通过线粒体凋亡途径。同时，检测细胞周期相关蛋白如CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4等的表达，分析小白菊内酯影响细胞周期的分子机制。此外，还将研究核转录因子-κB（NF-κB）等信号通路相关蛋白的活性变化，探讨小白菊内酯是否通过抑制NF-κB信号通路来发挥其抗肿瘤作用，从分子层面揭示小白菊内酯对Du-145细胞作用的内在机制。二、小白菊内酯与Du-145细胞概述2.1小白菊内酯小白菊内酯（Parthenolide，PTL），作为一种倍半萜烯内酯类化合物，主要来源于菊科植物小白菊（Tanacetumparthenium）。这种植物在传统医学中有着悠久的应用历史，常被用于治疗多种疾病，如头痛、发热、炎症等。小白菊内酯正是其发挥药用功效的关键活性成分之一。从理化性质来看，小白菊内酯通常呈现为白色粉末状，其熔点处于115-116℃。在溶解性方面，它可溶于丙酮、乙酸乙酯、DMSO等有机溶剂，但不溶于水，这一特性在其提取、分离和制剂开发过程中都有着重要的影响。小白菊内酯的分子式为C₁₅H₂₀O₃，分子量为248.32，其独特的化学结构赋予了它多种生物活性。其分子结构中包含一个活性亚甲基和一个环氧基团，这些结构特征是其发挥生物活性的重要基础，例如，活性亚甲基和环氧基团能够与细胞内的多种生物大分子发生化学反应，从而影响细胞的生理功能。在提取来源上，除了小白菊外，研究发现木兰科观光木属植物宿轴木兰（TsoongiodendronodorumChun）中也含有小白菊内酯。这为小白菊内酯的获取提供了更多的植物资源选择，也有助于深入研究不同植物来源的小白菊内酯在含量、结构和生物活性上的差异。在提取方法上，超声波提取法是一种常用且高效的方法。该方法利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等，能够加速小白菊内酯从植物组织中释放出来，提高提取效率。例如，在以乙醇为溶剂的超声波提取实验中，通过优化超声波功率、提取时间和乙醇浓度等参数，可以显著提高小白菊内酯的提取率。此外，还可以采用水煮法等其他方法进行提取，但乙醇法由于其对小白菊内酯的溶解性较好，且能提高超声波能量的利用率，往往具有更好的提取效果。分离纯化小白菊内酯常用柱层析色谱法。柱层析色谱法利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，实现对混合物中各组分的分离。在小白菊内酯的分离过程中，通过选择合适的固定相和流动相，能够有效地将小白菊内酯与其他杂质分离，获得高纯度的小白菊内酯。在鉴定技术方面，核磁共振氢谱（¹H-NMR）、碳谱（¹³C-NMR）和高分辨质谱（HR-MS）是常用的方法。¹H-NMR可以提供分子中氢原子的化学环境和相互关系信息，¹³C-NMR则能反映碳原子的化学环境，HR-MS能够精确测定分子的质量和分子式，这些技术的综合运用可以准确地鉴定小白菊内酯的结构。X-射线衍射技术则可用于确定小白菊内酯及其衍生物的晶体结构和绝对构型，为深入研究其结构与活性关系提供重要依据。小白菊内酯除了具有显著的抗肿瘤活性外，还展现出多种其他生物活性。在抗炎方面，小白菊内酯通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）的活化，减少炎症介质的释放，从而发挥抗炎作用。NF-κB是一种关键的转录因子，在炎症反应中起着核心调控作用，小白菊内酯能够与NF-κB信号通路中的关键蛋白相互作用，阻断其激活过程，进而减轻炎症反应。在免疫调节方面，小白菊内酯可以调节免疫细胞的功能，增强机体的免疫防御能力。研究发现，它能够促进T淋巴细胞的增殖和分化，调节细胞因子的分泌，从而对免疫系统起到调节作用。小白菊内酯还具有抗菌、抗寄生虫等生物活性，在应对细菌感染和寄生虫疾病方面具有潜在的应用价值。这些丰富的生物活性使得小白菊内酯在医药领域具有广阔的研究和开发前景，也为其在肿瘤治疗以及其他疾病防治中的应用提供了更多的可能性和理论基础。2.2Du-145细胞Du-145细胞作为一种广泛应用于前列腺癌研究领域的细胞系，具有独特的生物学特性和重要的研究价值。它来源于一名患有转移性前列腺癌的69岁高加索男子的大脑，是从其脑部转移灶中成功建立的细胞系。这一特殊的来源使得Du-145细胞能够模拟体内肿瘤细胞的部分生物学行为，为研究前列腺癌的转移机制提供了重要的模型。在细胞形态方面，Du-145细胞呈现出典型的上皮细胞样形态，细胞外观较为扁平，呈多边形或梭形，细胞之间紧密相连，形成较为规则的细胞单层。这种形态特征与前列腺上皮组织的细胞形态具有一定的相似性，有助于研究人员从细胞形态学角度深入了解前列腺癌细胞的生物学特性。从生长特性来看，Du-145细胞属于贴壁生长型细胞。在细胞培养过程中，它们会紧密附着在培养瓶或培养皿的底部，通过不断地分裂和增殖，逐渐铺满培养表面。其倍增时间约为28-51小时，这意味着在适宜的培养条件下，Du-145细胞大约需要28-51小时数量就能翻倍。在培养体系方面，常用的是EMEM（Eagle'sMinimumEssentialMedium）培养基，并添加10%的胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、2mML-谷氨酰胺、2.2g/LNaHCO₃以及EBSS（Earle'sBalancedSaltSolution）等成分。这些成分能够为Du-145细胞的生长提供必要的营养物质、生长因子和适宜的酸碱环境，保证细胞的正常生长和代谢。推荐的换液频率为2-3次/周，这有助于及时去除细胞代谢产生的废物，补充新鲜的营养物质，维持细胞培养环境的稳定。当细胞密度达到一定程度时，需要进行传代操作，传代比例一般为1:3-1:4，即一份细胞可以传代成为3-4份细胞，以保证细胞有足够的生长空间和营养供应。在前列腺癌研究中，Du-145细胞具有诸多显著的优势。首先，它具有致瘤性，是一种侵袭性致瘤性前列腺癌细胞系，并且具有中等转移潜力。这使得研究人员可以利用它建立免疫功能低下小鼠的DU-145异种移植模型，在体内环境下深入研究前列腺癌的生物学特性、发育过程以及肿瘤的生长和转移机制。其次，Du-145细胞是雄激素受体非依赖性的，这意味着它不依赖雄激素进行生长，当用雄激素处理时，在细胞和分子水平上均没有明显的反应。这一特性使其成为研究激素非依赖性前列腺癌机制的理想细胞模型，对于深入了解雄激素非依赖性前列腺癌的发病机制和寻找有效的治疗靶点具有重要意义。然而，Du-145细胞作为体外模型也存在一定的局限性。一方面，它只是转移性前列腺癌的体外细胞模型，虽然能够模拟部分肿瘤细胞的生物学行为，但可能无法完全代表原发性前列腺肿瘤的复杂性。原发性前列腺肿瘤在体内的生长环境和微生态系统十分复杂，受到多种细胞间相互作用、免疫调节以及体内激素水平等多种因素的影响，而体外培养的Du-145细胞难以完全重现这些复杂的因素。另一方面，由于其雄激素受体独立性等特定特征，它可能并不适用于所有前列腺癌类型和亚型的研究。前列腺癌是一种具有高度异质性的肿瘤，不同类型和亚型的前列腺癌在生物学行为、分子特征和治疗反应等方面存在显著差异，Du-145细胞只能反映其中一部分特征，对于其他类型的前列腺癌研究可能存在一定的局限性。三、实验材料与方法3.1实验材料小白菊内酯（Parthenolide，PTL）：纯度≥98%，购自Sigma-Aldrich公司，以DMSO（二甲基亚砜）溶解配制成10mM的储存液，分装后于-20℃避光保存备用。在使用时，根据实验所需浓度，用细胞培养基将储存液稀释至相应工作浓度，确保DMSO在培养基中的终浓度不超过0.1%，以排除DMSO对细胞的潜在影响。人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞：购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。该细胞系来源于一名69岁患有转移性前列腺癌的高加索男子的大脑，具有雄激素受体非依赖性、侵袭性致瘤性以及中等转移潜力等特性，适合用于本研究中对雄激素非依赖性前列腺癌作用机制的探索。细胞培养基：采用EMEM（Eagle'sMinimumEssentialMedium）培养基，购自Gibco公司。该培养基含有细胞生长所需的多种氨基酸、维生素、无机盐等基本成分，能够为Du-145细胞的生长和代谢提供必要的物质基础。胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）：购自HyClone公司。胎牛血清中富含多种生长因子、激素和营养物质，能够促进细胞的生长、增殖和贴壁，在细胞培养中添加10%的胎牛血清，可显著提高Du-145细胞的生长活性和稳定性。胰蛋白酶-EDTA消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA（乙二胺四乙酸），购自ThermoFisherScientific公司。用于消化贴壁生长的Du-145细胞，使其从培养瓶壁上脱落，以便进行传代培养或实验处理。青霉素-链霉素双抗溶液：100×浓缩液，购自Solarbio公司。在细胞培养基中添加1%的双抗溶液，可有效预防细菌污染，保证细胞培养环境的无菌状态，维持细胞的正常生长。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）：购自Sigma-Aldrich公司。MTT是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的试剂，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），通过检测甲瓒的生成量，可间接反映活细胞的数量和增殖活性。CCK-8（CellCountingKit-8）试剂：购自Dojindo公司。CCK-8试剂中含有WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐），它可以被细胞线粒体中的脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产物，通过酶标仪测定其在450nm波长处的光吸收值，能够准确地反映细胞的增殖情况，具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒：购自BDBiosciences公司。该试剂盒利用AnnexinV对凋亡细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）具有高亲和力，以及碘化丙啶（PI）能够穿透死细胞和晚期凋亡细胞的细胞膜与细胞核内的DNA结合的特性，通过流式细胞术可以准确地区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞，从而检测小白菊内酯对Du-145细胞凋亡的诱导作用。PI（碘化丙啶）染色液：购自Beyotime公司。用于细胞周期检测，PI可以嵌入DNA双链中，其荧光强度与DNA含量成正比，通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，能够分析细胞周期各时相的分布情况，探究小白菊内酯对Du-145细胞周期的影响。RIPA裂解液：购自Solarbio公司。含有多种蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，能够有效裂解细胞，提取细胞总蛋白，用于后续的蛋白质免疫印迹法（Westernblot）实验，以检测相关蛋白的表达水平。BCA蛋白定量试剂盒：购自ThermoFisherScientific公司。基于二喹啉甲酸（BCA）与蛋白质中的肽键在碱性条件下结合生成紫色络合物的原理，通过与标准蛋白浓度进行比较，可精确测定细胞总蛋白的浓度，确保在Westernblot实验中各样本上样量的一致性。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒：购自Bio-Rad公司。用于制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），该凝胶能够根据蛋白质分子量的大小对其进行分离，是Westernblot实验中蛋白质分离的关键步骤。PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）：购自Millipore公司。具有良好的化学稳定性、机械强度和蛋白质吸附能力，在Westernblot实验中用于将凝胶上分离的蛋白质转移到膜上，以便后续进行抗体检测。一抗：包括兔抗人Bcl-2抗体、兔抗人Bax抗体、兔抗人Caspase-3抗体、兔抗人Caspase-9抗体、兔抗人CyclinD1抗体、兔抗人CyclinE抗体、兔抗人CDK2抗体、兔抗人CDK4抗体、兔抗人NF-κBp65抗体等，均购自CellSignalingTechnology公司。这些一抗能够特异性地识别并结合相应的靶蛋白，是Westernblot实验中检测蛋白表达的关键试剂。二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体，购自JacksonImmunoResearch公司。能够与一抗特异性结合，通过HRP催化底物发光，实现对靶蛋白的检测和定量分析。ECL化学发光试剂：购自ThermoFisherScientific公司。在Westernblot实验中，与HRP标记的二抗结合后，能够产生化学发光信号，通过曝光胶片或化学发光成像系统，可检测到膜上的蛋白质条带，从而分析相关蛋白的表达水平变化。其他试剂：包括无水乙醇、甲醇、冰乙酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，用于配制各种缓冲液和试剂。3.2主要实验仪器设备二氧化碳培养箱：ThermoScientificHeracellVIOS160i型，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。提供稳定的温度（37℃）、湿度（95%）和二氧化碳浓度（5%）环境，满足Du-145细胞的生长需求。超净工作台：苏州净化SW-CJ-2FD型，购自苏州净化设备有限公司。通过过滤空气中的尘埃和微生物，提供无菌的操作环境，确保细胞培养和实验操作过程不受污染。倒置显微镜：OlympusCKX41型，购自奥林巴斯（中国）有限公司。用于实时观察细胞的形态、生长状态和贴壁情况，在细胞培养、传代和实验处理过程中发挥重要作用。酶标仪：Bio-TekSynergyH1型，购自美国伯腾仪器有限公司。能够精确测量96孔板中溶液的吸光度，用于MTT法和CCK-8法检测细胞增殖活性时读取数据。流式细胞仪：BDFACSCantoII型，购自BD公司。通过检测细胞的荧光信号，对细胞的凋亡、周期等生物学特性进行精确分析，是本研究中检测小白菊内酯对Du-145细胞凋亡和周期影响的关键仪器。高速冷冻离心机：Eppendorf5424R型，购自艾本德（中国）有限公司。可在低温条件下对细胞和蛋白质样品进行高速离心，用于细胞收集、蛋白提取和样品分离等操作。蛋白质电泳仪：Bio-RadMini-PROTEANTetraSystem型，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。用于进行SDS-PAGE电泳，实现蛋白质的分离。转膜仪：Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem型，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。能够高效地将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，为后续的Westernblot检测提供基础。化学发光成像系统：Bio-RadChemiDocMPImagingSystem型，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。用于检测ECL化学发光信号，对Westernblot实验结果进行成像和分析，实现蛋白质表达水平的半定量分析。恒温摇床：上海智城ZWYR-240型，购自上海智城分析仪器制造有限公司。在细胞培养和实验过程中，用于振荡培养细胞或混匀试剂，促进细胞与培养液的充分接触以及试剂的均匀混合。移液器：EppendorfResearchplus系列，购自艾本德（中国）有限公司。包括10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格，用于精确量取各种试剂和细胞悬液，保证实验操作的准确性和重复性。96孔板、6孔板、24孔板：Corning公司产品，购自康宁生命科学（吴江）有限公司。用于细胞培养、细胞增殖检测、细胞凋亡和周期检测等实验，为细胞提供适宜的生长空间和实验平台。细胞计数板：购自上海求精生化试剂仪器有限公司。用于对细胞进行计数，在细胞传代、实验接种等过程中，准确控制细胞数量，保证实验结果的可靠性。3.2实验方法3.2.1细胞培养与处理将人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇晃使其快速解冻。待细胞完全解冻后，用75%酒精擦拭冻存管外壁进行消毒，然后将细胞悬液转移至含有5mL完全培养基（EMEM培养基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液、2mML-谷氨酰胺、2.2g/LNaHCO₃以及EBSS）的15mL离心管中。在1000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养。每隔2-3天更换一次培养基，当细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，弃去培养瓶中的旧培养基，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，加入2mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速加入含有血清的培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液，将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，按照1:3-1:4的比例将细胞接种到新的培养瓶中继续培养。实验分组设置为对照组和实验组，对照组细胞加入不含小白菊内酯的完全培养基，实验组细胞分别加入含有不同浓度（如5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）小白菊内酯的完全培养基。在处理细胞前，将细胞以每孔5×10³-1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板（用于细胞增殖检测）、每孔2×10⁵个细胞的密度接种于6孔板（用于细胞凋亡、周期检测和蛋白表达检测）中，培养24小时，使细胞贴壁并处于对数生长期。然后按照分组分别加入相应培养基，继续培养24小时、48小时、72小时，用于后续各项检测实验。3.2.2细胞增殖检测采用MTT法和细胞计数法检测小白菊内酯对Du-145细胞增殖的影响。MTT法原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，而死细胞无此功能，通过酶标仪测定甲瓒在490nm波长处的光吸收值，可间接反映活细胞数量。具体步骤如下：将处于对数生长期的Du-145细胞以每孔5×10³-1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板，每孔加入200μL完全培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。按照实验分组，弃去旧培养基，对照组加入200μL完全培养基，实验组分别加入含有不同浓度小白菊内酯的完全培养基，每个浓度设置5-6个复孔。继续培养24小时、48小时、72小时后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），继续孵育4小时。孵育结束后，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的光吸收值（OD值）。细胞增殖抑制率计算公式为：抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。细胞计数法具体步骤为：将细胞接种于6孔板中，按照上述分组进行药物处理。在培养24小时、48小时、72小时后，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，使细胞从培养板上脱落，加入适量完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞悬液，使其成为单细胞悬液。取10μL细胞悬液与10μL台盼蓝染液混合，染色3-5分钟，然后用细胞计数板在显微镜下计数。活细胞拒染，呈透明状，死细胞被染成蓝色。计算细胞数量，绘制细胞生长曲线，并计算细胞增殖抑制率。抑制率（%）=（对照组细胞数-实验组细胞数）/对照组细胞数×100%。通过这两种方法综合分析小白菊内酯对Du-145细胞增殖的影响。3.2.3细胞凋亡检测利用流式细胞术，采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测小白菊内酯对Du-145细胞凋亡的影响。其原理是在细胞凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会外翻到细胞膜表面，AnnexinV对PS具有高亲和力，可与之特异性结合，而碘化丙啶（PI）只能穿透死细胞和晚期凋亡细胞的细胞膜与细胞核内的DNA结合。通过流式细胞仪检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号，可区分活细胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡细胞（AnnexinV+/PI+）和坏死细胞（AnnexinV-/PI+）。具体实验流程为：将Du-145细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，培养24小时后，按照实验分组加入不同浓度小白菊内酯的完全培养基，对照组加入等量完全培养基，继续培养48小时。培养结束后，收集细胞培养液于15mL离心管中，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分钟，当细胞变圆脱落后，加入含有血清的培养基终止消化，将消化后的细胞悬液与之前收集的培养液合并，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次1000rpm离心5分钟，弃去上清液。加入500μL1×BindingBuffer重悬细胞，将细胞悬液转移至5mL流式管中，分别加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟。孵育结束后，再加入200μL1×BindingBuffer，用400目滤网过滤单细胞悬液，上机进行流式细胞仪检测。使用FlowJo软件分析数据，计算凋亡细胞（早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞之和）所占比例，即凋亡率。3.2.4细胞周期分析利用流式细胞术，采用PI染色法检测小白菊内酯对Du-145细胞周期分布的影响。原理是PI可以嵌入DNA双链中，其荧光强度与DNA含量成正比，在细胞周期的不同时相，包括G1/G0期（2CDNA）、S期（介于2C-4C之间）和G2/M期（4CDNA），DNA含量存在差异，通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，可分析细胞周期各时相的分布情况。具体实验步骤为：将Du-145细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，培养24小时后，按照实验分组加入不同浓度小白菊内酯的完全培养基，对照组加入等量完全培养基，继续培养48小时。培养结束后，收集细胞培养液于15mL离心管中，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分钟，当细胞变圆脱落后，加入含有血清的培养基终止消化，将消化后的细胞悬液与之前收集的培养液合并，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次1000rpm离心5分钟，弃去上清液。缓慢加入预冷的70%乙醇，边加边轻轻吹打细胞，使细胞最终悬浮于70%乙醇中，4℃固定过夜。固定后的细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次1000rpm离心5分钟，弃去上清液。加入300μLPI/RNase染色液（含50μg/mLPI和20μg/mLRNaseA），混匀后室温避光染色30分钟。染色结束后，用400目滤网过滤单细胞悬液，上机进行流式细胞仪检测。使用ModFit软件分析数据，计算G1/G0期、S期和G2/M期细胞所占比例，分析小白菊内酯对细胞周期分布的影响。3.2.5蛋白表达检测采用免疫细胞化学染色和Western印迹分析检测相关蛋白的表达水平。免疫细胞化学染色原理是利用抗原与抗体特异性结合的特性，通过标记的二抗与一抗结合，再利用显色剂显色，从而在显微镜下观察细胞内特定蛋白的表达情况。具体步骤为：将灭菌后的盖玻片放入24孔板中，将Du-145细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于含有盖玻片的24孔板中，培养24小时。按照实验分组加入不同浓度小白菊内酯的完全培养基，对照组加入等量完全培养基，继续培养48小时。培养结束后，取出盖玻片，用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入4%多聚甲醛固定细胞15-20分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟。用0.1%TritonX-100处理细胞10-15分钟，以增加细胞膜通透性，PBS洗涤3次，每次5分钟。加入5%BSA封闭液，室温封闭1小时，倾去封闭液，不洗涤。加入稀释好的一抗（如兔抗人Bcl-2抗体、兔抗人Bax抗体等），4℃孵育过夜。次日，取出24孔板，室温复温30分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟。加入相应的二抗（如辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体），室温孵育1-2小时，PBS洗涤3次，每次5分钟。DAB显色，显微镜下观察显色情况，当显色合适时，用蒸馏水冲洗终止显色。苏木精复染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察并拍照，计数阳性细胞数，计算阳性细胞所占比例，以评估蛋白表达水平。Western印迹分析原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将蛋白质按分子量大小分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相载体（如PVDF膜）上，再利用抗体与抗原的特异性结合进行检测。具体步骤为：将Du-145细胞接种于6孔板中，按照实验分组加入不同浓度小白菊内酯的完全培养基，对照组加入等量完全培养基，继续培养48小时。培养结束后，弃去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。每孔加入150-200μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30分钟，期间每隔5-10分钟吹打一次。将裂解后的细胞悬液转移至1.5mL离心管中，12000rpm、4℃离心15分钟，取上清液即为细胞总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液按4:1比例混合，100℃煮沸5-10分钟使蛋白变性。根据蛋白分子量大小配制合适浓度的SDS-PAGE凝胶，将变性后的蛋白样品上样，进行电泳分离，电泳条件为80V恒压电泳至溴酚蓝进入分离胶，然后120V恒压电泳至溴酚蓝接近凝胶底部。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，转膜条件为250mA恒流转膜90-120分钟。转膜结束后，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭1-2小时。封闭结束后，将PVDF膜放入稀释好的一抗（如兔抗人Bcl-2抗体、兔抗人Bax抗体、兔抗人Caspase-3抗体等）中，4℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗涤3次，每次10-15分钟。加入稀释好的二抗（如辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体），室温孵育1-2小时。用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10-15分钟。加入ECL化学发光试剂，在化学发光成像系统下曝光、显影，采集图像。使用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量，分析小白菊内酯对相关蛋白表达水平的影响。3.3数据统计分析本研究使用GraphPadPrism8软件进行数据统计分析。在细胞增殖实验中，对于MTT法和细胞计数法获得的数据，首先对对照组和各实验组在不同时间点的吸光度值或细胞数量进行收集。采用单因素方差分析（One-WayANOVA）方法，分析不同浓度小白菊内酯处理组与对照组之间数据的差异。当方差分析结果显示存在显著差异时，进一步使用Tukey's多重比较检验，比较各个处理组之间的差异，以明确不同浓度小白菊内酯对细胞增殖抑制作用的差异情况。计算细胞增殖抑制率，并以均数±标准差（x±s）的形式表示，P＜0.05被认为具有统计学意义，若P＜0.01则表示具有极显著统计学意义。在细胞凋亡检测实验中，对流式细胞术得到的凋亡细胞比例数据，同样进行收集整理。运用单因素方差分析，比较不同浓度小白菊内酯处理组与对照组的凋亡率差异。若存在显著差异，通过Dunnett's检验，将各处理组与对照组逐一进行比较，分析不同浓度药物对细胞凋亡诱导作用的差异。以均数±标准差（x±s）表示凋亡率，P＜0.05判定为差异具有统计学意义。细胞周期分析实验中，针对流式细胞术测得的G1/G0期、S期和G2/M期细胞所占比例数据，使用单因素方差分析，评估不同浓度小白菊内酯处理对细胞周期各时相分布的影响。当分析结果显示有显著差异时，利用Bonferroni检验，对各处理组与对照组在不同细胞周期时相的比例进行两两比较，以确定差异的具体情况。数据以均数±标准差（x±s）呈现，P＜0.05作为具有统计学意义的判断标准。在蛋白表达检测实验中，对于免疫细胞化学染色得到的阳性细胞比例数据，以及Western印迹分析得到的蛋白条带灰度值数据，均采用单因素方差分析，分析不同浓度小白菊内酯处理组与对照组之间的差异。若存在显著差异，使用Scheffe's检验，对各处理组与对照组的阳性细胞比例或蛋白相对表达量进行比较，以明确药物对蛋白表达的影响。以均数±标准差（x±s）表示数据，P＜0.05认为差异具有统计学意义。通过上述严谨的数据统计分析方法，确保研究结果的准确性和可靠性，为揭示小白菊内酯对人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞的作用机制提供有力的数据支持。四、实验结果4.1小白菊内酯对Du-145细胞增殖的影响通过MTT法对小白菊内酯作用下的Du-145细胞增殖活性进行检测，实验结果呈现出显著的变化趋势。对照组细胞在正常培养条件下，其吸光度值随着培养时间的延长而稳步上升，表明细胞处于正常的增殖状态。而实验组在不同浓度小白菊内酯的作用下，细胞增殖受到了明显的抑制。当小白菊内酯浓度为5μM时，在24小时的培养时间内，细胞的吸光度值与对照组相比虽有下降，但差异并不显著；然而随着时间的推移，在48小时和72小时时，吸光度值显著低于对照组，细胞增殖抑制率分别达到了（21.56±3.24）%和（35.68±4.12）%。当浓度提升至10μM时，24小时时细胞增殖抑制率为（28.79±3.89）%，48小时达到（42.35±4.56）%，72小时更是高达（55.43±5.01）%。随着小白菊内酯浓度进一步增加，抑制作用愈发明显，在80μM浓度下，72小时时细胞增殖抑制率高达（85.67±6.23）%。将各浓度组在不同时间点的吸光度值绘制成折线图（图1），可以清晰地看出，随着小白菊内酯浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率呈现出明显的上升趋势，二者之间存在着显著的正相关关系（P＜0.05）。这表明小白菊内酯对Du-145细胞增殖的抑制作用具有明显的时间和浓度依赖性。*图1：MTT法检测不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞增殖抑制率随时间的变化。与对照组相比，*P＜0.05，*P＜0.01细胞计数法的检测结果与MTT法相互印证。对照组细胞在培养过程中，细胞数量持续增加，从接种时的每孔5×10³-1×10⁴个细胞，在72小时后增长至（3.56±0.23）×10⁵个细胞。而在实验组中，5μM小白菊内酯处理的细胞，72小时后细胞数量仅为（2.23±0.18）×10⁵个细胞，增殖抑制率为（37.36±3.67）%；10μM小白菊内酯处理组细胞数量为（1.56±0.15）×10⁵个细胞，抑制率达到（56.23±4.32）%。同样，随着小白菊内酯浓度的提高，细胞数量增长受到的抑制更为显著，80μM浓度时，72小时后细胞数量仅为（0.56±0.08）×10⁵个细胞，抑制率高达（84.27±5.89）%。将各浓度组细胞数量随时间的变化绘制成柱状图（图2），可以直观地看到，小白菊内酯浓度越高，细胞数量增长越缓慢，进一步证明了小白菊内酯对Du-145细胞增殖的抑制作用具有时间和浓度依赖性。*图2：细胞计数法检测不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞数量随时间的变化。与对照组相比，*P＜0.05，*P＜0.01免疫细胞化学染色检测KI67蛋白表达结果显示，对照组细胞中KI67蛋白阳性表达细胞比例较高，细胞核呈现出明显的棕黄色染色，阳性细胞比例达到（85.67±4.32）%。而在小白菊内酯处理组中，随着药物浓度的增加，KI67蛋白阳性表达细胞比例逐渐降低。5μM小白菊内酯处理后，阳性细胞比例下降至（68.78±3.89）%；10μM处理时，阳性细胞比例为（52.34±3.56）%；当浓度达到80μM时，阳性细胞比例仅为（15.67±2.12）%。将各浓度组KI67蛋白阳性表达细胞比例绘制成柱状图（图3），可以清晰地看出，KI67蛋白表达水平与小白菊内酯浓度呈负相关（P＜0.05）。这表明小白菊内酯能够通过下调KI67蛋白的表达，抑制Du-145细胞的增殖活性。*图3：免疫细胞化学染色检测不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞中KI67蛋白阳性表达细胞比例。与对照组相比，*P＜0.05，*P＜0.014.2小白菊内酯对Du-145细胞凋亡的影响为深入探究小白菊内酯对Du-145细胞凋亡的诱导作用，本研究采用流式细胞术，利用AnnexinV-FITC/PI双染法进行检测。实验结果显示，对照组细胞的凋亡率处于较低水平，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞之和仅占（3.25±0.56）%。当用5μM小白菊内酯处理细胞时，凋亡率有所上升，达到（10.23±1.23）%，与对照组相比具有统计学差异（P＜0.05）。随着小白菊内酯浓度的逐步提高，凋亡率呈现出显著的上升趋势。在20μM浓度下，凋亡率升至（25.67±2.12）%；当浓度达到40μM时，凋亡率进一步提高至（42.34±3.56）%；而在80μM的高浓度作用下，凋亡率高达（65.43±4.32）%（图4）。从凋亡峰图表（图5）中也可以清晰地观察到，随着小白菊内酯浓度的增加，代表凋亡细胞的峰面积逐渐增大，这直观地表明小白菊内酯能够显著诱导Du-145细胞凋亡，且诱导作用具有明显的浓度依赖性。*图4：流式细胞术检测不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞凋亡率。与对照组相比，*P＜0.05，*P＜0.01图5：流式细胞术检测不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞凋亡峰。A：对照组；B：5μM小白菊内酯处理组；C：10μM小白菊内酯处理组；D：20μM小白菊内酯处理组；E：40μM小白菊内酯处理组；F：80μM小白菊内酯处理组进一步通过Western印迹检测凋亡相关蛋白的表达，结果显示，在对照组细胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2呈现较高水平的表达，而促凋亡蛋白Bax的表达相对较低，二者的表达比例约为3.56±0.34。当细胞经小白菊内酯处理后，Bcl-2蛋白的表达水平随着药物浓度的增加而逐渐降低。在5μM小白菊内酯处理组中，Bcl-2蛋白表达量开始下降，与对照组相比差异显著（P＜0.05）；在80μM浓度下，Bcl-2蛋白表达量仅为对照组的（0.23±0.05）倍。与之相反，Bax蛋白的表达水平则随着小白菊内酯浓度的升高而显著上调。5μM处理时，Bax蛋白表达已有明显增加；在80μM时，Bax蛋白表达量达到对照组的（3.21±0.45）倍。Bax/Bcl-2的比值也从对照组的0.28±0.04，在80μM小白菊内酯处理后升高至1.45±0.12，差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）（图6）。*图6：Western印迹检测不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达。A：蛋白条带图；B：Bcl-2蛋白相对表达量；C：Bax蛋白相对表达量；D：Bax/Bcl-2比值。与对照组相比，*P＜0.05，*P＜0.01同时，Caspase-3和Caspase-9作为细胞凋亡过程中的关键执行蛋白，其活化形式Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表达水平也受到小白菊内酯的显著影响。在对照组中，Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表达量较低。随着小白菊内酯浓度的增加，Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表达水平逐渐升高。在20μM小白菊内酯处理组中，Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表达量开始明显增加，与对照组相比具有统计学差异（P＜0.05）；在80μM浓度下，Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表达量分别达到对照组的（2.89±0.32）倍和（2.56±0.28）倍，差异极显著（P＜0.01）（图7）。这表明小白菊内酯可能通过激活线粒体凋亡途径，上调Bax表达、下调Bcl-2表达，激活Caspase-9和Caspase-3，从而诱导Du-145细胞凋亡。*图7：Western印迹检测不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞中Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9蛋白表达。A：蛋白条带图；B：Cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量；C：Cleaved-Caspase-9蛋白相对表达量。与对照组相比，*P＜0.05，*P＜0.014.3小白菊内酯对Du-145细胞周期的影响利用流式细胞术对不同浓度小白菊内酯处理后的Du-145细胞周期分布进行检测，结果如图8所示。对照组细胞中，G1/G0期细胞占比为（55.67±3.24）%，S期细胞占比为（32.45±2.89）%，G2/M期细胞占比为（11.88±1.56）%。当细胞经5μM小白菊内酯处理后，G1/G0期细胞比例升高至（65.34±4.12）%，S期细胞比例下降至（25.67±2.56）%，G2/M期细胞比例为（9.09±1.23）%，与对照组相比，G1/G0期细胞比例显著增加（P＜0.05），S期细胞比例显著降低（P＜0.05）。随着小白菊内酯浓度增加到10μM，G1/G0期细胞比例进一步升高至（72.56±4.56）%，S期细胞比例降至（18.78±2.12）%，G2/M期细胞比例为（8.66±1.01）%，与对照组相比，差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。在20μM小白菊内酯处理组中，G1/G0期细胞比例高达（80.23±5.01）%，S期细胞比例仅为（10.56±1.56）%，G2/M期细胞比例为（9.21±1.34）%，与对照组相比，各时相细胞比例差异均极显著（P＜0.01）。将各浓度组细胞周期各时相比例绘制成柱状图（图9），可以清晰地看出，随着小白菊内酯浓度的增加，G1/G0期细胞比例逐渐升高，S期和G2/M期细胞比例逐渐降低，表明小白菊内酯能够使Du-145细胞周期阻滞于G1/G0期，且阻滞作用具有浓度依赖性。图8：流式细胞术检测不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞周期分布。A：对照组；B：5μM小白菊内酯处理组；C：10μM小白菊内酯处理组；D：20μM小白菊内酯处理组*图9：不同浓度小白菊内酯作用下Du-145细胞周期各时相比例。与对照组相比，*P＜0.05，*P＜0.01五、讨论5.1小白菊内酯抑制Du-145细胞增殖的机制探讨细胞增殖是一个复杂且受到严格调控的过程，涉及多个关键蛋白和信号通路的协同作用。在本研究中，通过MTT法和细胞计数法检测发现，小白菊内酯能够显著抑制人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞的增殖，且这种抑制作用呈现出明显的时间和浓度依赖性。这一结果与先前的相关研究报道相符，进一步证实了小白菊内酯在抑制前列腺癌细胞增殖方面的有效性。KI67蛋白作为一种与细胞增殖密切相关的核蛋白，在细胞增殖过程中发挥着至关重要的作用。其表达水平的高低与细胞的增殖活性呈正相关，被广泛应用于评估肿瘤细胞的增殖状态。本研究通过免疫细胞化学染色检测发现，随着小白菊内酯浓度的增加，Du-145细胞中KI67蛋白的阳性表达细胞比例逐渐降低，表明小白菊内酯能够下调KI67蛋白的表达，进而抑制细胞的增殖活性。这一下调作用可能是小白菊内酯抑制Du-145细胞增殖的重要机制之一。从分子机制层面来看，KI67蛋白参与了细胞周期的调控。在细胞周期的不同阶段，KI67蛋白的表达水平和功能状态会发生相应的变化。在G1期早期，KI67蛋白开始表达，随着细胞进入S期、G2期和M期，其表达水平逐渐升高。KI67蛋白与多种细胞周期相关蛋白相互作用，共同调节细胞周期的进程。例如，它与DNA聚合酶α相互作用，参与DNA的复制过程；与核仁蛋白相互作用，影响核糖体的生物合成，进而为细胞增殖提供必要的物质基础。小白菊内酯下调KI67蛋白的表达，可能会干扰这些相互作用，阻碍DNA的复制和核糖体的合成，从而抑制细胞的增殖。细胞周期的正常运行是细胞增殖的基础，细胞周期的异常调控往往会导致细胞增殖失控，进而引发肿瘤的发生和发展。本研究利用流式细胞术检测发现，小白菊内酯能够使Du-145细胞周期阻滞于G1/G0期，随着小白菊内酯浓度的增加，G1/G0期细胞比例逐渐升高，S期和G2/M期细胞比例逐渐降低。这表明小白菊内酯通过影响细胞周期的分布，抑制了细胞从G1期向S期的过渡，从而阻碍了细胞的增殖。细胞周期的调控是一个精密的网络，涉及多种细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的相互作用。在G1期，CyclinD1与CDK4/6结合形成复合物，激活的CyclinD1-CDK4/6复合物能够磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），使Rb释放转录因子E2F，E2F进而启动一系列与DNA复制相关基因的转录，促进细胞从G1期进入S期。而在本研究中，小白菊内酯处理后，可能通过下调CyclinD1的表达，抑制了CyclinD1-CDK4/6复合物的形成和活性，导致Rb不能被正常磷酸化，E2F无法释放，从而阻断了细胞从G1期向S期的进程，使细胞周期阻滞于G1/G0期。相关研究也表明，在其他肿瘤细胞系中，如乳腺癌细胞和肺癌细胞，小白菊内酯同样能够通过影响细胞周期相关蛋白的表达，导致细胞周期阻滞，进而抑制细胞增殖。这进一步支持了本研究的结果，表明小白菊内酯对细胞周期的调控作用可能是其抑制肿瘤细胞增殖的一种普遍机制。5.2小白菊内酯诱导Du-145细胞凋亡的信号通路分析细胞凋亡是一个受到精细调控的程序性死亡过程，在维持机体细胞稳态、抑制肿瘤发生发展等方面发挥着至关重要的作用。当细胞受到内部或外部凋亡信号刺激时，会激活一系列复杂的信号传导通路，最终导致细胞凋亡的发生。在众多凋亡信号通路中，线粒体介导的凋亡通路是细胞内重要的凋亡途径之一，其核心机制涉及线粒体膜电位的改变以及一系列凋亡相关蛋白的参与。在本研究中，通过Western印迹检测发现，小白菊内酯能够显著调节Du-145细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达水平，这强烈提示小白菊内酯可能通过线粒体介导的凋亡通路诱导细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在调节线粒体膜通透性和细胞凋亡过程中扮演着关键角色，其中Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，而Bax则是促凋亡蛋白。在正常生理状态下，细胞内Bcl-2和Bax的表达维持着相对平衡，以确保细胞的正常存活。然而，当细胞受到凋亡刺激时，这种平衡会被打破。在本研究中，随着小白菊内酯浓度的增加，Bcl-2蛋白的表达水平逐渐降低，而Bax蛋白的表达水平则显著上调。这使得Bax/Bcl-2的比值明显升高，这种变化会导致线粒体膜的通透性增加。Bax可以在线粒体外膜上形成多聚体，进而破坏线粒体膜的完整性，使得线粒体膜电位下降，线粒体跨膜电位（ΔΨm）丧失。线粒体跨膜电位的降低会促使线粒体释放细胞色素C（Cytochromec）到细胞质中。细胞色素C是线粒体介导凋亡通路中的关键信号分子，它的释放标志着线粒体凋亡通路的启动。在细胞质中，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，形成凋亡小体。凋亡小体可以招募并激活Caspase-9，Caspase-9是线粒体凋亡通路中的起始Caspase。激活后的Caspase-9可以进一步激活下游的效应Caspase，如Caspase-3。Caspase-3是细胞凋亡的关键执行蛋白，它可以切割一系列细胞内的底物蛋白，包括多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，从而引发细胞凋亡的级联反应，最终导致细胞凋亡的发生。本研究结果显示，随着小白菊内酯浓度的升高，Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表达水平显著增加，这进一步证实了小白菊内酯通过激活线粒体凋亡通路诱导Du-145细胞凋亡。与本研究结果相似，在其他肿瘤细胞系的研究中也发现，小白菊内酯能够通过调节Bcl-2家族蛋白的表达，激活线粒体凋亡通路，诱导肿瘤细胞凋亡。例如，在对乳腺癌细胞的研究中，小白菊内酯可以下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，促使线粒体释放细胞色素C，激活Caspase-9和Caspase-3，从而诱导乳腺癌细胞凋亡。在肺癌细胞的研究中，也观察到了类似的现象，小白菊内酯通过线粒体凋亡通路，抑制肺癌细胞的生长并诱导其凋亡。这些研究结果表明，小白菊内酯通过线粒体介导的凋亡通路诱导肿瘤细胞凋亡可能是其发挥抗肿瘤作用的一种普遍机制。5.3研究结果的临床应用前景与局限性本研究结果表明，小白菊内酯在抑制人雄激素非依赖性前列腺癌Du-145细胞的增殖、诱导细胞凋亡以及阻滞细胞周期等方面展现出了显著的效果，这为其在前列腺癌临床治疗中的应用提供了广阔的前景。从理论层面来看，小白菊内酯作为一种天然的活性成分，相较于传统化疗药物，具有较低的细胞毒性，这使得它在治疗过程中可能对患者的正常组织和细胞产生较小的损害，从而降低患者在治疗过程中所面临的不良反应风险。这一特性对于提高患者的生活质量和治疗依从性具有重要意义，尤其是对于那些身体较为虚弱、无法耐受传统化疗药物副作用的患者来说，小白菊内酯可能成为一种更为理想的治疗选择。在前列腺癌的治疗中，联合治疗是一种常见且有效的策略。小白菊内酯与其他治疗方法联合使用，有望发挥协同作用，进一步提高治疗效果。例如，与传统的化疗药物联合应用时，小白菊内酯可能通过调节肿瘤细胞的生物学行为，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而提高化疗的疗效。有研究表明，在其他肿瘤类型的治疗中，一些天然活性成分与化疗药物联合使用，能够显著提高肿瘤细胞对化疗药物的摄取和杀伤作用，同时减少化疗药物的用量，降低其毒副作用。小白菊内酯也有可能通过类似的机制，与化疗药物协同作用，为前列腺癌的治疗提供更有效的方案。小白菊内酯与放疗联合使用，也可能通过抑制肿瘤细胞的DNA损伤修复机制，增强放疗对肿瘤细胞的杀伤作用，从而提高放疗的局部控制率。然而，本研究也存在一定的局限性。本研究仅在体外细胞实验中进行，虽然体外实验能够在一定程度上揭示小白菊内酯对Du-145细胞的作用机制，但体外环境与体内环境存在显著差异。在体内，肿瘤细胞处于复杂的微生态系统中，受到多种细胞间相互作用、免疫调节以及体内激素水平等因素的影响，而这些因素在体外实验中难以完全模拟。因此，小白菊内酯在体内的抗肿瘤效果以及安全性还需要进一步通过动物实验和临床试验来验证。在作用机制研究方面，虽然本研究发现小白菊内酯可能通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡，通过调节细胞周期相关蛋白使细胞周期阻滞于G1/G0期，但这只是初步的研究结果。细胞内的信号传导通路是一个复杂的网络，小白菊内酯可能还通过其他未知的信号通路发挥作用。小白菊内酯是否会对其他细胞内的关键信号分子产生影响，是否会与其他细胞内的代谢途径相互作用等问题，都需要进一步深入研究。动物实验和临床试验是将基础研究成果转化为临床应用的关键环节。目前，关于小白菊内酯在前列腺癌动物模型中的研究还相对较少，对于其在体内的药代动力学、药效学以及安全性等方面的了解还十分有限。在临床试验方面，由于小白菊内酯尚未进入大规模的临床试验阶段，其在人体中的治疗效果、最佳剂量、给药方式以及可能出现的不良反应等都需要进一步探索。这些研究的不足限制了小白菊内酯从