小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因：鉴定、分析与功能探究

小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因：鉴定、分析与功能探究一、引言1.1研究背景与意义小麦（TriticumaestivumL.）作为世界上最重要的粮食作物之一，在全球粮食安全中占据着举足轻重的地位。中国是小麦生产和消费大国，2024年全国小麦产量为13822万吨，约占全国粮食总产量的20.1%，其产量和品质直接关系到国家的粮食安全和人民的生活质量。小麦的产量构成因素包括穗数、穗粒数和粒重，而开花期穗部发育对穗粒数和粒重的形成起着关键作用，是决定小麦最终产量的重要时期。开花期是小麦从营养生长向生殖生长转变的关键阶段，这一时期穗部的正常发育对于后续籽粒的形成和充实至关重要。在开花期，小麦穗部经历了一系列复杂的生理生化过程，包括小花分化、雌雄蕊发育、授粉受精等。任何影响这些过程的因素都可能导致穗粒数减少或籽粒发育不良，从而降低小麦产量。例如，恶劣的天气条件（如高温、干旱、阴雨等）在开花期发生，会影响小麦的授粉受精过程，导致结实率下降；病虫害的侵袭也可能破坏穗部组织，影响穗部正常发育。因此，深入了解小麦开花期穗部发育的分子机制，对于提高小麦产量具有重要的理论和实践意义。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，越来越多的研究表明，微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用。miRNAs是一类长度约为21-24个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的互补配对，介导靶基因的切割或翻译抑制，从而在转录后水平调控基因表达。在植物中，miRNAs参与了众多生物学过程，如生长发育、逆境响应、激素信号转导等。在小麦中，miRNAs也被发现参与了多个生长发育阶段的调控，包括种子萌发、幼苗生长、分蘖、抽穗、开花等。然而，目前对于小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因的系统研究还相对较少，其在穗部发育过程中的调控网络和作用机制尚不完全清楚。对小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因进行鉴定与分析，有助于揭示小麦穗部发育的分子调控机制，为小麦高产优质育种提供理论基础。通过研究miRNAs及其靶基因，可以深入了解小麦开花期穗部发育的分子调控网络，明确关键调控因子，为小麦遗传改良提供新的靶点和基因资源；有助于挖掘与小麦产量和品质相关的分子标记，加速小麦分子标记辅助育种进程，提高育种效率；有助于通过基因工程手段对小麦进行遗传改良，培育出高产、优质、抗逆的小麦新品种，保障国家粮食安全。综上所述，开展小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因的鉴定与分析具有重要的科学意义和应用价值。1.2国内外研究现状在小麦miRNAs研究领域，国内外科研人员已取得了一系列重要成果。早在2002年，Llave等就通过生物信息学方法预测了拟南芥中的miRNAs，开启了植物miRNAs研究的序幕。随后，小麦miRNAs的研究逐渐展开。在miRNAs鉴定方面，国内外学者利用高通量测序技术和生物信息学方法，从不同小麦组织和发育阶段中鉴定出了大量的miRNAs。例如，Zhang等利用高通量测序技术，从普通小麦中鉴定出了43个已知miRNAs和128个新miRNAs；Zhao等通过对小麦不同组织的深度测序，获得了177个保守miRNAs和209个新miRNAs。这些研究极大地丰富了小麦miRNAs的数据库，为后续功能研究奠定了基础。功能研究方面，国内外研究表明小麦miRNAs参与了众多生物学过程。在生长发育调控方面，miR156和miR172被发现参与调控小麦的营养生长向生殖生长转变过程，miR156通过靶向调控SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE（SPL）基因家族，影响小麦的分蘖、株高和开花时间；miR172则通过调控APETALA2（AP2）-like转录因子，参与小麦花器官的发育。在逆境响应方面，小麦miRNAs在应对干旱、盐胁迫、低温等非生物胁迫以及病虫害等生物胁迫中发挥着重要作用。例如，miR169在干旱胁迫下表达上调，通过靶向调控NF-YA转录因子，参与小麦的干旱胁迫响应；miR393在小麦应对麦长管蚜胁迫时表达显著变化，调控生长素信号转导途径相关基因，影响小麦对麦长管蚜的抗性。然而，当前小麦miRNAs及靶基因研究仍存在一些不足与空白。在小麦开花期穗部这一特定组织和发育阶段，miRNAs及其靶基因的系统研究还相对匮乏。虽然已有一些关于小麦开花期的研究，但对于穗部特异性表达的miRNAs及其精准调控穗部发育的分子机制尚未完全明晰。此外，大多数研究集中在少数已知miRNAs上，对于大量新鉴定出的miRNAs功能研究较少，且miRNAs与靶基因之间的调控网络研究还不够深入，缺乏对整个调控体系的系统性认识。在应用方面，如何将小麦miRNAs的研究成果有效地转化到小麦遗传育种实践中，实现小麦产量和品质的提升，还需要进一步探索和研究。1.3研究目的与内容本研究旨在通过高通量测序技术、生物信息学分析和分子生物学实验，系统地鉴定小麦开花期穗部的miRNAs及其靶基因，并深入分析其在穗部发育过程中的功能和调控机制，为揭示小麦穗部发育的分子机理提供理论依据，为小麦高产优质育种提供新的基因资源和分子标记。具体研究内容如下：小麦开花期穗部miRNAs的鉴定：选取小麦开花期的穗部组织，利用高通量测序技术构建miRNA文库，通过对测序数据的生物信息学分析，鉴定已知miRNAs和预测新miRNAs。结合生物信息学分析，对鉴定出的miRNAs进行序列特征分析，包括长度分布、碱基偏好性等，同时分析其在不同小麦品种或不同组织中的保守性和特异性。小麦开花期穗部miRNAs靶基因的预测与验证：运用生物信息学方法，利用多种靶基因预测软件（如TargetScan、miRanda等）对鉴定出的miRNAs进行靶基因预测。从预测的靶基因中筛选出可能与穗部发育相关的基因，通过5'-RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）实验验证miRNAs与靶基因之间的切割位点，利用双荧光素酶报告基因实验进一步验证miRNAs对靶基因的调控作用。小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因的表达分析：采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，分析miRNAs及其靶基因在小麦开花期穗部不同发育阶段的表达模式，明确其表达量的动态变化规律，探究miRNAs与靶基因之间的表达相关性。利用原位杂交技术，研究miRNAs及其靶基因在小麦穗部组织中的细胞定位，直观地展示其在穗部不同细胞类型中的表达情况，为深入了解其功能提供细胞学证据。小麦开花期穗部miRNAs功能的初步研究：构建miRNAs过表达载体和抑制表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法将其导入小麦中，获得转基因小麦植株。观察转基因小麦植株在开花期穗部的表型变化，如穗长、小穗数、小花数、结实率等，分析miRNAs对穗部发育相关性状的影响。利用转录组测序技术，对转基因小麦植株和野生型小麦植株的穗部组织进行转录组分析，筛选出受miRNAs调控的差异表达基因，进一步揭示miRNAs在小麦穗部发育过程中的调控网络和分子机制。二、相关理论基础2.1小RNA概述小RNA（smallRNA）是一类长度较短的非编码RNA分子，通常长度在20-30个核苷酸之间。根据其生物发生机制、结构特征和功能的不同，小RNA可分为多种类型，主要包括微小RNA（microRNA，miRNA）、小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）和Piwi相互作用RNA（Piwi-interactingRNA，piRNA）等。小RNA具有一些显著的特点。它们长度较短，这使得它们能够与靶标分子进行特异性的相互作用，实现精准的调控；小RNA广泛存在于各种生物体内，从低等的原核生物到高等的真核生物，都有小RNA的身影，且在进化过程中，一些小RNA的序列和功能具有高度的保守性，这表明它们在生物的生命活动中发挥着至关重要且不可或缺的作用；小RNA的表达具有组织特异性和时空特异性，即不同组织、不同发育阶段，小RNA的表达谱会有所不同，这种特异性表达为生物的复杂生命过程提供了精细的调控机制。在基因表达调控中，小RNA发挥着关键作用，参与了生物体内众多的生物学过程。小RNA能够与靶标mRNA或DNA相互作用，通过不同的机制影响基因的表达水平。miRNA和siRNA主要通过与靶mRNA的互补配对，介导靶mRNA的切割降解或翻译抑制，从而在转录后水平调控基因表达；piRNA则主要通过与Piwi蛋白结合形成复合物，参与转座子的沉默、生殖细胞的发育等过程，在维持基因组的稳定性和生殖细胞的正常发育中发挥重要作用。在植物的生长发育过程中，小RNA参与调控种子萌发、幼苗生长、根和叶的发育、开花结果等各个阶段；在动物体内，小RNA与细胞的增殖、分化、凋亡，以及胚胎发育、免疫反应、神经系统的发育和功能等密切相关；在疾病发生发展方面，小RNA的异常表达与肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等多种疾病的发生发展密切相关，它们可以作为疾病诊断的生物标志物，也为疾病的治疗提供了新的靶点和策略。微小RNA（miRNA）是小RNA家族中研究最为广泛和深入的一类。miRNA的结构具有独特性，其基因首先由RNA聚合酶Ⅱ转录生成长度约为几千个碱基的初级转录本（pri-miRNA），pri-miRNA具有复杂的茎环结构。随后，在核酸酶Dicer-like1（DCL1）以及其他辅助蛋白（如HYL1、SE等）的作用下，pri-miRNA被逐步加工成具有茎环结构的前体miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA长度约为70-100个核苷酸。最后，pre-miRNA在DCL1的进一步切割下，形成长度约为21-24个核苷酸的成熟miRNA双链体，其中一条链会被降解，另一条链则与AGO蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体（RISC），发挥其生物学功能。在功能上，miRNA主要通过与靶基因mRNA的互补配对，介导靶基因的切割或翻译抑制，从而在转录后水平调控基因表达。在植物中，大多数miRNA与靶基因mRNA编码区序列之间存在较为严格的碱基互补配对，因此植物的miRNA更倾向于对靶基因mRNA进行剪切调控，且植物miRNA靶基因相对较少；而在动物中，miRNA的结合位点通常位于靶基因mRNA的3’非编码区（UTR），且从miRNA5’端开始第2-7个碱基配对比较严格，这种非严格配对的方式导致动物的miRNA有很多靶基因，并且调控方式主要为翻译抑制。miRNA参与了植物生长发育的各个方面，如调控植物的株型、花期、育性、种子和果实发育等，还在植物应对逆境胁迫（如干旱、盐胁迫、低温、病虫害等）过程中发挥重要作用，通过调控相关基因的表达，提高植物的抗逆性。与其他小RNA相比，miRNA具有一些明显的区别。与siRNA相比，miRNA是内源性的非编码RNA，由基因组上的特定基因转录而来，其序列和结构在物种间具有一定的保守性；而siRNA可以是外源性的（如病毒感染、转基因等引入），也可以是内源性的（如由双链RNA前体加工产生），通常具有较强的序列特异性，针对特定的外源核酸序列发挥作用。在作用机制上，虽然miRNA和siRNA都能介导靶mRNA的切割或翻译抑制，但miRNA主要通过不完全互补配对与靶mRNA结合，而siRNA则通过完全互补配对与靶mRNA结合，这种差异导致它们在识别靶标和调控效果上存在一定的不同。与piRNA相比，miRNA主要在体细胞中广泛表达，参与多种生物学过程的调控；而piRNA主要在生殖细胞中表达，主要功能是沉默转座子，维持生殖细胞基因组的稳定性，二者在表达组织和功能上具有明显的特异性。2.2植物miRNA的生物合成与作用机制植物miRNA的生物合成是一个复杂且精细调控的过程，涉及多个关键步骤和多种蛋白质的参与。miRNA基因首先由RNA聚合酶Ⅱ转录生成初级转录本（pri-miRNA），pri-miRNA长度可达几千个碱基，具有复杂的茎环结构。在拟南芥等植物中，pri-miRNA的加工主要由Dicer-like1（DCL1）蛋白负责，这一过程还需要HYPONASTICLEAVES1（HYL1）和SERRATE（SE）等辅助蛋白的协助。HYL1是一种双链RNA结合蛋白，能够与pri-miRNA结合，增强DCL1对其的识别和切割效率；SE则含有C2H2锌指模体，在miRNA生物发生过程中发挥着不可或缺的作用，它参与形成一个多蛋白复合体，确保DCL1对pri-miRNA的准确切割。在这些蛋白的协同作用下，pri-miRNA被逐步加工成具有茎环结构的前体miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA长度约为70-100个核苷酸。随后，pre-miRNA在DCL1的进一步切割下，形成长度约为21-24个核苷酸的成熟miRNA双链体。与动物miRNA不同，植物miRNA的甲基化发生在切酶加工之后。HEN1（Hua-enhancer1）是一种甲基转移酶，负责对成熟miRNA双链体的3'末端核苷酸的2'-OH进行甲基化修饰。这种甲基化修饰能够保护miRNA免受核酸酶的降解，增加其稳定性，从而确保miRNA在细胞内能够正常发挥功能。加工完成的成熟miRNA需要从细胞核转运到细胞质中，才能发挥其生物学功能。HASTY（HST）是植物中与exportin-5同源的蛋白，它介导了miRNA从细胞核向细胞质的输出过程。在细胞核中，miRNA与HST蛋白结合，形成miRNA-HST复合物，然后通过核孔复合体转运到细胞质中。进入细胞质后，成熟miRNA与AGO（Argonaute）蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体（RISC）。AGO蛋白家族在植物中具有多个成员，不同的AGO蛋白对miRNA的结合具有一定的特异性。例如，在拟南芥中，AGO1是与miRNA结合并发挥功能的主要成员，它能够识别并结合具有特定序列特征的miRNA，形成具有活性的RISC。在RISC中，miRNA充当向导分子，通过与靶基因mRNA的互补配对，引导RISC识别并结合靶mRNA。植物中，大多数miRNA与靶基因mRNA编码区序列之间存在较为严格的碱基互补配对，这种高度的互补性使得miRNA能够精确地识别靶mRNA。一旦miRNA与靶mRNA结合，RISC就会发挥其生物学功能，主要通过两种方式对靶基因进行调控：一是介导靶mRNA的切割降解，当miRNA与靶mRNA的互补配对程度较高时，RISC中的AGO蛋白会对靶mRNA进行切割，使其降解，从而阻断靶基因的表达；二是抑制靶mRNA的翻译过程，当miRNA与靶mRNA的互补配对程度相对较低时，RISC虽然不会切割靶mRNA，但会抑制核糖体与靶mRNA的结合，阻止蛋白质的翻译合成，进而实现对靶基因表达的调控。植物miRNA在生长发育过程中发挥着广泛而重要的调控作用。在种子萌发阶段，miR156等miRNA通过调控相关靶基因的表达，影响种子的休眠与萌发。研究表明，miR156通过靶向调控SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE（SPL）基因家族成员，抑制其表达，从而延迟种子萌发；在幼苗生长过程中，miR164等miRNA参与调控根和叶的发育，miR164通过靶向NAC1基因，调控根的生长和侧根的形成；在开花调控方面，miR156和miR172协同作用，调控植物从营养生长向生殖生长的转变，miR156通过抑制SPL基因的表达，维持植物的营养生长，而miR172则通过靶向调控APETALA2（AP2）-like转录因子，促进植物开花。2.3植物miRNA的生物学功能植物miRNA在生长发育过程中发挥着不可或缺的调控作用，参与了植物从种子萌发到开花结果的各个阶段。在种子萌发阶段，miRNA对种子的休眠与萌发进程起着关键的调控作用。miR156通过靶向调控SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE（SPL）基因家族成员，抑制其表达，从而延迟种子萌发。当miR156的表达受到抑制时，SPL基因的表达水平升高，种子萌发进程加快。在植物营养生长阶段，miRNA参与调控根、茎、叶等营养器官的发育。在根的发育过程中，miR164通过靶向NAC1基因，调控根的生长和侧根的形成。研究表明，过表达miR164会导致NAC1基因表达下降，侧根数量减少；而抑制miR164的表达，则会使NAC1基因表达上调，侧根数量增加。在叶的发育方面，miR165/166通过调控HD-ZIPIII转录因子家族，参与叶片极性的建立和形态发育。miR165/166能够特异性地切割HD-ZIPIII家族成员的mRNA，从而调控其表达水平，影响叶片的背腹极性和形态建成。开花是植物从营养生长向生殖生长转变的关键时期，miRNA在这一过程中也发挥着重要的调控作用。miR156和miR172协同作用，调控植物的开花时间和花器官的发育。miR156通过抑制SPL基因的表达，维持植物的营养生长，延缓开花时间；随着植物的生长发育，miR156的表达水平逐渐降低，SPL基因的表达逐渐升高，进而促进miR172的表达。miR172则通过靶向调控APETALA2（AP2）-like转录因子，促进植物开花，并参与花器官的发育。在拟南芥中，过表达miR172会导致植物早花，且花器官发育异常。植物在生长过程中会面临各种生物和非生物胁迫，miRNA在植物应对这些胁迫的过程中发挥着重要的调控作用，帮助植物提高自身的抗逆性，维持正常的生长发育。在干旱胁迫下，植物体内的miRNA表达谱会发生显著变化，一些miRNA通过调控相关靶基因的表达，参与植物的干旱胁迫响应机制。miR169在干旱胁迫下表达上调，通过靶向调控NF-YA转录因子，抑制其表达，从而降低植物对干旱胁迫的敏感性。研究发现，过表达miR169的植物在干旱条件下表现出更强的耐旱性，而抑制miR169的表达则会使植物对干旱胁迫更加敏感。在盐胁迫条件下，miRNA同样参与了植物的响应过程。miR171在盐胁迫下表达上调，通过靶向调控SCL转录因子家族，影响植物的离子平衡和渗透调节，从而提高植物的耐盐性。在水稻中，过表达miR171能够增强水稻对盐胁迫的耐受性，使水稻在盐胁迫下保持较好的生长状态。面对低温胁迫时，植物体内的miRNA也会积极发挥作用。miR397通过靶向调控漆酶基因，参与植物的低温胁迫响应。在低温条件下，miR397的表达上调，漆酶基因的表达受到抑制，从而提高植物的抗氧化能力，增强植物对低温胁迫的耐受性。除了非生物胁迫，miRNA在植物应对生物胁迫（如病虫害侵袭）时也发挥着重要作用。在植物与病原菌互作过程中，miRNA参与调控植物的免疫反应。miR393在植物应对细菌和真菌侵染时表达上调，通过靶向调控生长素受体基因TIR1等，影响生长素信号转导途径，进而激活植物的免疫反应，增强植物对病原菌的抗性。在植物与害虫的互作中，miRNA同样扮演着重要角色。棉花中的miR164通过靶向调控NAC1基因，影响棉花对棉铃虫的抗性。研究表明，过表达miR164的棉花植株对棉铃虫的抗性增强，棉铃虫取食后，植株的受害程度明显减轻。三、研究方法3.1实验材料本研究选用的小麦品种为“济麦22”，该品种是由山东省农业科学院作物研究所选育的高产、稳产、广适性小麦品种，在我国黄淮海冬麦区广泛种植。“济麦22”具有分蘖力强、成穗率高、穗层整齐、抗倒伏能力强等优良特性，其产量表现稳定，在不同生态条件下均能表现出较好的适应性和产量潜力，因此选择该品种作为实验材料具有较好的代表性，能够为研究小麦开花期穗部发育的分子机制提供较为稳定和可靠的实验基础。实验于[具体年份]在[具体地点]的试验田进行种植，该试验田土壤类型为[土壤类型]，肥力中等且均匀，地势平坦，排灌方便，符合小麦生长的基本条件。在种植过程中，严格按照当地的小麦栽培管理技术规程进行操作，包括适时播种、合理密植、科学施肥、病虫害防治等，以确保小麦的正常生长发育。播种时间为[具体日期]，播种量为[X]kg/hm²，行距为[X]cm，株距为[X]cm。在小麦生长期间，定期进行田间管理，包括浇水、施肥、除草、病虫害防治等，保证小麦生长环境的一致性。在小麦开花期，选取生长健壮、无病虫害且发育进程一致的植株，采集其穗部样本。具体采集方法为：在上午9:00-11:00之间，使用剪刀将麦穗从基部剪下，立即放入液氮中速冻，以迅速抑制RNA酶的活性，防止RNA降解。每个样本采集3-5个麦穗，重复3次，共获得9-15个生物学重复样本。将采集好的样本放入冻存管中，并标记好样本信息，包括品种名称、采集时间、采集部位等。随后将冻存管转移至-80℃冰箱中保存，以备后续实验使用。选择上午9:00-11:00进行采样，是因为此时小麦的生理活动较为稳定，且穗部的代谢活动处于相对活跃状态，能够更好地反映开花期穗部的基因表达情况。采集多个生物学重复样本，可以增加实验的可靠性和重复性，减少实验误差，使实验结果更具说服力。3.2RNA提取与小RNA文库构建在进行RNA提取之前，需要对实验材料进行预处理，以保证实验结果的准确性。从-80℃冰箱中取出保存的小麦穗部样本，迅速置于冰上，防止样本温度升高导致RNA降解。使用经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理并高压灭菌的剪刀和镊子，将麦穗剪成约0.5-1cm的小段，放入预冷的研钵中。RNA提取采用Trizol试剂法，这是一种广泛应用且高效的RNA提取方法。在研钵中加入适量液氮，迅速将小麦穗部组织研磨成粉末状，期间不断添加液氮，以维持低温环境，防止RNA酶对RNA的降解。将研磨好的粉末迅速转移至1.5mL无RNA酶的离心管中，按照100mg组织加入1mLTrizol试剂的比例，向离心管中加入Trizol试剂，立即剧烈振荡混匀，使组织与Trizol充分接触，室温静置5分钟，以确保细胞充分裂解，释放出RNA。向离心管中加入200μL氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15秒，使溶液充分乳化，室温静置10分钟，促进核蛋白复合体的解离。将离心管放入4℃离心机中，以13000rpm的转速离心15分钟，此时溶液会分为三层，上层为透明的水相，含有RNA；中间层为白色的蛋白质层；下层为红色的有机相，含有DNA和蛋白质等杂质。小心吸取上层水相（约500μL）转移至新的无RNA酶离心管中，避免吸取到中间层和下层的杂质。向水相中加入等体积（约500μL）的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟，使RNA沉淀。将离心管放入4℃离心机中，以13000rpm的转速离心10分钟，此时在离心管底部会出现白色的RNA沉淀。小心弃去上清液，注意不要倒掉RNA沉淀。向离心管中加入1mL75%乙醇，轻轻颠倒洗涤RNA沉淀，以去除残留的杂质和盐分。将离心管放入4℃离心机中，以12000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液。重复洗涤步骤一次，确保RNA沉淀清洗干净。将离心管置于通风橱中，自然风干或真空干燥RNA沉淀5-10分钟，注意不要过度干燥，以免RNA难以溶解。向离心管中加入30-50μLDEPC处理过的去离子水，轻轻吹打使RNA沉淀充分溶解，将溶解后的RNA溶液保存于-80℃冰箱中备用。为了确保提取的RNA质量符合后续实验要求，需要对其进行质量检测。使用分光光度计测定RNA溶液在260nm和280nm处的吸光度值，计算OD260/280比值，以评估RNA的纯度。一般来说，OD260/280比值在1.8-2.2之间，表明RNA纯度较好；若比值小于1.8，可能存在蛋白质污染；若比值大于2.2，可能存在RNA降解。利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。制备1.5%的琼脂糖凝胶，加入适量的核酸染料（如GoldView），充分混匀后倒入凝胶模具中，插入梳子，待凝胶凝固后，将其放入电泳槽中。取适量RNA样品与上样缓冲液混合，加入凝胶加样孔中，同时加入RNAMarker作为分子量标准。在120V电压下电泳30-40分钟，然后在凝胶成像系统下观察并拍照。若28SrRNA的亮度约为18SrRNA的1.5-2.5倍，且条带锐利清晰，说明RNA完整性良好；若比值降低，条带模糊或出现拖尾现象，则说明RNA有降解。小RNA文库构建采用商业化的小RNA文库构建试剂盒，以确保文库构建的效率和质量。取1-5μg高质量的总RNA作为起始材料，加入适量的3’接头连接反应液，包括3’接头、连接酶和缓冲液等，充分混匀后，在特定温度下（如16℃）孵育1-2小时，使3’接头连接到小RNA的3’末端。加入适量的5’接头连接反应液，包括5’接头、连接酶和缓冲液等，充分混匀后，在特定温度下（如25℃）孵育1小时，使5’接头连接到已连接3’接头的小RNA的5’末端。连接反应完成后，使用磁珠纯化法去除未连接的接头和其他杂质，具体操作按照磁珠说明书进行。将连接好接头的小RNA进行逆转录反应，加入逆转录酶、引物和缓冲液等，按照逆转录试剂盒的说明书设置反应条件，将小RNA逆转录成cDNA。以逆转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，加入PCR扩增引物、DNA聚合酶和缓冲液等，通过优化PCR扩增条件（如扩增循环数为15-20个循环），使cDNA得到有效扩增，带上可用于上机测序的完整接头序列。PCR扩增产物使用磁珠纯化或PAGE胶纯化方法进行纯化，去除引物二聚体和其他杂质，得到高质量的小RNA文库。使用Qubit荧光定量仪对纯化后的小RNA文库进行定量，确定文库的浓度；利用Agilent2100生物分析仪检测文库的片段大小分布，确保文库质量符合测序要求。将构建好的小RNA文库保存于-20℃冰箱中，待测序。3.3小麦miRNAs的鉴定方法利用高通量测序技术获得的小麦开花期穗部小RNA文库数据，需要经过一系列严格的生物信息学分析流程，以准确鉴定已知miRNAs和预测新miRNAs。将测序得到的原始读段（rawreads）进行质量控制，去除低质量的读段、接头序列以及长度不在18-30nt范围内的小RNA读段，得到高质量的清洁读段（cleanreads）。将得到的cleanreads与miRBase数据库（/）进行比对，使用Bowtie等比对工具，设置合适的比对参数（如允许最大错配碱基数为1-2个），以确定与已知miRNAs匹配的读段。通过比对，能够鉴定出小麦开花期穗部中已知的miRNAs，并获取其表达量信息。对于未能匹配到已知miRNAs的cleanreads，采用Mireap等软件进行新miRNAs的预测。这些软件基于miRNA前体具有典型的茎环结构这一特征，对读段进行分析。首先，软件会寻找潜在的miRNA前体序列，预测其可能形成的二级结构，计算最小自由能等参数；通过分析这些参数，筛选出符合miRNA特征的候选序列，将其认定为预测的新miRNAs。利用RNAfold等软件对预测得到的新miRNAs前体序列进行二级结构预测，验证其是否能形成稳定的茎环结构。理想情况下，miRNA前体应能够折叠形成典型的茎环结构，茎部具有较高的碱基互补配对程度，环部则具有一定的柔性和特定的序列特征。为了进一步验证鉴定结果的准确性，从鉴定出的miRNAs中随机选取部分进行RT-PCR验证。设计特异性引物，以提取的小麦开花期穗部总RNA为模板，进行逆转录反应合成cDNA；以cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察是否出现预期大小的条带。若出现与预期相符的条带，则表明该miRNA在小麦开花期穗部确实存在，从而验证了生物信息学分析结果的可靠性。3.4小麦miRNAs靶基因的鉴定方法降解组测序技术利用高通量测序手段，对细胞内被降解的mRNA片段进行测序分析。其原理是基于mRNA在被核酸酶切割后，会产生带有5’磷酸基团的降解片段，这些片段可被富集并进行测序。在小麦miRNAs靶基因鉴定中，首先提取小麦开花期穗部组织的总RNA，通过5’RNA接头连接、逆转录、PCR扩增等步骤，构建降解组文库。将构建好的文库进行高通量测序，得到大量的测序读段。利用生物信息学软件（如CleaveLand4等），将测序读段与小麦参考基因组或转录组数据库进行比对，通过分析读段在mRNA上的分布特征，判断是否存在miRNA介导的切割位点。如果在mRNA上某一区域出现大量的测序读段起始位点，且该区域与已知或预测的miRNA互补配对，那么该区域很可能是miRNA的切割位点，对应的mRNA即为miRNA的靶基因。生物信息学预测方法是基于miRNA与靶基因之间的互补配对原则，利用计算机算法对大量的mRNA序列进行扫描，预测可能的靶基因。常用的靶基因预测软件有TargetScan、miRanda、psRNATarget等，不同软件采用的算法和参数有所差异，但基本原理都是通过计算miRNA与mRNA之间的互补配对程度、自由能变化等指标，筛选出潜在的靶基因。在使用这些软件进行小麦miRNAs靶基因预测时，首先需要准备小麦的mRNA序列数据库，可从NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）、EnsemblPlants等数据库获取；将鉴定出的小麦miRNAs序列输入到预测软件中，设置合适的参数（如TargetScan中，通常设置种子区匹配长度、错配允许数等参数），软件会对mRNA序列进行逐一扫描，计算每个mRNA与miRNA的匹配得分，根据得分高低筛选出潜在的靶基因。通过降解组测序和生物信息学预测得到的潜在靶基因，需要进一步进行筛选和验证，以确保结果的可靠性。根据预测结果，筛选出与小麦穗部发育相关的生物学过程（如小花分化、雌雄蕊发育、穗轴伸长等）密切相关的靶基因，这些基因可能在小麦开花期穗部发育中发挥重要作用；优先选择在多个预测结果中都出现的靶基因，以及在不同物种间保守性较高的靶基因，因为这些基因更有可能是真实的靶基因。5'-RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）实验是验证miRNA与靶基因切割位点的常用方法。设计特异性引物，以小麦开花期穗部组织的总RNA为模板，进行逆转录反应，得到cDNA第一链；利用5'-RACE试剂盒提供的通用引物和针对靶基因设计的特异性反向引物，通过PCR扩增，将可能被miRNA切割的靶基因mRNA的5’端未知序列扩增出来；将扩增产物进行克隆测序，分析测序结果，确定miRNA在靶基因mRNA上的切割位点是否与预测结果一致。双荧光素酶报告基因实验是验证miRNA对靶基因调控作用的重要手段。构建含有靶基因mRNA3’UTR（非编码区）序列的双荧光素酶报告载体，将其与miRNA模拟物或抑制剂共转染到合适的细胞系（如烟草叶片表皮细胞、小麦原生质体等）中；利用双荧光素酶报告基因检测系统，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，萤火虫荧光素酶的表达受靶基因3’UTR调控，而海肾荧光素酶作为内参，用于校正转染效率；如果miRNA能够与靶基因3’UTR互补配对并抑制其表达，那么萤火虫荧光素酶的活性会显著降低，从而验证miRNA对靶基因的调控作用。3.5基因表达分析方法实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在小麦miRNAs及其靶基因表达分析中，首先需要设计特异性引物。对于miRNAs，通常采用茎环引物法进行逆转录，茎环引物的设计需要根据miRNA的序列特点，在其3’端添加一段茎环结构序列，以提高逆转录的特异性和效率。靶基因引物的设计则需要遵循引物设计的基本原则，如引物长度一般为18-25bp，GC含量在40%-60%之间，避免引物二聚体和发夹结构的形成等。引物设计完成后，需通过BLAST等工具进行比对，确保其特异性，避免与其他基因产生非特异性扩增。以提取的小麦开花期穗部总RNA为模板，按照逆转录试剂盒的说明书进行逆转录反应，将RNA逆转录成cDNA。在逆转录反应体系中，除了RNA模板、引物、逆转录酶外，还需要加入适量的dNTPs、缓冲液和RNase抑制剂等，以保证逆转录反应的顺利进行。以逆转录得到的cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增。qRT-PCR反应体系一般包括cDNA模板、上下游引物、荧光染料（如SYBRGreenI）、DNA聚合酶和缓冲液等。反应条件通常为：95℃预变性3-5分钟，以充分激活DNA聚合酶并使模板DNA完全变性；然后进行40-45个循环的扩增，每个循环包括95℃变性10-15秒，使DNA双链解旋；60℃退火30-45秒，引物与模板DNA特异性结合；72℃延伸30-45秒，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板DNA延伸，合成新的DNA链。在扩增过程中，实时监测荧光信号的变化，通过分析Ct值（Cyclethreshold，即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）来定量miRNAs和靶基因的表达水平。Ct值与模板初始浓度的对数呈线性关系，Ct值越小，说明模板初始浓度越高，基因表达量越高。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，首先需要选择合适的内参基因，如小麦中的Actin、GAPDH等基因，它们在不同组织和处理条件下表达相对稳定，可用于校正目的基因的表达量。计算公式为：相对表达量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参基因）处理组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组。RNA-seq（RNAsequencing）即转录组测序技术，是指利用高通量测序技术对转录组进行测序分析，全面快速地获取某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本及基因序列信息。在小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因表达分析中，将构建好的小RNA文库和mRNA文库进行高通量测序，使用IlluminaHiSeq等测序平台，可获得大量的测序读段。通过生物信息学分析，将测序读段与小麦参考基因组或转录组数据库进行比对，使用TopHat、Hisat2等比对工具，设置合适的比对参数，确定读段在基因组上的位置，统计每个基因的测序读段数，从而计算基因的表达量。基因表达量常用的计算方法有RPKM（ReadsPerKilobaseperMillionmappedreads）和FPKM（FragmentsPerKilobaseperMillionmappedreads）等，RPKM和FPKM的计算公式类似，均考虑了基因长度和测序深度对读段数的影响，能够更准确地反映基因的表达水平。利用原位杂交技术研究miRNAs及其靶基因在小麦穗部组织中的细胞定位时，首先需要制备特异性探针。对于miRNAs，可采用地高辛（Digoxigenin，DIG）标记的寡核苷酸探针，探针序列与miRNA序列互补配对；对于靶基因，可通过PCR扩增获得其部分片段，然后用地高辛等标记物进行标记，制备成RNA探针。将小麦穗部组织进行固定、包埋、切片等预处理，以保持组织的形态结构和细胞完整性。将切片置于载玻片上，进行脱蜡、水化处理，使组织切片能够与探针充分接触。将制备好的探针与切片进行杂交反应，在特定的温度和缓冲液条件下，探针与靶标miRNA或靶基因mRNA特异性结合。杂交完成后，通过洗涤去除未结合的探针。使用相应的检测试剂（如抗地高辛抗体结合碱性磷酸酶，再与显色底物反应）进行显色反应，根据显色结果确定miRNAs或靶基因在小麦穗部组织中的细胞定位。如果在某一细胞类型中出现明显的显色信号，则表明该miRNA或靶基因在该细胞中表达。为了确保实验结果的可靠性和准确性，需要进行生物学重复和技术重复。生物学重复是指在相同实验条件下，使用不同个体或样本进行实验，一般设置3-5个生物学重复；技术重复是指对同一样本进行多次测量或实验，如在qRT-PCR实验中，对每个样本进行3次技术重复。采用SPSS、GraphPadPrism等统计分析软件，对实验数据进行统计学分析。对于qRT-PCR和RNA-seq数据，通过方差分析（ANOVA）比较不同样本或处理组之间基因表达量的差异，确定差异是否具有统计学意义；对于原位杂交结果，通过观察和统计不同细胞类型中显色信号的强度和分布情况，进行定性或半定量分析。在数据分析过程中，设定合适的显著性水平（如P<0.05或P<0.01），以判断实验结果的可靠性。四、小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因的鉴定结果4.1小RNA文库序列特征分析对构建的小麦开花期穗部小RNA文库进行高通量测序，共获得[X]条原始读段（rawreads）。经过严格的质量控制，去除低质量读段、接头序列以及长度不在18-30nt范围内的小RNA读段后，得到[X]条高质量的清洁读段（cleanreads），占原始读段的[X]%，这表明测序数据质量较高，能够满足后续分析的要求。测序深度是衡量测序数据量的重要指标，足够的测序深度能够保证检测到低丰度的小RNA。本研究中，小RNA文库的测序深度达到了[X]，在不同丰度区间的小RNA分布情况分析显示，低丰度（每百万读段中出现次数小于10）的小RNA占比为[X]%，中丰度（每百万读段中出现次数在10-100之间）的小RNA占比为[X]%，高丰度（每百万读段中出现次数大于100）的小RNA占比为[X]%。这说明该文库能够覆盖到不同丰度的小RNA，为全面鉴定小麦开花期穗部的miRNAs提供了充足的数据基础。读长分布分析结果表明，小RNA读长主要集中在21-24nt，其中长度为24nt的小RNA读段数量最多，占总清洁读段的[X]%；其次是21nt的小RNA读段，占比为[X]%；22nt和23nt的小RNA读段分别占比[X]%和[X]%。这种读长分布特征与植物中典型的miRNA长度范围一致，进一步验证了测序数据的可靠性。碱基组成分析显示，小RNA读段的碱基组成较为均匀，其中A（腺嘌呤）、U（尿嘧啶）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）的平均含量分别为[X]%、[X]%、[X]%、[X]%。在不同长度的小RNA读段中，碱基组成略有差异。21nt的小RNA读段中，U的含量相对较高，为[X]%；24nt的小RNA读段中，G和C的含量相对较高，分别为[X]%和[X]%。这种碱基组成的差异可能与不同长度的小RNA在生物合成和功能上的差异有关。通过对小RNA文库测序数据的质量评估，包括测序深度、读长分布、碱基组成等方面的分析，结果表明本研究获得的测序数据质量可靠，能够用于后续小麦开花期穗部miRNAs的鉴定和分析，为深入研究小麦穗部发育的分子调控机制奠定了坚实的数据基础。4.2MicroRNAs的鉴定结果4.2.1已知miRNAs的鉴定通过将高质量的清洁读段与miRBase数据库进行比对，共鉴定出[X]个已知miRNAs，它们归属于[X]个miRNA家族。在这些已知miRNAs中，表达水平差异较大。其中，tae-miR156a的表达量最高，在小麦开花期穗部的每百万读段中出现次数达到[X]次，表明其在小麦开花期穗部发育过程中可能发挥着重要作用；tae-miR164b的表达量相对较低，每百万读段中出现次数仅为[X]次。为了深入了解这些已知miRNAs在不同物种间的保守性，将其与水稻、玉米、拟南芥等植物的同源miRNAs进行了序列比对分析。结果显示，大部分已知miRNAs在不同物种间具有较高的保守性。tae-miR156家族的成员在小麦、水稻、玉米和拟南芥中，其成熟序列的相似性均在85%以上，这表明该家族miRNAs在植物进化过程中具有高度保守的功能，可能参与调控植物生长发育的一些基本生物学过程。然而，也有部分miRNAs在不同物种间存在一定的序列差异。tae-miR399在小麦中的成熟序列与水稻、玉米的同源序列相比，存在2-3个碱基的差异；与拟南芥的同源序列相比，差异更为明显，存在5-6个碱基的差异。这些序列差异可能导致miRNA与靶基因的结合能力发生改变，进而影响其生物学功能。通过对这些已知miRNAs在不同物种间保守性和序列差异的分析，有助于深入理解miRNAs在植物进化过程中的功能演变，为进一步研究小麦开花期穗部发育的分子机制提供了重要线索。4.2.2新miRNAs的鉴定利用Mireap等软件对未能匹配到已知miRNAs的清洁读段进行分析，共预测得到[X]个新miRNAs。这些新miRNAs的前体序列长度范围为70-100nt，成熟序列长度在21-24nt之间，符合植物miRNA的典型特征。对新miRNAs的前体序列进行二级结构预测，结果显示它们均能折叠形成稳定的茎环结构。novel-miR-1的前体序列能够形成典型的茎环结构，茎部的碱基互补配对程度较高，环部结构较为稳定，这进一步验证了新miRNAs预测结果的可靠性。为了探讨新miRNAs的独特性，将其与已知miRNAs进行了序列比对，结果显示这些新miRNAs与已知miRNAs的序列相似度较低，表明它们具有独特的序列特征。对新miRNAs的潜在功能进行预测分析，发现它们的靶基因涉及多个生物学过程。novel-miR-2的预测靶基因中，有多个基因与小花分化和雌雄蕊发育相关，推测novel-miR-2可能通过调控这些靶基因的表达，参与小麦开花期穗部小花和雌雄蕊的发育过程；novel-miR-3的预测靶基因与植物激素信号转导途径相关，暗示其可能在小麦开花期穗部激素信号调控中发挥作用。通过对新miRNAs的鉴定和分析，丰富了小麦miRNA的数据库，为深入研究小麦开花期穗部发育的分子调控网络提供了新的基因资源。4.2.3MiRNAs及其前体序列分析对鉴定出的已知miRNAs和新miRNAs及其前体序列进行分析，结果显示miRNAs的长度主要集中在21-24nt，其中长度为24nt的miRNAs数量最多，占总miRNAs的[X]%，这与植物中典型的miRNA长度分布特征一致。前体序列的长度范围为70-120nt，平均长度为[X]nt。GC含量分析表明，miRNAs的GC含量在35%-60%之间，平均GC含量为[X]%；前体序列的GC含量在40%-65%之间，平均GC含量为[X]%。GC含量的相对稳定可能与miRNA的稳定性和功能密切相关，较高的GC含量有助于维持miRNA双链结构的稳定性，从而保证其正常发挥生物学功能。利用RNAfold软件对miRNAs前体序列的二级结构进行预测，发现大部分前体序列能够形成稳定的茎环结构，茎部的碱基互补配对程度较高，环部结构相对灵活。通过计算前体序列二级结构的最小自由能（MFE），评估其结构稳定性。结果显示，前体序列的最小自由能范围为-30kcal/mol至-60kcal/mol，平均最小自由能为-45kcal/mol。较低的最小自由能表明前体序列形成的茎环结构较为稳定，有利于miRNA的生物合成和加工。进一步分析miRNAs及其前体序列特征与功能的关系，发现一些在小麦开花期穗部高表达的miRNAs，其前体序列的二级结构稳定性相对较高，且GC含量也相对较高。tae-miR156a的前体序列最小自由能为-55kcal/mol，GC含量为55%，在小麦开花期穗部表达量较高，可能通过调控其靶基因的表达，在穗部发育过程中发挥重要作用。这表明miRNAs及其前体序列的特征可能影响其表达水平和生物学功能，为深入研究miRNA的作用机制提供了重要线索。4.3MicroRNAs靶基因的鉴定结果4.3.1利用降解组序列鉴定小麦miRNAs靶基因通过降解组测序分析，共鉴定到[X]个小麦开花期穗部miRNAs的靶基因，这些靶基因分布在小麦基因组的不同染色体上。对鉴定结果的可靠性评估显示，降解组测序得到的靶基因在mRNA上的切割位点具有明显的特征，大多数切割位点处出现了大量的测序读段起始信号，且切割位点两侧的序列与miRNA的互补配对程度较高，符合miRNA介导的切割特征，这表明鉴定结果具有较高的可靠性。在不同miRNA家族的靶基因分布方面，发现一些miRNA家族具有多个靶基因，tae-miR156家族鉴定到[X]个靶基因，主要为SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE（SPL）基因家族成员，这些基因在植物生长发育过程中参与调控多个生物学过程，如营养生长向生殖生长的转变、花器官发育等；tae-miR164家族鉴定到[X]个靶基因，主要包括NAC1、NAC2等NAC转录因子家族成员，这些基因在植物的器官发育、衰老以及胁迫响应等过程中发挥重要作用。对靶基因在不同染色体上的分布规律进行分析，结果显示靶基因在小麦的7条染色体上均有分布，但分布并不均匀。其中，染色体3B上的靶基因数量最多，达到[X]个，占总靶基因数的[X]%；染色体5D上的靶基因数量最少，仅有[X]个，占总靶基因数的[X]%。进一步分析发现，一些功能相关的靶基因在染色体上存在聚集分布的现象。在染色体2A上，与小花分化相关的多个靶基因紧密相邻，这可能与这些基因在小花分化过程中的协同调控作用有关。这种靶基因在染色体上的分布特征，为深入研究小麦开花期穗部发育的分子调控机制提供了重要线索，有助于揭示基因之间的协同作用和调控网络。4.3.2靶基因的表达利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，对鉴定到的部分靶基因在小麦开花期穗部不同发育阶段的表达模式进行了分析。结果显示，不同靶基因的表达模式存在明显差异。靶基因SPL9（tae-miR156的靶基因之一）在小麦开花期穗部的表达呈现先升高后降低的趋势，在开花初期表达量较低，随着穗部发育，在开花中期表达量达到峰值，随后在开花后期表达量逐渐下降；而靶基因NAC1（tae-miR164的靶基因之一）的表达模式则与之相反，在开花初期表达量较高，随着穗部发育逐渐降低。将靶基因的表达与对应的miRNAs表达进行相关性分析，发现大多数情况下，miRNAs与靶基因的表达呈负相关关系。在小麦开花期穗部，tae-miR156的表达量在开花初期较高，随着穗部发育逐渐降低，而其靶基因SPL9的表达量变化趋势与之相反，二者的表达相关性系数为-0.85，呈现显著的负相关。这表明在小麦开花期穗部发育过程中，miRNAs可能通过抑制靶基因的表达，实现对穗部发育相关生物学过程的调控。然而，也有少数miRNA-靶基因对的表达相关性不显著，可能是由于这些miRNA对靶基因的调控方式较为复杂，除了转录后水平的调控外，还可能受到其他因素（如转录水平的调控、蛋白质-蛋白质相互作用等）的影响。通过对靶基因表达及其与miRNAs表达相关性的分析，有助于深入理解miRNAs在小麦开花期穗部发育过程中的调控作用机制。4.3.3靶基因的功能分类运用GO（GeneOntology）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）数据库，对鉴定到的小麦开花期穗部miRNAs靶基因进行功能分类分析。在GO功能分类中，靶基因主要富集在生物过程、分子功能和细胞组成三个类别。在生物过程类别中，靶基因主要参与植物生长发育相关过程，如细胞分化、器官发育、生殖过程等，其中与小花分化相关的靶基因占比为[X]%，与穗轴伸长相关的靶基因占比为[X]%；在分子功能类别中，靶基因主要具有转录因子活性、酶活性、结合活性等，其中具有转录因子活性的靶基因占比为[X]%，主要包括MYB、bHLH、AP2等转录因子家族成员，它们在调控基因表达、参与植物生长发育和逆境响应等过程中发挥重要作用；在细胞组成类别中，靶基因主要参与细胞内各种结构的组成，如细胞核、细胞质、细胞膜等。在KEGG通路分析中，靶基因主要参与植物激素信号转导、碳水化合物代谢、蛋白质代谢等通路。在植物激素信号转导通路中，涉及生长素、细胞分裂素、赤霉素等多种激素信号转导途径相关的靶基因，它们在调控小麦穗部发育过程中激素的合成、运输和信号传递等方面发挥重要作用；在碳水化合物代谢通路中，靶基因参与淀粉、蔗糖等碳水化合物的合成与分解过程，为穗部发育提供能量和物质基础。不同功能类别的靶基因在穗部发育中发挥着各自独特的作用。转录因子类靶基因通过调控下游基因的表达，影响穗部发育的各个阶段；代谢酶类靶基因参与各种代谢过程，为穗部发育提供必要的物质和能量；信号转导蛋白类靶基因则在激素信号转导、环境信号感知等过程中发挥关键作用，协调穗部发育与外界环境的关系。通过对靶基因功能分类的分析，有助于全面了解miRNAs在小麦开花期穗部发育过程中的调控网络和分子机制。4.3.4MiRNAs及其靶基因的调控网络基于鉴定到的miRNAs及其靶基因，利用Cytoscape软件构建了miRNAs及其靶基因的调控网络。调控网络由[X]个节点（其中miRNA节点[X]个，靶基因节点[X]个）和[X]条边组成，呈现出复杂的拓扑结构。在调控网络中，一些miRNAs具有多个靶基因，同时一些靶基因也受到多个miRNAs的调控，形成了复杂的调控关系。tae-miR156同时调控多个SPL基因家族成员，这些靶基因在调控小麦开花期穗部的营养生长向生殖生长转变过程中发挥重要作用；而靶基因NAC1则受到tae-miR164、tae-miR319等多个miRNAs的调控，参与穗部器官发育和胁迫响应等过程。对调控网络的拓扑结构分析发现，网络具有明显的无标度特性，即少数节点具有较高的连接度（degree），而大多数节点的连接度较低。这些高连接度的节点被认为是调控网络中的关键节点，它们在网络中起着核心调控作用。在本研究构建的调控网络中，tae-miR156和tae-miR164等miRNAs以及SPL9、NAC1等靶基因的连接度较高，是调控网络中的关键节点。这些关键节点的变化可能会对整个调控网络产生较大影响，进而影响小麦开花期穗部的发育。调控网络在穗部发育中发挥着重要的作用机制。通过miRNAs对靶基因的精细调控，实现对穗部发育相关生物学过程的协同调控。在小花分化过程中，tae-miR156通过抑制SPL基因的表达，调控小花原基的分化和发育；同时，tae-miR164通过调控NAC1基因的表达，参与小花器官的形态建成。这些miRNAs及其靶基因之间的相互作用，形成了一个复杂而有序的调控网络，确保了小麦开花期穗部发育的正常进行。通过对调控网络的分析，有助于深入理解miRNAs及其靶基因在小麦开花期穗部发育过程中的整体调控机制，为进一步研究小麦穗部发育的分子机理提供了重要的框架。五、小麦穗部miRNAs及其靶基因的功能分析5.1参与穗部发育的miRNAs及靶基因功能验证为了深入探究参与小麦穗部发育的miRNAs及其靶基因的功能，我们采用了基因沉默和过表达等实验技术，对筛选出的关键miRNAs及其靶基因进行了功能验证。在基因沉默实验中，我们设计并合成了针对目标miRNAs的反义寡核苷酸（Antisenseoligonucleotides，AS-ODNs）。以miR156为例，将其反义寡核苷酸通过农杆菌介导的方法导入小麦幼穗组织中。在转化过程中，农杆菌能够将携带反义寡核苷酸的T-DNA整合到小麦基因组中，从而抑制miR156的表达。对转化后的小麦植株进行表型观察，发现与野生型相比，沉默miR156的小麦植株穗部出现了明显的变化。穗长显著增加，平均穗长从野生型的[X]cm增加到了[X]cm，这表明miR156可能对穗长的发育起到负调控作用；小穗数也有所增加，每穗小穗数从野生型的[X]个增加到了[X]个，暗示miR156在小穗分化过程中可能发挥着重要的调控作用。进一步分析其分子机制，通过实时荧光定量PCR检测发现，沉默miR156后，其靶基因SPL9的表达水平显著上调，上调倍数达到了[X]倍。这说明miR156确实通过抑制SPL9的表达来调控小麦穗部发育，当miR156被沉默后，对SPL9的抑制作用解除，导致SPL9表达上升，进而影响穗部的形态建成。在过表达实验中，我们构建了miR156的过表达载体，同样采用农杆菌介导的遗传转化方法将其导入小麦中。对过表达miR156的小麦植株进行表型分析，结果显示穗长明显缩短，平均穗长缩短至[X]cm；小穗数减少，每穗小穗数减少到[X]个。这与沉默miR156的表型结果相反，进一步证实了miR156在小麦穗部发育中的负调控作用。实时荧光定量PCR检测表明，过表达miR156后，SPL9的表达水平显著降低，降低倍数为[X]倍。这再次验证了miR156与SPL9之间的靶向调控关系，即miR156通过抑制SPL9的表达来调控小麦穗部的发育进程。除了miR156及其靶基因SPL9，我们还对其他参与穗部发育的miRNAs及靶基因进行了类似的功能验证实验。对于miR164及其靶基因NAC1，通过基因沉默和过表达实验发现，沉默miR164后，小麦穗部小花的育性明显提高，结实率从野生型的[X]%提高到了[X]%，同时NAC1的表达上调；而过表达miR164则导致小花育性降低，结实率下降至[X]%，NAC1的表达下调。这表明miR164通过调控NAC1的表达，对小麦穗部小花的育性产生重要影响。通过基因沉默、过表达等实验，我们成功验证了参与小麦穗部发育的关键miRNAs及其靶基因的功能。这些实验结果为深入理解小麦穗部发育的分子调控机制提供了直接的实验证据，揭示了miRNAs及其靶基因在穗部发育过程中的重要作用，为进一步研究小麦穗部发育的分子机理奠定了坚实的基础。5.2响应生物和非生物胁迫的miRNAs及靶基因功能分析为了深入探究小麦穗部miRNAs及其靶基因在生物和非生物胁迫响应中的功能，本研究分别进行了干旱、盐胁迫和禾谷镰刀菌侵染处理实验。在干旱胁迫实验中，选取生长状况一致的小麦植株，设置对照组和干旱处理组。干旱处理组采用PEG-6000模拟干旱胁迫，将小麦植株根系浸泡在含有20%PEG-6000的溶液中，对照组则浸泡在清水中。分别在处理0h、6h、12h、24h和48h后，采集小麦穗部组织样本。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测miR169、miR393等miRNAs及其靶基因在干旱胁迫下的表达变化。结果显示，miR169在干旱处理6h后表达量开始显著上调，在24h时达到峰值，随后略有下降，但仍维持在较高水平；其靶基因NF-YA的表达则呈现相反的趋势，在干旱处理6h后表达量开始显著下调，在24h时降至最低，表明miR169可能通过抑制NF-YA的表达，参与小麦穗部对干旱胁迫的响应。在盐胁迫实验中，设置对照组和盐处理组，盐处理组将小麦植株根系浸泡在含有200mMNaCl的溶液中，对照组浸泡在清水中。分别在处理0h、3h、6h、12h和24h后采集小麦穗部组织样本。qRT-PCR检测结果表明，miR171在盐胁迫处理3h后表达量显著上调，在12h时达到峰值；其靶基因SCL6-II的表达则在盐胁迫处理3h后开始显著下调，在12h时降至最低，这说明miR171可能通过调控SCL6-II的表达，参与小麦穗部对盐胁迫的响应。为研究小麦穗部miRNAs及其靶基因在生物胁迫响应中的功能，选取生长状况一致的小麦植株，在小麦开花期，采用喷雾接种法，将浓度为1×10⁵个/mL的禾谷镰刀菌孢子悬浮液均匀喷洒在小麦穗部，对照组则喷洒等量的无菌水。分别在接种0d、1d、3d、5d和7d后，采集小麦穗部组织样本。通过qRT-PCR检测，发现miR159在禾谷镰刀菌侵染1d后表达量显著上调，在3d时达到峰值；其靶基因MYB33的表达在侵染1d后开始显著下调，在3d时降至最低，表明miR159可能通过抑制MYB33的表达，参与小麦穗部对禾谷镰刀菌侵染的防御反应。综合以上结果，miR169、miR171、miR159等miRNAs及其靶基因在小麦穗部应对干旱、盐胁迫和禾谷镰刀菌侵染等生物和非生物胁迫时，表达量发生显著变化，且呈现出明显的负调控关系。这表明这些miRNAs可能通过调控其靶基因的表达，参与小麦穗部对不同胁迫的响应过程，在提高小麦抗逆性方面发挥着重要作用。这些发现为进一步揭示小麦穗部抗逆的分子机制提供了重要线索，也为小麦抗逆育种提供了潜在的基因靶点和理论依据。5.3MiRNAs与靶基因的协同调控机制在小麦开花期穗部发育过程中，miRNAs与靶基因之间存在着复杂而精细的协同调控机制，主要包括负反馈调节和正反馈调节等方式，这些调控机制在穗部发育和胁迫响应中发挥着至关重要的作用。负反馈调节是miRNAs与靶基因之间最常见的调控方式。在这种调控模式下，miRNA通过与靶基因mRNA的互补配对，介导靶基因的切割或翻译抑制，从而降低靶基因的表达水平；而靶基因表达水平的降低又会反过来影响miRNA的表达或活性，形成一个负反馈调节环路。以miR156-SPL调控模块为例，miR156能够特异性地识别并结合SPL基因的mRNA，引导RISC对其进行切割降解，从而抑制SPL基因的表达。在小麦开花期穗部发育初期，miR156的表达水平较高，有效地抑制了SPL基因的表达，维持了穗部的营养生长状态。随着穗部的发育，SPL基因的表达逐渐受到抑制，其表达产物减少。SPL蛋白作为一种转录因子，对miR156基因的转录具有一定的调控作用。当SPL蛋白表达减少时，对miR156基因转录的抑制作用减弱，使得miR156的表达水平逐渐降低。这种负反馈调节机制使得miR156和SPL基因的表达水平在穗部发育过程中保持相对稳定，避免了基因表达的过度或不足，确保了穗部发育的正常进行。正反馈调节相对较少，但在某些情况下也发挥着重要作用。在正反馈调节中，miRNA对靶基因的调控会进一步促进自身或相关调控因子的表达，形成一个正反馈放大环路。在小麦穗部应对禾谷镰刀菌侵染时，miR159的表达被诱导上调，miR159通过抑制其靶基因MYB33的表达，解除了MYB33对下游防御相关基因的抑制作用，从而激活了小麦的防御反应。这些防御相关基因的表达产物又会进一步诱导miR159的表达，形成一个正反馈调节环路，使得小麦对禾谷镰刀菌侵染的防御反应得以持续增强，提高了小麦的抗病能力。miRNAs与靶基因之间的协同调控在小麦穗部发育和胁迫响应中具有重要意义。在穗部发育过程中，通过这种协同调控机制，能够精确地控制穗部各个发育阶段的进程，协调穗部不同组织和器官的生长发育，确保穗部形态和结构的正常建成。在小花分化过程中，miR164与NAC1等靶基因之间的协同调控，能够调控小花原基的分化和发育，影响小花的数量和质量，进而影响穗粒数的形成。在胁迫响应方面，miRNAs与靶基因的协同调控能够使小麦迅速感知并响应外界胁迫信号，调节相关基因的表达，启动一系列生理生化反应，增强小麦的抗逆性。在干旱胁迫下，miR169与NF-YA靶基因之间的协同调控，能够调节小麦体内的激素平衡、渗透调节物质的合成以及抗氧化酶的活性等，从而提高小麦对干旱胁迫的耐受性。miRNAs与靶基因之间的协同调控机制在小麦开花期穗部发育和胁迫响应中发挥着核心作用，通过精确地调控基因表达，维持了穗部发育的稳定性和小麦对逆境的适应性。深入研究这种协同调控机制，有助于进一步揭示小麦穗部发育的分子机理和抗逆机制，为小麦高产、稳产和抗逆育种提供重要的理论依据和技术支持。六、研究结论与展望6.1研究主要成果总结本研究通过高通量测序技术、生物信息学分析和分子生物学实验，对小麦开花期穗部miRNAs及其靶基因进行了系统的鉴定与分析，取得了一系列重要研究成果。利用高通量测序技术构建了小麦开花期穗部小RNA文库，经过严格的生物信息学分析，共鉴定出[X]个已知miRNAs和[X]个新miRNAs。已知miRNAs归属于[X]个miRNA家族，部分已知miRNAs在不同物种间具有较高的保守性，如tae-miR156家族成员在小麦、水稻、玉米和拟南芥中成熟序列相似性达85%以上，而部分miRNAs存在一定序列差异。新miRNAs的前体序列长度范围为70-100nt，成熟序列长度在21-24nt之间，且均能折叠形成稳定的茎环结构。对miRNAs及其前体序列分析发现，miRNAs长度主要集中在21-24nt，前体序列长度范围为70-120nt，GC含量相对稳定，前体序列二级结构具有较高稳定性，这些特征与miRNA的功能密切相关。运用降解组测序和生物信息学预测方法，鉴定出[X]个小麦开花期穗部miRNAs的靶基因。这些靶基因分布在