液相色谱仪操作规程标准化手册

液相色谱仪操作规程标准化手册一、前言本手册旨在规范高效液相色谱仪（HPLC）的操作流程，确保分析结果的准确性、重复性及仪器的稳定运行，适用于实验室HPLC的日常操作、维护及故障处置。手册涵盖仪器组成、标准化操作、维护保养、故障排查等核心内容，为实验人员提供实操性指导。二、仪器组成及原理概述（一）核心模块功能1.输液泵：提供稳定流速的流动相，支持等度/梯度洗脱，通过流速与洗脱比例控制组分保留行为。2.进样系统：手动/自动进样，将样品引入流动相，需保证进样精度与重复性（RSD≤2%）。3.色谱柱：分离核心，基于分配、吸附等作用实现组分分离，柱效（理论塔板数）、选择性决定分离效果。4.柱温箱：控制色谱柱温度（±0.5℃精度），稳定保留时间与分离度（温度波动会显著影响保留行为）。5.检测器：（如紫外-可见、荧光、蒸发光散射等）将组分浓度转化为电信号，输出色谱图（需定期校准波长/响应值）。6.工作站：控制仪器参数、采集/处理数据、生成报告，需定期备份方法与数据（避免丢失）。三、标准化操作流程（一）开机前准备1.环境与安全检查实验室温度（20-25℃）、湿度（≤60%）稳定，远离强电磁干扰、震源。流动相（甲醇、乙腈、水、缓冲盐等）新鲜（含缓冲盐流动相应≤48h），经0.22μm滤膜过滤、超声脱气（10-15min）。废液瓶液位低于警戒线，电源接地良好，仪器模块无物理损坏。2.色谱柱与管路检查色谱柱保存液与流动相兼容：若柱保存液为纯甲醇（反相柱），流动相含高比例水时，需用10%甲醇水过渡（流速0.2-0.5ml/min，10-20倍柱体积），避免柱床塌陷。管路接头（泵出口、进样器、柱、检测器）旋紧，无漏液痕迹；手动进样针无堵塞、变形。（二）开机与系统启动1.模块开机顺序依次打开泵→柱温箱→检测器→工作站（遵循“先硬件后软件”原则，等待各模块自检完成，指示灯显示“Ready”）。2.工作站参数设置调用/新建方法：设置流动相比例（等度/梯度）、流速（0.5-2ml/min，依柱规格调整）、柱温（常为30-40℃）、检测器波长（或激发/发射波长）、进样体积（手动/自动进样量）。泵参数：设置压力上限（一般≤40MPa），梯度方法需设置时间-比例程序。（三）流动相排气与系统平衡1.泵排气泡打开泵排气阀（或“Purge”功能），设置流速5ml/min，持续1-2min，观察气泡排出后关闭排气阀，等待泵压力稳定（波动≤0.5MPa）。2.色谱柱平衡以初始流动相（方法起始比例）、方法流速的80%冲洗色谱柱，持续10-20min（或至基线稳定：紫外检测器基线噪声≤0.5mAU，漂移≤1mAU/h）。（四）样品分析1.手动进样操作进样针处理：吸取流动相排气泡，吸取过量样品（如进样量20μl，吸30μl），排出多余至刻度。进样：快速将进样阀从“Load”转“Inject”，同时点击工作站“开始采集”，记录进样时间。2.自动进样操作样品盘设置：按序列摆放样品瓶（含内标/质控样），设置进样体积（1-20μl）、洗针次数（避免交叉污染）、进样顺序。启动序列：点击“运行”，监控序列状态（避免样品瓶错位、进样针堵塞）。3.分析监控实时观察压力曲线（波动≤2%方法流速对应的压力）、基线稳定性（无尖锐噪声、漂移）、峰形与保留时间（与对照品一致，RSD≤2%）。异常时立即暂停分析，排查故障（见“故障排查”章节）。（五）关机与后处理1.色谱柱冲洗缓冲盐流动相：先以10%甲醇水（或纯水）冲洗30min（流速0.5ml/min），再以纯甲醇/乙腈冲洗30min（保存反相柱，避免盐析/长菌）。纯有机相流动相：直接以纯甲醇/乙腈冲洗20min，确保柱内无残留。2.仪器关机降低泵流速至0.2ml/min，依次关闭泵→检测器→柱温箱→模块电源，最后关闭工作站、断开总电源。色谱柱两端加盖堵头，放置于柱盒；手动进样针用甲醇冲洗后晾干，自动进样器清洁进样针、样品盘。四、维护保养规范（一）日常维护（每周/每批样品后）1.流动相管理：过滤新配置流动相，弃用超期含缓冲盐流动相，定期更换在线脱气膜。2.进样系统：手动进样针每月甲醇超声清洗，自动进样器每周清洁样品盘、进样针外壁。3.泵维护：每季度检查泵密封垫（漏液时联系工程师更换），每周用异丙醇冲洗泵头（排除缓冲盐结晶）。（二）色谱柱维护（每100针或柱效下降10%时）1.污染清洗：反相柱若保留强组分污染，用5-10%甲醇-水+0.1%甲酸冲洗（流速0.5ml/min，20倍柱体积），再用纯甲醇冲洗。2.保存：柱内充满纯甲醇/乙腈，两端堵头密封，避光、室温保存，避免剧烈震动。（三）检测器维护（每季度）1.紫外灯：记录使用时间（寿命约2000h），能量低于60%时更换。2.流通池：基线噪声大时，用10%硝酸+水（或甲醇）超声清洗流通池（断开管路，注意防护），晾干后装回。五、常见故障排查与解决（一）压力异常压力过高：依次断开色谱柱（压力降为0→柱堵；压力不变→管路/泵堵）。柱堵时，低流速反向冲洗（若柱允许）；管路堵时，更换滤芯、清洗单向阀。压力过低：检查接头漏液（旋紧/换密封垫）、泵密封垫老化（更换）、流动相不足（补充）。（二）基线异常噪声大：检查灯能量（更换紫外灯）、流通池污染（清洗）、电源干扰（远离大功率设备）。漂移大：流动相污染（更换）、柱温波动（校准柱温箱）、检测器氘灯老化（更换）。（三）峰形/保留时间异常峰拖尾：柱污染（清洗）、进样量过大（减小）、流动相pH不适（调整缓冲盐pH）。保留时间漂移：流动相比例变化（重新配置）、柱温变化（校准）、泵流速不稳（排气泡、换泵密封垫）。六、安全与质量控制注意事项（一）安全操作有机溶剂（甲醇、乙腈）需在通风橱操作，佩戴丁腈手套，避免皮肤接触；废液集中收集，交由专业机构处理。高压部件（泵、色谱柱）操作前需泄压（泵流速调0，打开排气阀），避免高压喷液。（二）质量控制分析前进行系统适用性测试：对照品连续进样6针，保留时间RSD≤2%，峰面积RSD≤3%，分离度≥1.5。数据备份：工作站数据每周备份至移动硬盘，方法文件加密保存，避免误删。七、附录不同品牌仪器操作差异对照表（如Waters、