工程大肠杆菌利用多元碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品的代谢机制与应用研究

工程大肠杆菌利用多元碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品的代谢机制与应用研究一、引言1.1研究背景与意义随着全球对可持续发展的关注度不断提高，生物制造领域作为实现绿色化学和可持续发展目标的关键途径，受到了广泛关注。微生物细胞工厂的设计与构建是生物制造的核心内容之一，通过利用微生物的代谢能力，可以将可再生原料转化为各种高附加值的化学品，从而减少对化石资源的依赖，降低环境污染。大肠杆菌作为一种模式微生物，具有遗传背景清晰、生长速度快、易于基因操作等优点，成为构建微生物细胞工厂的理想底盘菌株。在生物制造过程中，乙酰辅酶A作为一种关键的代谢中间体，参与了众多生物合成途径，如脂肪酸、萜类、氨基酸等的合成。因此，高效合成乙酰辅酶A衍生化学品对于生物制造领域的发展具有重要意义。传统的化学品生产主要依赖于化石原料，如石油、煤炭等，这种生产方式不仅面临着资源短缺和环境污染等问题，还受到国际油价波动的影响，导致生产成本不稳定。相比之下，利用工程大肠杆菌和多元碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品具有诸多优势。首先，葡萄糖、乙醇、乙酸等碳源来源广泛，可以通过生物质发酵、生物转化等方式获得，具有可再生性和可持续性。其次，通过基因工程和代谢工程技术对大肠杆菌进行改造，可以精确调控其代谢途径，提高目标产物的合成效率和产量，降低生产成本。此外，这种生物制造方式具有反应条件温和、选择性高、副产物少等优点，符合绿色化学的理念。在实际应用中，乙酰辅酶A衍生化学品在食品、医药、化工等领域具有广泛的用途。例如，脂肪酸可以用于生产生物柴油、润滑剂、表面活性剂等；萜类化合物可以用于生产香料、药物、农药等；氨基酸可以用于生产食品添加剂、饲料添加剂、药物等。因此，开发高效的工程大肠杆菌细胞工厂，利用多元碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品，对于推动生物制造领域的发展，实现可持续发展目标具有重要的现实意义。综上所述，本研究旨在通过对大肠杆菌进行基因工程和代谢工程改造，构建高效利用葡萄糖、乙醇、乙酸作为碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品的工程菌株，并对其代谢机制和生产性能进行深入研究。本研究的成果将为生物制造领域的发展提供新的技术手段和理论支持，具有重要的科学意义和应用价值。1.2研究现状在利用大肠杆菌合成乙酰辅酶A衍生化学品的研究中，葡萄糖作为一种最为常见且易于被大肠杆菌利用的碳源，受到了广泛的关注和深入的研究。众多学者通过代谢工程和合成生物学等技术手段，对大肠杆菌的代谢途径进行了精细的调控和优化，旨在提高乙酰辅酶A衍生化学品的产量和生产效率。清华大学陈振、刘德华等人合作利用大肠杆菌作为宿主，通过代谢工程手段构建了一种从葡萄糖直接合成1,6-己二胺（HMD）和1,6-己二醇（HDO）的生物催化途径。研究人员将整个合成途径拆分为上游的己二酸合成模块和下游的HMD与HDO合成模块。在上游模块中，选择逆向β-氧化途径合成己二酸，通过筛选和评估关键酶3-羟基己二酰辅酶A脱氢酶（paaH）不同来源的催化效率，发现来自粘质沙雷氏菌和解脲沙雷氏菌的paaH表现突出，分别产生了2.64g/L和3.83g/L的3-羟基己二酸。对负责3-羟基己二酰辅酶A脱水反应的烯酰辅酶A水合酶（PaaF）进行优化，在大肠杆菌PaaF的N端融合SUMO标签，使己二酸产量大幅提升。为增加代谢前体物质可用性，敲除编码琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的sucD基因和编码乙酰辅酶A乙酰转移酶的atoB基因，得到的菌株分别产生了273.49mg/L和362.52mg/L的己二酸。下游模块提出较以往更节能的辅酶A依赖途径，最终通过共培养策略，使HMD和HDO产量最高分别在96h达到16.62mg/L和214.93mg/L。浙江大学叶丽丹团队利用大肠杆菌从葡萄糖出发，成功实现尼龙12单体ω-氨基十二烷酸（ω-AmDDA）的高效合成。研究人员通过基因工程手段在大肠杆菌中构建了合成ω-AmDDA的完整代谢途径，引入来自加州月桂的硫酯酶BTE，使大肠杆菌能够选择性地合成十二烷二酸（DDA），再利用多酶级联反应将DDA转化为ω-AmDDA。通过模块化途径工程，优化上游糖酵解模块、乙酰辅酶A活化模块、酰基-ACP合成模块，使ω-AmDDA滴度最高达到242.8mg/L。通过辅因子工程，调节NADPH和NADH等关键辅因子的供应、加强ATP供应等，获得的菌株在摇瓶发酵18小时后产生324.4mg/L的ω-AmDDA。通过增强氧化应激耐受性工程，构建的菌株经过摇瓶发酵18h，ω-AmDDA产量为370.9mg/L，生物量增加了64%。通过蛋白质工程，对P450酶进行饱和诱变和N端融合分子间亲和增强结构，最终菌株培养18h后其ω-AmDDA产量为471.5mg/L，较对照菌株高出54%，同时DDA积累量从43.9mg/L降至25.3mg/L。尽管在利用葡萄糖作为碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品方面取得了一定的进展，但当前研究仍然面临着一些问题和挑战。一方面，大肠杆菌在利用葡萄糖进行代谢过程中，会产生大量的副产物，如乙酸等，这些副产物的积累不仅会影响细胞的生长和代谢，还会降低目标产物的产量和生产效率。另一方面，目前的代谢工程策略往往侧重于对单一代谢途径的优化，而忽略了细胞内代谢网络的整体性和复杂性，导致在实际生产过程中，菌株的性能难以达到预期的效果。此外，葡萄糖作为一种粮食基碳源，其大规模的使用可能会与粮食供应产生竞争，从而限制了其在工业生产中的应用。在利用乙醇作为碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品的研究方面，也取得了一系列的成果。野生型大肠杆菌不能利用乙醇进行有氧生长，但通过代谢工程改造，可使其具备利用乙醇的能力。华东理工大学生物工程学院吴辉教授研究团队将双功能氧化还原酶突变体AdhEA267T/E568K引入大肠杆菌，使得携带乙醇利用途径的大肠杆菌能在50h内以乙醇为唯一碳源快速生长。在此基础上，分别引入异丙醇合成途径和3-羟基丙酸合成途径，初步生产出2.01g/L异丙醇和1.51g/L3-羟基丙酸。在乙醇生产异丙醇的研究中，通过生长期依赖型启动子（GPPs）动态调控TCA循环关键酶--异柠檬酸脱氢酶icd的表达，使异丙醇的产量提高到了2.44g/L，得率为0.24g/g。通过过表达内源转氢酶pntAB提高细胞内NADPH的供应，使异丙醇的效价提高到了4.41g/L，得率为0.44g/g，是对照菌株的2.2倍。在乙醇生产3-羟基丙酸的研究中，对乙醛酸循环、TCA氧化分支以及辅因子对3-羟基丙酸生产的影响进行了探索，通过动态调控TCA氧化臂和控制乙醛酸途径，有效地调节了菌体的生长速度和最终菌体浓度。将内源转氢酶编码基因pntAB启动子替换为组成型强启动子，3-羟基丙酸产量提升至1.65g/L。经过底物浓度、温度以及催化培养基的优化后，3-羟基丙酸产量提高至13.17g/L。然而，利用乙醇作为碳源也存在一些问题。首先，乙醇的生产成本相对较高，这在一定程度上限制了其大规模的工业应用。其次，乙醇的毒性对大肠杆菌的生长和代谢可能会产生负面影响，导致细胞的生长速率下降、代谢活性降低等问题。此外，目前对于大肠杆菌利用乙醇进行代谢的分子机制还尚未完全明确，这也给进一步的代谢工程改造带来了一定的困难。乙酸作为一种碳源，在大肠杆菌合成乙酰辅酶A衍生化学品的研究中也具有重要的地位。乙酸可以通过乙酰辅酶A合成酶（ACS）等酶的作用转化为乙酰辅酶A，从而进入细胞的中心代谢途径。中国医学科学院药物研究所孔建强研究员团队在利用工程化大肠杆菌合成葛根素-6″-O-乙酸酯的研究中，对细胞内影响乙酰辅酶A含量的三条途径进行比较，发现过表达乙酰辅酶A合酶（ACS）和丙酮酸脱氢酶复合物（PDH）能显著提高乙酰辅酶A的含量。协同表达ACS和PDH，构建高产乙酰辅酶A的大肠杆菌底盘细胞，然后往底盘细胞中导入MAT突变体MATE125N，获得能合成葛根素-6″-O-乙酸酯的细胞工厂Q15。经过一系列条件优化，Q15在6-L补料发酵中能产生2.02g/L的葛根素-6″-O-乙酸酯。但是，乙酸作为碳源也面临一些挑战。在发酵过程中，乙酸的浓度过高可能会对大肠杆菌产生抑制作用，影响细胞的生长和代谢。此外，乙酸的代谢途径相对较为复杂，涉及到多个酶和代谢步骤，如何精确调控乙酸的代谢途径，提高乙酰辅酶A的合成效率，仍然是当前研究的难点之一。同时，从工业应用的角度来看，如何降低乙酸的生产成本，提高其利用效率，也是需要解决的关键问题。1.3研究目的与内容本研究旨在通过对大肠杆菌进行系统的基因工程和代谢工程改造，深入解析其利用葡萄糖、乙醇、乙酸作为碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品的代谢机制，构建高效的工程菌株，并探索其在实际生产中的应用潜力，为生物制造领域的可持续发展提供理论支持和技术解决方案。具体研究内容如下：1.3.1解析大肠杆菌利用不同碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品的代谢机制运用系统生物学方法，结合基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学技术，全面分析大肠杆菌在以葡萄糖、乙醇、乙酸为碳源时的代谢网络变化。深入研究关键酶的活性调控机制、代谢途径的通量分布以及基因表达的动态变化，揭示不同碳源代谢过程中乙酰辅酶A的合成与分配规律，明确影响目标化学品合成的关键节点和限速步骤，为后续的工程改造提供理论依据。例如，通过13C代谢通量分析技术，精确测定碳源在细胞内的代谢流向，确定不同代谢途径对乙酰辅酶A合成的贡献；利用基因编辑技术构建关键基因敲除或过表达菌株，研究其对代谢网络和目标产物合成的影响，从而深入理解代谢调控的分子机制。1.3.2构建高效利用葡萄糖、乙醇、乙酸的工程大肠杆菌菌株基于代谢机制的研究成果，采用代谢工程和合成生物学策略，对大肠杆菌进行理性设计和改造。通过基因编辑技术敲除或弱化竞争性代谢途径，强化目标代谢途径，优化基因表达调控元件，提高大肠杆菌对葡萄糖、乙醇、乙酸的利用效率和乙酰辅酶A衍生化学品的合成能力。例如，针对葡萄糖代谢过程中乙酸积累的问题，敲除乙酸合成相关基因，同时过表达乙酸利用途径中的关键酶，减少乙酸的产生并提高其再利用效率；对于乙醇利用途径，通过引入高效的乙醇脱氢酶基因，优化其表达水平和酶活性，增强大肠杆菌对乙醇的耐受性和利用能力；在乙酸代谢方面，过表达乙酰辅酶A合成酶基因，提高乙酸向乙酰辅酶A的转化效率，从而增加乙酰辅酶A的供应，为目标化学品的合成提供充足的前体。此外，利用合成生物学技术构建人工代谢模块，将不同碳源的代谢途径进行整合和优化，实现多种碳源的协同利用，进一步提高细胞工厂的生产性能。1.3.3优化工程菌株发酵条件，提高目标化学品的产量和生产效率在构建高效工程菌株的基础上，对发酵条件进行系统优化，包括培养基组成、发酵温度、pH值、溶氧等关键参数。通过响应面实验设计等方法，建立发酵条件与目标化学品产量之间的数学模型，确定最佳发酵工艺参数组合，提高目标化学品的产量和生产效率。同时，研究不同碳源的添加策略对发酵过程的影响，探索碳源的最适添加比例和添加时机，实现碳源的高效利用和目标产物的最大化合成。例如，采用分批补料发酵策略，根据细胞生长和代谢需求，动态调整碳源的添加量和添加时间，避免碳源的过度积累或不足，维持细胞的生长活力和代谢稳定性，从而提高目标化学品的产量和生产效率。此外，还将研究发酵过程中的代谢调控策略，如添加诱导剂、调控辅因子水平等，进一步优化细胞的代谢状态，促进目标产物的合成。1.3.4探索工程大肠杆菌合成乙酰辅酶A衍生化学品的工业化应用潜力对构建的工程大肠杆菌菌株进行中试放大实验，评估其在工业化生产中的可行性和稳定性。研究发酵过程中的放大效应，优化发酵设备和工艺参数，解决工业化生产中可能面临的问题，如发酵过程的控制、产物的分离纯化等。同时，对目标化学品的生产成本进行核算和分析，评估其市场竞争力，为工程菌株的工业化应用提供经济可行性依据。此外，还将探索工程大肠杆菌合成的乙酰辅酶A衍生化学品在食品、医药、化工等领域的应用前景，与相关企业合作开展应用研究，推动科研成果的转化和产业化发展。例如，将合成的脂肪酸用于生物柴油的生产，评估其性能和质量指标；将合成的萜类化合物用于香料或药物的研发，测试其生物活性和安全性；将合成的氨基酸用于食品添加剂或饲料添加剂的生产，考察其应用效果和市场需求。通过这些应用研究，进一步拓展工程大肠杆菌在生物制造领域的应用范围，实现其经济价值和社会价值。二、大肠杆菌利用葡萄糖合成乙酰辅酶A衍生化学品2.1葡萄糖代谢途径及乙酰辅酶A的生成2.1.1糖酵解与三羧酸循环在大肠杆菌中，葡萄糖的代谢起始于糖酵解途径（Embden-Meyerhof-Parnaspathway，EMP），这是一个在细胞质中进行的无氧代谢过程。糖酵解途径由一系列酶促反应组成，可将1分子葡萄糖逐步转化为2分子丙酮酸，同时伴随少量ATP和NADH的生成。此过程共有10个连续步骤，涉及多种关键酶。葡萄糖首先在己糖激酶（Hexokinase，HK）或葡萄糖激酶（Glucokinase，GK）的催化下，消耗1分子ATP，磷酸化生成6-磷酸葡萄糖（Glucose-6-phosphate，G-6-P）。该反应不仅活化了葡萄糖，使其能够进入后续代谢途径，还通过磷酸化作用将葡萄糖捕获在细胞内，防止其逸出细胞膜。HK对葡萄糖的亲和力较高，Km值较低，广泛存在于多种组织细胞中；而GK主要存在于肝脏，对葡萄糖的亲和力较低，Km值较高，但在血糖浓度升高时，其活性增加，能有效地催化葡萄糖磷酸化，对维持血糖平衡具有重要作用。6-磷酸葡萄糖在磷酸己糖异构酶（Phosphohexoseisomerase）的作用下，发生异构反应，转变为6-磷酸果糖（Fructose-6-phosphate，F-6-P）。随后，6-磷酸果糖在磷酸果糖激酶-1（Phosphofructokinase-1，PFK-1）的催化下，再次消耗1分子ATP，磷酸化生成1,6-二磷酸果糖（Fructose-1,6-bisphosphate，F-1,6-BP）。PFK-1是糖酵解途径中最重要的限速酶，其活性受到多种因素的严格调控。柠檬酸、ATP等是其变构抑制剂，当细胞内能量充足或柠檬酸含量较高时，PFK-1的活性受到抑制，从而减缓糖酵解的速率；而ADP、AMP、Pi、1,6-二磷酸果糖等则是其变构激活剂，当细胞内能量匮乏或1,6-二磷酸果糖积累时，PFK-1的活性被激活，加速糖酵解过程，以满足细胞对能量的需求。胰岛素可诱导PFK-1的生成，进一步促进糖酵解的进行，这在调节血糖水平和细胞代谢中具有重要意义。1,6-二磷酸果糖在醛缩酶（Aldolase）的催化下，裂解为磷酸二羟丙酮（Dihydroxyacetonephosphate，DHAP）和3-磷酸甘油醛（Glyceraldehyde-3-phosphate，G-3-P），这两种产物可以在磷酸丙糖异构酶（Triosephosphateisomerase）的作用下相互转化。由于3-磷酸甘油醛会不断进入后续反应，从而推动反应平衡向生成3-磷酸甘油醛的方向移动。3-磷酸甘油醛在3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）的催化下，发生氧化脱氢并磷酸化反应，生成含有1个高能磷酸键的1,3-二磷酸甘油酸（1,3-Bisphosphoglycerate，1,3-BPG），同时将脱下的氢和电子传递给辅酶NAD⁺，生成NADH+H⁺。此反应中的磷酸根来自无机磷酸，这一步是糖酵解过程中唯一的氧化还原反应，也是产生还原力NADH的关键步骤。1,3-二磷酸甘油酸在磷酸甘油酸激酶（Phosphoglyceratekinase，PGK）的催化下，将其C1上的高能磷酸根转移给ADP，生成ATP和3-磷酸甘油酸（3-Phosphoglycerate，3-PG），这是底物水平磷酸化的过程，直接生成了ATP，为细胞提供能量。PGK催化的反应是可逆的，在细胞能量状态变化时，可根据需要调节反应方向。3-磷酸甘油酸在磷酸甘油酸变位酶（Phosphoglyceratemutase）的作用下，其C3位上的磷酸基转移到C2位上，生成2-磷酸甘油酸（2-Phosphoglycerate，2-PG）。2-磷酸甘油酸在烯醇化酶（Enolase）的催化下，脱水生成含高能磷酸键的磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP），该反应同时伴随着能量的重新分配，使PEP具有较高的能量水平。最后，磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶（Pyruvatekinase，PK）的催化下，将高能磷酸根转移至ADP，生成ATP和丙酮酸，这是糖酵解途径中的第二次底物水平磷酸化，也是一个不可逆反应。PK是糖酵解途径的另一个限速酶，具有变构酶性质，ATP是其变构抑制剂，ADP是变构激活剂，Mg²⁺或K⁺可激活其活性。胰岛素能够诱导PK的生成，从而促进糖酵解的进行，调节细胞内的糖代谢。通过糖酵解途径，1分子葡萄糖最终生成2分子丙酮酸、2分子ATP（净生成）和2分子NADH+H⁺。在有氧条件下，丙酮酸会进一步进入三羧酸循环（Tricarboxylicacidcycle，TCAcycle），进行彻底的氧化分解；而在无氧条件下，丙酮酸则会被还原为乳酸或乙醇等发酵产物，以维持细胞内的氧化还原平衡。丙酮酸进入三羧酸循环前，需先在丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvatedehydrogenasecomplex，PDHcomplex）的催化下，进行氧化脱羧反应，生成乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）、CO₂和NADH+H⁺。丙酮酸脱氢酶复合体是一个由多种酶和辅酶组成的大型复合物，包括丙酮酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酰胺转乙酰基酶（E2）和二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3），以及TPP、硫辛酸、CoA、FAD、NAD⁺等辅酶。该反应是连接糖酵解和三羧酸循环的关键步骤，受到严格的调控，包括产物抑制、共价修饰和别构调节等多种方式。例如，乙酰辅酶A和NADH是丙酮酸脱氢酶复合体的产物抑制剂，当细胞内乙酰辅酶A和NADH水平升高时，会反馈抑制该复合体的活性，减少乙酰辅酶A的生成；同时，丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）可以催化E1亚基的磷酸化，使其失活，而丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP）则可催化E1亚基的去磷酸化，使其激活，从而通过共价修饰的方式调节丙酮酸脱氢酶复合体的活性。乙酰辅酶A进入三羧酸循环后，与草酰乙酸（Oxaloacetate，OAA）在柠檬酸合酶（Citratesynthase）的催化下，缩合生成柠檬酸（Citrate），从而开启了三羧酸循环的一系列反应。柠檬酸在顺乌头酸酶（Aconitase）的作用下，异构化为异柠檬酸（Isocitrate）。异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶（Isocitratedehydrogenase，IDH）的催化下，发生氧化脱羧反应，生成α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate）、CO₂和NADH+H⁺。异柠檬酸脱氢酶是三羧酸循环中的关键限速酶之一，其活性受到ADP、NAD⁺等变构激活剂以及ATP、NADH等变构抑制剂的调节。当细胞内能量需求增加时，ADP水平升高，可激活异柠檬酸脱氢酶的活性，加速三羧酸循环，促进能量的产生；而当细胞内能量充足时，ATP和NADH水平升高，会抑制异柠檬酸脱氢酶的活性，减缓三羧酸循环的速率。α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱氢酶复合体（α-Ketoglutaratedehydrogenasecomplex）的催化下，再次发生氧化脱羧反应，生成琥珀酰辅酶A（Succinyl-CoA）、CO₂和NADH+H⁺。α-酮戊二酸脱氢酶复合体的组成和作用机制与丙酮酸脱氢酶复合体类似，同样受到产物抑制和别构调节等多种调控方式。琥珀酰辅酶A在琥珀酰辅酶A合成酶（Succinyl-CoAsynthetase）的催化下，发生底物水平磷酸化反应，生成琥珀酸（Succinate）和ATP（或GTP）。这一步反应是三羧酸循环中唯一直接生成高能磷酸化合物的步骤，为细胞提供了能量。琥珀酸在琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，SDH）的催化下，脱氢生成延胡索酸（Fumarate），同时将脱下的氢传递给FAD，生成FADH₂。琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中唯一嵌入线粒体内膜的酶，它不仅参与三羧酸循环，还与电子传递链紧密相连。延胡索酸在延胡索酸酶（Fumarase）的作用下，加水生成苹果酸（Malate）。苹果酸在苹果酸脱氢酶（Malatedehydrogenase，MDH）的催化下，脱氢生成草酰乙酸，同时将脱下的氢传递给NAD⁺，生成NADH+H⁺。草酰乙酸又可与新进入的乙酰辅酶A继续反应，使三羧酸循环周而复始地进行。通过三羧酸循环，1分子乙酰辅酶A彻底氧化分解，生成2分子CO₂、3分子NADH+H⁺、1分子FADH₂和1分子ATP（或GTP）。三羧酸循环不仅是糖、脂肪和氨基酸等物质彻底氧化分解的共同途径，也是它们之间相互转化的枢纽。在这个过程中，产生的大量NADH+H⁺和FADH₂会进入电子传递链，通过氧化磷酸化作用产生大量ATP，为细胞的生命活动提供充足的能量。同时，三羧酸循环中产生的各种中间产物，如α-酮戊二酸、草酰乙酸等，还可以作为合成其他生物分子的前体，参与到氨基酸、核苷酸等物质的合成代谢中，对维持细胞的正常生理功能和代谢平衡起着至关重要的作用。2.1.2磷酸戊糖途径与乙酰辅酶A代谢关联磷酸戊糖途径（Pentosephosphatepathway，PPP）是葡萄糖代谢的另一条重要途径，与糖酵解和三羧酸循环相互联系，共同构成了细胞内复杂的代谢网络。该途径主要发生在细胞质中，其主要功能是产生还原力NADPH和提供磷酸戊糖等重要的中间代谢物，这些产物在细胞的生物合成、抗氧化防御和维持细胞内氧化还原平衡等方面发挥着关键作用，与乙酰辅酶A的生成及衍生化学品的合成也存在着密切的关联。磷酸戊糖途径可分为氧化阶段和非氧化阶段。在氧化阶段，葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PD）的催化下，脱氢生成6-磷酸葡萄糖酸内酯（6-Phosphogluconolactone），同时将脱下的氢传递给NADP⁺，生成NADPH+H⁺。这是磷酸戊糖途径的限速步骤，G6PD的活性受到NADPH水平的严格调控，当细胞内NADPH含量升高时，会反馈抑制G6PD的活性，从而调节磷酸戊糖途径的通量。6-磷酸葡萄糖酸内酯在内酯酶的作用下，水解生成6-磷酸葡萄糖酸（6-Phosphogluconate）。6-磷酸葡萄糖酸在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-Phosphogluconatedehydrogenase）的催化下，再次发生氧化脱羧反应，生成5-磷酸核酮糖（Ribulose-5-phosphate）、CO₂和NADPH+H⁺。通过氧化阶段的这两步反应，1分子G-6-P可以生成2分子NADPH+H⁺和1分子5-磷酸核酮糖，为细胞提供了大量的还原力，满足了生物合成过程对NADPH的需求。在非氧化阶段，5-磷酸核酮糖在异构酶和差向异构酶的作用下，可转化为5-磷酸核糖（Ribose-5-phosphate）和5-磷酸木酮糖（Xylulose-5-phosphate）。5-磷酸核糖是合成核苷酸和核酸的重要前体物质，对于细胞的遗传信息传递和蛋白质合成等过程至关重要。而5-磷酸木酮糖则可参与后续的一系列转酮醇酶和转醛醇酶催化的反应，与其他磷酸戊糖相互转化，实现碳骨架的重排和物质的循环利用。转酮醇酶（Transketolase）催化5-磷酸木酮糖将其C1和C2组成的二碳单位（羟乙醛基）转移给5-磷酸核糖，生成3-磷酸甘油醛（G-3-P）和7-磷酸景天庚酮糖（Sedoheptulose-7-phosphate）。随后，转醛醇酶（Transaldolase）催化7-磷酸景天庚酮糖将其C3至C5组成的三碳单位（二羟丙酮基）转移给3-磷酸甘油醛，生成4-磷酸赤藓糖（Erythrose-4-phosphate）和6-磷酸果糖（F-6-P）。4-磷酸赤藓糖可与5-磷酸木酮糖在转酮醇酶的作用下，再次发生反应，生成3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖。通过这些反应，磷酸戊糖途径中的磷酸戊糖可以相互转化，并与糖酵解途径的中间产物相互联系，实现了碳源的灵活分配和利用。例如，生成的3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖可以进入糖酵解途径，进一步参与能量代谢或用于合成其他生物分子；而糖酵解途径产生的中间产物也可以通过逆向反应进入磷酸戊糖途径，为细胞提供所需的磷酸戊糖和还原力。磷酸戊糖途径与乙酰辅酶A代谢的关联主要体现在以下几个方面。一方面，磷酸戊糖途径产生的NADPH是细胞内重要的还原力，在许多生物合成过程中作为供氢体参与反应。乙酰辅酶A衍生化学品的合成，如脂肪酸、萜类化合物等，都需要大量的NADPH提供还原力。在脂肪酸合成过程中，乙酰辅酶A在脂肪酸合酶的作用下，逐步延长碳链，每一轮反应都需要2分子NADPH参与还原反应，以形成饱和脂肪酸链。因此，磷酸戊糖途径的活性直接影响着NADPH的供应，进而影响乙酰辅酶A衍生化学品的合成效率。如果磷酸戊糖途径受到抑制，NADPH供应不足，脂肪酸等乙酰辅酶A衍生化学品的合成将受到阻碍。另一方面，磷酸戊糖途径的中间产物与糖酵解和三羧酸循环相互关联，间接影响乙酰辅酶A的生成和代谢流向。例如，磷酸戊糖途径产生的3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖可以进入糖酵解途径，经过一系列反应生成丙酮酸，丙酮酸再通过丙酮酸脱氢酶复合体的作用转化为乙酰辅酶A，从而为三羧酸循环和乙酰辅酶A衍生化学品的合成提供前体。此外，磷酸戊糖途径的代谢通量变化会影响细胞内的代谢平衡，进而影响乙酰辅酶A在不同代谢途径中的分配。当细胞需要大量合成脂肪酸等乙酰辅酶A衍生化学品时，磷酸戊糖途径的通量可能会增加，以提供更多的NADPH和合适的碳骨架，促进乙酰辅酶A向脂肪酸合成途径的流动；而当细胞主要需求能量时，糖酵解和三羧酸循环的通量可能会增强，乙酰辅酶A更多地参与能量代谢过程。此外，磷酸戊糖途径还与细胞的抗氧化防御系统密切相关。NADPH作为细胞内重要的抗氧化剂，可参与维持谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的还原态，保持细胞内的氧化还原平衡。在细胞受到氧化应激时，如活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）水平升高，NADPH可通过谷胱甘肽还原酶将氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为GSH，GSH则可与ROS反应，将其清除，保护细胞免受氧化损伤。由于乙酰辅酶A衍生化学品的合成过程可能会产生ROS等副产物，影响细胞的正常代谢和生长，因此磷酸戊糖途径通过提供NADPH维持细胞的抗氧化能力，对于保障乙酰辅酶A衍生化学品的高效合成具有重要意义。如果细胞的抗氧化防御系统受损，ROS积累，可能会导致细胞内蛋白质、核酸等生物大分子的损伤，影响相关酶的活性和代谢途径的正常运行，进而降低乙酰辅酶A衍生化学品的合成产量和质量。2.2基于葡萄糖的乙酰辅酶A衍生化学品合成实例2.2.11,6-己二胺和1,6-己二醇的合成1,6-己二胺（HMD）和1,6-己二醇（HDO）作为重要的有机化工原料，在高分子材料合成领域发挥着关键作用，广泛应用于尼龙、聚氨酯和聚酯等材料的生产。然而，传统的生产方式主要依赖化石原料，面临着诸多严峻问题，如反应条件苛刻，往往需要高温、高压等极端条件，不仅增加了生产设备的成本和安全风险，还对能源消耗巨大；使用有毒原料或中间体，如在传统的HMD合成过程中，可能会使用光气等剧毒物质，对操作人员的健康和环境造成严重威胁；能耗高，化石原料的开采、运输以及化学反应过程都需要消耗大量的能源，加剧了全球能源危机；产生有害副产物污染环境，这些副产物的排放会对土壤、水体和大气造成污染，破坏生态平衡。因此，开发以可再生资源为原料的生物制造路线成为了该领域的研究热点，具有重要的现实意义和迫切性。近期，清华大学陈振、刘德华等人合作开展了一项具有创新性的研究，他们以大肠杆菌作为宿主，运用代谢工程手段，成功构建了一种从葡萄糖直接合成HMD和HDO的生物催化途径，相关研究成果发表在《ACSSyntheticBiology》期刊上。在该研究中，研究人员创新性地将整个合成途径巧妙地拆分为上游的己二酸合成模块和下游的HMD与HDO合成模块。在上游的己二酸合成模块中，研究人员选择了逆向β-氧化途径来合成己二酸。这一途径涉及一系列复杂的酶促反应，需要多种酶的协同参与，通过这些酶的作用，将乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A逐步转化为己二酸。虽然此前在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中已经成功实现了该途径的表达，但是由于关键途径酶的活性不足，导致己二酸的产量受到了极大的限制。为了突破这一瓶颈，提高己二酸的产量，研究人员对关键酶3-羟基己二酰辅酶A脱氢酶（paaH）不同来源的催化效率进行了全面而细致的筛选和评估。经过大量的实验研究，结果令人欣喜地发现，来自粘质沙雷氏菌和解脲沙雷氏菌的paaH表现尤为突出，分别产生了2.64g/L和3.83g/L的3-羟基己二酸。随后，研究人员将其它关键酶基因引入菌株，进一步对菌株进行优化，优化后的菌株在培养过程中分别积累了58.17mg/L和65.71mg/L的己二酸。在这些实验结果的基础上，解脲沙雷氏菌的PaaH因其在合成己二酸方面展现出的明显优势，被研究人员选用于后续的深入研究。在进一步优化己二酸合成模块时，研究人员通过深入的研究和分析，发现3-羟基己二酰辅酶A的脱水反应是整个过程的限速步骤，这一发现为后续的优化工作指明了方向。于是，研究人员将重点放在了对负责该反应的烯酰辅酶A水合酶（PaaF）的优化上。起初，研究人员尝试用其他候选酶替代大肠杆菌的PaaF，然而实验结果表明，这些替代酶的效果并不理想，未能有效提高反应速率和己二酸的产量。因此，研究人员转变思路，尝试在大肠杆菌PaaF的N端融合SUMO、GST和MBP标签，期望通过这种方式提高其溶解性，进而增强其酶活性。实验结果证明，带有SUMO标签的PaaF取得了显著的效果，可使己二酸产量大幅提升，这一成果为己二酸合成模块的优化提供了新的策略和方法。为了进一步提高己二酸产量，研究人员从代谢前体物质可用性的角度出发，对相关策略进行了深入优化。为了增加琥珀酰辅酶A的供应，他们运用基因编辑技术，敲除了编码琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的sucD基因，减少了琥珀酰辅酶A的消耗，使其更多地参与到己二酸的合成过程中；为了减少对前体物质乙酰辅酶A的竞争，进一步敲除了编码乙酰辅酶A乙酰转移酶的atoB基因，避免了乙酰辅酶A的分流，保证了其在己二酸合成途径中的充足供应。通过这一系列的基因工程操作，得到的两种菌株分别产生了273.49mg/L和362.52mg/L的己二酸，己二酸的产量得到了显著提高。对于下游的HMD和HDO合成模块，研究人员提出了一种较以往更节能的辅酶A依赖途径。此前的合成途径中，己二酸需要通过羧酸还原酶（CAR）转化为己二酸半醛，随后通过转氨酶（TA）转化为6-氨基己酸（6-ACA），或通过醇脱氢酶转化为6-羟基己酸（6-HHA）作为中间体。6-ACA可以通过包含CAR和TA的串联反应进一步转化为HMD，而6-HHA可以通过包含CAR和ADH的串联反应转化为HDO。然而，此过程存在明显的缺点，需要消耗4个ATP分子，能量利用效率较低。在新提出的方法中，己二酸首先被转化为己二酰辅酶A，然后通过乙酰化醛脱氢酶（SucD）还原为己二酸半醛。随后，己二酸半醛可以通过上述相同的下游途径进一步转化为HMD或HDO。与基于CAR的两步还原途径相比，辅酶A依赖途径仅消耗2个ATP分子，大大降低了能量消耗，提高了能量利用效率。此外，作为己二酸合成途径中的中间体，己二酰辅酶A可以作为后续生物合成模块的直接前体，这一特点进一步提高了整个过程的效率，为HMD和HDO的合成提供了更为高效的途径。当两个合成模块构建完成后，研究人员尝试在一株大肠杆菌中构建完整途径，然而实验结果并不理想，并未成功实现预期的目标。他们经过深入分析和研究，推测在单一菌株中表达这一长且复杂的途径可能会对宿主施加显著的代谢负担，从而限制整个转化过程的效率。为解决这些问题，研究人员创新性地采用了共培养策略，即让上游菌株将葡萄糖转化为己二酸，下游菌株将己二酸转化为HMD和HDO。通过这种方式，实现了代谢途径的物理分隔，减少了单一菌株的代谢负担，并且允许独立优化上游和下游模块，提高了整个合成过程的灵活性和可控性。通过优化共培养体系中两种菌株的接种比例，研究人员发现1:1的比例可使HMD和HDO产量最高，分别在96h达到16.62mg/L和214.93mg/L。这些结果成功地证明了使用共培养策略从葡萄糖进行HMD和HDO从头生物合成的可行性，为该领域的研究提供了新的思路和方法。这种方法实现了代谢途径的物理分隔，减少了代谢负担，并允许独立优化上游和下游模块，具有显著的优势。但为了实现实际的工业应用，仍需解决若干挑战，包括维持遗传稳定性，确保在大规模培养过程中，菌株的基因不发生突变或丢失，保证合成途径的稳定运行；确保稳定的种群动态，在共培养体系中，要保证上下游菌株的比例始终处于最佳状态，避免某一菌株过度生长或死亡；实现精确的过程控制，对发酵过程中的温度、pH值、溶氧等参数进行精确调控，以满足菌株生长和产物合成的需求，并进一步提高各模块的生产效率，降低生产成本，提高产品质量。该研究为其他C6平台化学品的生产提供了新思路，在未来化工原料生产中具有巨大的潜在价值，有望推动生物制造领域的进一步发展，实现可持续的化工生产。2.2.2尼龙12单体ω-氨基十二烷酸的合成在工业领域中，尼龙12以其出色的性能而备受青睐，它具有低吸水性的特点，这使得其在潮湿环境中仍能保持稳定的性能，不易发生变形或性能下降；低相对密度，使其重量较轻，便于加工和使用，在一些对重量有严格要求的应用场景中具有明显优势；高耐磨性，能够在长期使用过程中保持良好的表面质量和机械性能，延长产品的使用寿命；阻燃性，可有效提高产品的安全性，减少火灾风险。基于这些优异性能，尼龙12广泛应用于3D打印、汽车制造、油气开采、医疗器械、电子信息、汽车零部件等众多领域，成为现代工业生产中不可或缺的材料之一。然而，传统的尼龙12化学合成方法存在诸多弊端。其合成步骤繁多，需要经过多个复杂的化学反应步骤，这不仅增加了生产过程的复杂性和成本，还容易导致产品质量的不稳定；在合成过程中需要使用有毒和腐蚀性的原料，如一些有机试剂和强酸强碱等，这些原料的使用不仅对操作人员的健康构成威胁，还会在生产过程中产生大量的有害废弃物，对环境造成严重的污染，导致技术门槛高、环境污染严重等问题。因此，开发绿色、可持续的尼龙12生产方法具有重要的现实意义和迫切需求。与传统方法相比，微生物合成则具有显著的优势。微生物合成过程通常在温和的条件下进行，不需要高温、高压等极端条件，减少了能源消耗和设备成本；微生物合成使用的原料多为可再生资源，如葡萄糖等，减少了对化石原料的依赖，降低了环境污染；微生物合成具有较高的选择性和特异性，能够精确地合成目标产物，减少副产物的生成，提高产品质量。目前，尼龙12单体的生物生产主要通过多酶级联反应将十二烷二酸（DDA）或其酯转化为ω-氨基十二烷酸（ω-AmDDA）或其酯。然而，这些研究的底物DDA及其衍生物通常来自椰子油和棕榈仁油，这引发了与森林砍伐和生物多样性丧失有关的重大环境问题。此外，使用食用植物油进行工业油脂化学品生产加剧了土地应分配给燃料还是食物的争论，使得尼龙12单体的生物生产面临着原料可持续性的挑战。近日，浙江大学叶丽丹团队在该领域取得了重大进展，在一篇题为“Denovobiosynthesisofnylon12monomerω-aminododecanoicacid”的研究中，研究人员利用大肠杆菌从葡萄糖出发，成功实现尼龙12单体ω-AmDDA的高效合成，为尼龙12的可持续生产带来新的思路，相关成果在线发表于《NatureCommunications》。首先，研究人员通过基因工程手段在大肠杆菌中构建了合成ω-AmDDA的完整代谢途径。此前已有研究证明，通过引入来自加州月桂（Umbellulariacalifornica）的硫酯酶BTE，可以在大肠杆菌中生产高比例的游离DDA。如果这种酶可以与将DDA转化为ω-AmDDA的多酶级联途径一起在大肠杆菌中异源表达，DDA作为中间体的选择性积累可能使从葡萄糖开始生物合成ω-AmDDA成为可能。在这项研究中，研究人员引入来自加州月桂的硫酯酶BTE，从而使大肠杆菌能够选择性地合成DDA。随后，利用多酶级联反应，将DDA转化为ω-AmDDA。这一过程涉及多个酶的协同作用，包括P450酶催化的羟基化反应，将DDA的一端羟基化，引入羟基官能团；醇脱氢酶的氧化反应，将羟基进一步氧化为羰基；以及转氨酶的转氨反应等，将羰基转化为氨基，最终生成ω-AmDDA。最终，配合一系列优化培养条件，如调整pH值，为菌株生长和酶反应提供最适的酸碱环境；诱导剂浓度等，控制基因表达和酶的合成，工程菌株合成ω-AmDDA产量可以达到27.5mg/L。脂肪酸（包括DDA）可能会在生物合成后分泌，导致DDA转换酶无法接触底物，这是影响ω-AmDDA产量的一个重要因素。通过过表达自假单胞菌GPo1的外膜蛋白AlkL，能够解决底物转移问题。当使用重组大肠杆菌菌株以DDA为底物进行生物转化时，AlkL过表达使ω-AmDDA的产量提高了20.3%。这表明AlkL能够促进DDA在细胞内的转运，使其更容易被DDA转换酶识别和作用，从而提高了ω-AmDDA的产量。为了进一步优化产量，研究人员采取了多种策略，包括：模块化途径工程：充足的前体供应对于高效生产至关重要，因此，加强菌株合成DDA可以进一步改善ω-AmDDA的生物合成。根据中心代谢途径，DDA的合成途径分为三个模块：上游糖酵解模块，负责将葡萄糖转化为丙酮酸，为后续的代谢途径提供基础原料；乙酰辅酶A活化模块，将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，并使其活化，为脂肪酸合成提供活性前体；酰基-ACP合成模块，将活化的乙酰辅酶A逐步缩合，合成脂肪酸链，最终生成DDA。通过优化改进这三个模块，实现充足但不过量的DDA供应，避免了前体物质的浪费和积累对细胞代谢的影响，ω-AmDDA滴度最高达到242.8mg/L。辅因子工程：通过调节NADPH和NADH等关键辅因子的供应、加强ATP供应等，优化细胞内的能量和氧化还原平衡。NADPH和NADH在许多酶促反应中作为电子供体或受体，参与氧化还原过程，对代谢途径的进行起着关键作用。ATP则是细胞内的能量货币，为各种生物合成反应提供能量。通过调节这些辅因子的供应，可以提高相关酶的活性，促进代谢途径的进行，最终获得的菌株在摇瓶发酵18小时后产生324.4mg/L的ω-AmDDA。增强氧化应激耐受性工程：DDA及其衍生物的产生和积累会破坏膜结构，削弱位于膜上的电子传递链的功能，导致活性氧（ROS）的积累。过量的ROS会损害细胞膜、蛋白质和核酸等必需的细胞成分，导致ROS应激，影响细胞的正常生长和代谢，进而降低ω-AmDDA的产量。通过增强氧化应激耐受性，如过表达抗氧化酶、调节细胞膜组成等，构建的菌株经过摇瓶发酵18h，ω-AmDDA产量为370.9mg/L，生物量增加了64%。这表明增强氧化应激耐受性可以有效减轻ROS对细胞的损伤，提高细胞的生长和代谢能力，从而提高ω-AmDDA的产量。蛋白质工程：在ω-AmDDA的全细胞催化和从头合成中，P450酶将DDA羟基化形成ω-OHDDA至关重要。通过对可能参与催化的结构域的位点进行饱和诱变，最终获得了活性提高89%的组合突变体CYP153Am4-NCP；此外，通过N端融合分子间亲和增强结构增强CYP153Am4-NCP的蛋白质二聚化，进一步提高了羟基化活性。得到最终菌株培养18h后其ω-AmDDA产量为471.5mg/L，较对照菌株高出54%，同时DDA积累量从43.9mg/L降至25.3mg/L。这表明通过蛋白质工程可以有效提高关键酶的活性，优化代谢途径，减少中间产物的积累，提高目标产物的产量和纯度。本研究开发了一种多层次调控策略，以实现从葡萄糖高效从头生物合成尼龙12单体ω-AmDDA。研究人员整合了模块化途径工程、辅因子工程、耐受性工程和蛋白质工程来优化复杂的合成途径。通过将内源脂肪酸代谢与将DDA转化为ω-AmDDA的异源多酶级联连接起来，构建了一种能够从葡萄糖生物合成ω-AmDDA的工程大肠杆菌菌株。此外，研究人员通过加强和平衡四个途径模块：糖酵解、乙酰辅酶A活化、酰基-ACP合成和异源DDA转化、调节NAD(P)H和ATP供应、增强氧化应激耐受性以及设计限速P450来重建该细胞工厂的代谢平衡。这种综合方法可以构建高效的ω-AmDDA细胞工厂，为可持续的葡萄糖衍生尼龙12生产铺平道路，为尼龙12的可持续生产提供了新的技术手段和理论基础，有望推动尼龙12产业向绿色、可持续方向发展。2.3面临的挑战与解决策略2.3.1代谢负担问题在利用大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成乙酰辅酶A衍生化学品的过程中，代谢负担是一个不容忽视的关键问题。随着目标代谢途径的强化和异源基因的大量表达，细胞需要消耗更多的能量和资源来维持这些额外的代谢活动，这无疑会给细胞的正常生长和代谢带来沉重的负担，进而对乙酰辅酶A衍生化学品的合成产生负面影响。代谢负担可能导致细胞生长缓慢，甚至停滞。当细胞将大量的能量和资源用于合成目标产物时，用于自身生长和维持基本生理功能的能量和物质就会相应减少，使得细胞的生长速率下降，影响发酵过程的效率和产量。此外，代谢负担还可能引发细胞生理状态的改变，如细胞膜通透性的变化、酶活性的降低等，这些变化可能会进一步影响细胞内的代谢平衡，导致代谢途径的通量分布发生改变，使得目标产物的合成受到抑制，同时可能会增加副产物的生成，降低产物的纯度和得率。为有效减轻代谢负担，提高细胞对葡萄糖的利用效率和目标产物的合成能力，可采取模块分隔的策略。通过将复杂的代谢途径合理地分配到不同的细胞或细胞区域中，实现代谢途径的物理分隔，从而减少单一细胞内的代谢负担，避免不同代谢途径之间的相互干扰，提高代谢途径的效率和稳定性。例如，采用共培养策略，将合成乙酰辅酶A衍生化学品的代谢途径拆分为多个模块，分别由不同的菌株来完成。在清华大学陈振、刘德华等人从葡萄糖合成1,6-己二胺和1,6-己二醇的研究中，就将整个合成途径拆分为上游的己二酸合成模块和下游的1,6-己二胺与1,6-己二醇合成模块，分别由不同的菌株进行表达。这种方式使得每个菌株只需承担相对简单的代谢任务，减轻了单一菌株的代谢负担，同时允许对上下游模块进行独立优化，提高了整个合成过程的灵活性和可控性，最终成功实现了1,6-己二胺和1,6-己二醇的从头生物合成。除了共培养策略，还可以利用合成生物学技术构建人工细胞器或代谢模块，将特定的代谢途径限制在特定的区域内进行，实现细胞内的代谢空间分隔。通过设计和构建具有特定功能的人工细胞器，如合成生物学中常用的微区室（microcompartment），可以将参与乙酰辅酶A衍生化学品合成的关键酶和代谢途径封装在其中，使其与细胞内的其他代谢过程相对隔离。这样不仅可以减少代谢途径之间的相互干扰，还能提高底物和产物的局部浓度，增强酶与底物的相互作用，从而提高代谢途径的效率和稳定性。同时，通过对人工细胞器的膜结构进行设计和优化，可以精确调控物质的进出，进一步优化代谢途径的运行，减轻细胞的代谢负担。2.3.2前体供应不足前体供应不足是影响大肠杆菌利用葡萄糖合成乙酰辅酶A衍生化学品的另一个重要因素。乙酰辅酶A衍生化学品的合成需要充足的前体物质作为原料，如乙酰辅酶A、磷酸戊糖等。然而，在实际的代谢过程中，由于细胞内代谢网络的复杂性和调控机制的精细性，这些前体物质的供应往往难以满足目标产物合成的需求，从而限制了乙酰辅酶A衍生化学品的产量和生产效率。在脂肪酸合成过程中，需要大量的乙酰辅酶A和NADPH作为前体和还原力。但在大肠杆菌的正常代谢状态下，细胞内的乙酰辅酶A和NADPH的供应可能无法满足脂肪酸合成的高需求，导致脂肪酸合成的速率受到限制。此外，前体物质的供应不足还可能引发代谢途径的失衡，使得细胞内的代谢流发生改变，进一步影响目标产物的合成。例如，当乙酰辅酶A供应不足时，细胞可能会将更多的碳源流向其他代谢途径，以维持自身的生长和代谢需求，从而减少了用于乙酰辅酶A衍生化学品合成的碳源和能量，导致目标产物的产量下降。为解决前体供应不足的问题，可通过基因编辑技术对大肠杆菌的代谢途径进行精确调控。通过敲除或弱化竞争性代谢途径，减少前体物质的分流，使更多的碳源和能量流向目标代谢途径，从而增加前体物质的供应。如在浙江大学叶丽丹团队从葡萄糖合成尼龙12单体ω-氨基十二烷酸的研究中，为了增加十二烷二酸（DDA）的合成，对大肠杆菌的中心代谢途径进行了模块化分析和优化。根据DDA的合成途径，将其分为上游糖酵解模块、乙酰辅酶A活化模块、酰基-ACP合成模块，通过敲除或弱化这些模块中与DDA合成竞争碳源和能量的代谢途径，如一些参与其他副产物合成的途径，使更多的葡萄糖能够转化为DDA合成所需的前体物质，从而提高了DDA的合成量，最终实现了ω-氨基十二烷酸产量的提升。还可以通过过表达关键酶基因，强化目标代谢途径，提高前体物质的合成效率。在葡萄糖代谢途径中，过表达葡萄糖转运蛋白基因，可提高细胞对葡萄糖的摄取能力，增加碳源的供应；过表达磷酸戊糖途径中的关键酶基因，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，可增强磷酸戊糖途径的活性，提高NADPH和磷酸戊糖的合成量，为乙酰辅酶A衍生化学品的合成提供更多的还原力和前体物质。此外，还可以通过引入外源基因，构建新的代谢途径，拓宽前体物质的来源，进一步满足目标产物合成的需求。三、大肠杆菌利用乙醇合成乙酰辅酶A衍生化学品3.1乙醇代谢途径及转化为乙酰辅酶A的机制野生型大肠杆菌通常无法利用乙醇进行有氧生长，然而通过代谢工程改造，可赋予其利用乙醇的能力。在改造后的大肠杆菌中，乙醇代谢主要通过乙醇脱氢酶（Alcoholdehydrogenase，ADH）和乙醛脱氢酶（Aldehydedehydrogenase，ALDH）组成的途径进行。乙醇首先在乙醇脱氢酶的催化作用下，被氧化为乙醛，这一反应伴随着辅酶NAD⁺的还原，生成NADH。乙醇脱氢酶是一种含锌的金属酶，其活性中心的锌离子在催化过程中起着关键作用，能够稳定底物乙醇的构象，促进电子的转移，从而实现乙醇向乙醛的转化。不同来源的乙醇脱氢酶在催化活性、底物特异性和辅酶偏好性等方面存在差异。例如，来源于酿酒酵母的乙醇脱氢酶对乙醇具有较高的亲和力，能够在较低的乙醇浓度下有效地催化反应；而一些细菌来源的乙醇脱氢酶可能对辅酶NADP⁺具有更高的亲和力，在不同的代谢环境中发挥作用。生成的乙醛进一步在乙醛脱氢酶的作用下被氧化为乙酸，同时辅酶NAD⁺再次被还原为NADH。乙醛脱氢酶同样是一类重要的酶，根据其亚细胞定位和催化特性，可分为多种类型，如细胞质中的乙醛脱氢酶、线粒体中的乙醛脱氢酶等。不同类型的乙醛脱氢酶在乙醛代谢过程中承担着不同的功能，其表达和活性受到细胞内多种因素的调控。例如，在某些环境胁迫条件下，细胞可能会上调特定类型乙醛脱氢酶的表达，以增强对乙醛的代谢能力，维持细胞内的代谢平衡。乙酸在乙酰辅酶A合成酶（Acetyl-CoAsynthetase，ACS）的作用下，与辅酶A结合，并消耗ATP，生成乙酰辅酶A。这一过程不仅为细胞提供了重要的代谢中间体乙酰辅酶A，使其能够进入三羧酸循环参与能量代谢，还为乙酰辅酶A衍生化学品的合成提供了前体物质。乙酰辅酶A合成酶是一种多功能酶，除了催化乙酸生成乙酰辅酶A外，还参与其他有机酸的活化过程。其活性受到细胞内能量状态、代谢物浓度等多种因素的调控。当细胞内ATP水平较高时，乙酰辅酶A合成酶的活性可能会增强，促进乙酸的活化和乙酰辅酶A的合成；而当细胞内乙酰辅酶A浓度过高时，可能会反馈抑制乙酰辅酶A合成酶的活性，以维持细胞内代谢物的平衡。在整个乙醇代谢过程中，电子传递和辅酶再生起着至关重要的作用。乙醇氧化产生的NADH可以通过电子传递链将电子传递给氧气，生成水，并在此过程中偶联ATP的合成，为细胞提供能量。这一过程涉及到多个电子传递体，如黄素蛋白、细胞色素等，它们在细胞膜上有序排列，形成了一个高效的电子传递系统。通过这个系统，NADH携带的电子逐步传递，释放出的能量用于驱动质子跨膜运输，形成质子梯度，进而推动ATP的合成。此外，细胞内还存在一些辅酶再生系统，以维持辅酶NAD⁺和NADH的平衡。例如，磷酸戊糖途径可以产生NADPH，通过转氢酶的作用，NADPH可以将氢原子转移给NAD⁺，生成NADH，从而实现辅酶的再生和循环利用。这种辅酶再生机制对于维持乙醇代谢途径的持续运行以及细胞内的氧化还原平衡具有重要意义。如果辅酶再生过程受到抑制，NADH积累，会导致乙醇代谢途径的受阻，影响乙酰辅酶A的合成以及细胞的正常生长和代谢。3.2利用乙醇合成乙酰辅酶A衍生化学品的案例分析3.2.1异丙醇的合成异丙醇作为一种重要的化工原料，在化工、制药、电子等多个领域具有广泛的应用。在化工领域，它常被用作溶剂，能够溶解多种有机化合物，广泛应用于涂料、油墨、胶粘剂等产品的生产过程中，有助于提高产品的性能和质量；它也是合成其他化学品的重要中间体，可用于制备丙酮、异丙醚、乙酸异丙酯等多种有机化合物，这些化合物在工业生产中又有着各自重要的用途，如丙酮是一种重要的有机溶剂和化工原料，广泛应用于塑料、橡胶、纤维等行业。在制药领域，异丙醇常用于药物的提取、分离和纯化过程，它能够有效地溶解药物成分，提高药物的纯度和稳定性，同时，它还可作为药物制剂中的溶剂或辅料，参与药物的配方设计，影响药物的释放速度和生物利用度。在电子领域，异丙醇因其良好的溶解性和挥发性，常被用于清洗电子元器件，能够快速去除元器件表面的油污、杂质和水分，保证电子设备的正常运行，提高电子设备的性能和可靠性。在传统的异丙醇生产中，主要依赖化学合成法，其中丙烯间接水合法和丙烯直接水合法是较为常见的工艺。丙烯间接水合法，又称硫酸酯化水解法，丙烯与浓硫酸进行酯化反应生成硫酸二异丙酯和硫酸氢异丙酯，再通过水蒸气处理、水解，制得粗醇，最后经过精馏得到高纯异丙醇。虽然该方法能够利用便宜的低纯度丙烯和硫酸作为催化剂，丙烯转化率达90%以上，粗醇产品浓度可达60%左右，在一定程度上减少了产品精制的消耗，但它存在着明显的缺点。该工艺的流程较为复杂，涉及多个反应步骤和分离过程，增加了生产的复杂性和成本；产品选择性较低，在反应过程中会产生较多的副产物，影响异丙醇的纯度和质量；硫酸回收利用耗蒸汽量高，需要消耗大量的能源来实现硫酸的回收和循环使用，这不仅增加了生产成本，还对环境造成了较大的压力；硫酸对设备腐蚀严重，需要使用耐腐蚀的设备材料，增加了设备投资成本，同时，设备的维护和更换也较为频繁，进一步提高了生产的总成本；废弃物处理难度大，反应过程中产生的废硫酸和其他废弃物对环境具有较大的危害，需要进行特殊的处理，这也增加了生产的复杂性和成本。由于这些缺点，丙烯间接水合法越来越难以适应绿色工业发展的需求，现已基本被淘汰。丙烯直接水合法是目前应用较为广泛的生产方法之一，丙烯在催化剂作用下与水一步反应合成异丙醇，在生产异丙醇的同时还会副产正丙醇、异丙醚等。根据反应物状态，该方法可分为气相直接水合法、液相直接水正当和气-液混相水正当。气相直接水合法，又称维巴法，采用磷酸/硅藻土催化剂，反应时主要通过催化剂表面空隙内的磷酸液膜起催化作用。与丙烯间接水合法相比，该方法的工艺流程相对简单，减少了反应步骤和分离过程，降低了生产的复杂性；腐蚀和环境污染问题也得到了较大改善，减少了对设备的腐蚀和对环境的危害；异丙醇选择性高达98%，能够生产出高纯度的异丙醇产品。然而，该方法也存在一些局限性。为了避免催化剂磷酸溶出失效，需要在高温低压下把水转化为气态通入反应器，采用了对平衡不利的高温低压操作，这使得丙烯单程转化率降低（5%～6%），大量未反应的丙烯需循环使用，导致能耗增大，增加了生产成本；原料丙烯的质量要求较高，纯度最好达到99%以上，这必然提高了生产成本；催化剂中磷酸会不断流失，故生产上需补加磷酸，这不仅增加了生产操作的复杂性，还增加了生产成本。液相直接水合法，以德山曹达法为代表，选用了钨系多阴离子水溶液作为催化剂，该催化剂具有活性高、寿命长、性能比较稳定的优点，克服了磷酸/硅藻土催化剂中磷酸容易流失的问题，并可循环使用。在该方法中，丙烯在催化剂水溶液中与多阴离子络合，与传统的硫酸间接水合法相比，反应速率增大了数倍，丙烯单程转化率达成70%，产品选择性达96%。但是，该工艺也存在一些缺点。反应采用的水烯比大，造成粗异丙醇溶液中含有大量水，蒸馏提纯时需要消耗大量的热量来去除水分，增加了能源消耗和生产成本；反应压力高（20～25MPa），需要使用耐压设备，这不仅增加了设备投资成本，还对设备的安全性和稳定性提出了更高的要求。气-液混相水合法，以德士古法为代表，以离子交换树脂为催化剂，采用中压6～8MPa、低温140～160℃的工艺条件，这种条件有助于化学平衡，使丙烯的单程转化率能够保持70%以上，异丙醇选择性达成96%以上。与前面两种直接水合法相比，气-液混相水合法具有诸多优点。它无需高纯度丙烯，降低了对原料的要求，从而降低了生产成本；大量未反应的丙烯无需循环使用，减少了能源消耗和设备投资；反应条件相对缓和，降低了对设备的要求，减少了设备投资和运行成本；丙烯的转化率高，能耗低，提高了生产效率，降低了生产成本。然而，该方法也存在一些不足之处。催化剂不耐高温、寿命短、价格昂贵，这不仅增加了催化剂的更换频率和成本，还对生产的连续性和稳定性造成了一定的影响。随着科技的发展和对绿色化学的追求，生物合成法因其具有可持续性和环境友好等优点，逐渐成为异丙醇生产领域的研究热点。近日，华东理工大学生物工程学院吴辉教授研究团队在该领域取得了重要进展，相关成果发表在《ACSSustainableChemistry&Engineering》期刊上。该研究通过构建工程化的大肠杆菌，开展了以乙醇为底物合成异丙醇的研究，结果证明了基于合成气来源的乙醇生物炼制平台的巨大潜力。野生型大肠杆菌通常无法利用乙醇进行有氧生长，研究团队通过引入双功能氧化还原酶突变体AdhEA267T/E568K，成功赋予了大肠杆菌利用乙醇的能力。携带乙醇利用途径的大肠杆菌能够在50h内以乙醇为唯一碳源快速生长，这为后续利用乙醇合成异丙醇奠定了基础。在此基础上，研究团队进一步引入异丙醇合成途径，初步实现了异丙醇的生产，产量达到2.01g/L。为了进一步提高异丙醇的生产能力，研究团队探索了两种有效的代谢工程策略。第一种策略是通过生长期依赖型启动子（GPPs）动态调控TCA循环关键酶——异柠檬酸脱氢酶icd的表达。在细胞生长的不同阶段，TCA循环的通量需求不同。在生长初期，细胞需要大量的能量和前体物质来支持自身的生长和增殖，此时TCA循环通量较高；而在生长后期，细胞的生长速度减缓，对能量和前体物质的需求也相应减少，此时可以适当降低TCA循环通量，将更多的碳通量导向异丙醇合成途径。通过GPPs动态调控icd的表达，能够根据细胞生长状态重新定向生物质和异丙醇之间的碳通量，使异丙醇的产量提高到了2.44g/L，得率为0.24g/g。这种策略有效地提高了碳源的利用效率，减少了碳源在生物质合成中的浪费，使更多的碳源能够转化为目标产物异丙醇。第二种策略是通过过表达内源转氢酶pntAB提高细胞内NADPH的供应。在异丙醇合成过程中，需要大量的NADPH作为还原力参与反应。然而，在野生型大肠杆菌中，NADPH的供应往往无法满足异丙醇合成的需求，这限制了异丙醇的产量。通过过表达pntAB，能够增强细胞内的转氢作用，将NADH转化为NADPH，从而提高细胞内NADPH的水平。实验结果表明，过表达pntAB后，异丙醇的效价提高到了4.41g/L，得率为0.44g/g，是对照菌株的2.2倍。这表明提高NADPH的供应能够显著促进异丙醇的合成，为异丙醇的高效生产提供了有力的支持。该研究构建的大肠杆菌工程菌株在利用乙醇高效生产异丙醇方面展现出了巨大的潜力。通过代谢工程策略的优化，有效地提高了异丙醇的产量和得率，为异丙醇的生物合成提供了新的技术手段和理论依据。然而，要实现该技术的工业化应用，仍面临一些挑战。在大规模发酵过程中，如何维持工程菌株的遗传稳定性是一个关键问题。由于基因工程菌株在传代过程中可能会发生基因突变或基因丢失等现象，导致菌株的性能下降，因此需要开发有效的遗传稳定性维持技术，确保菌株在长期发酵过程中能够稳定地表达目标基因和代谢途径。如何进一步优化发酵工艺，提高发酵效率和降低生产成本也是需要解决的重要问题。这包括优化培养基配方、发酵条件（如温度、pH值、溶氧等）以及发酵过程的控制策略等，以实现乙醇的高效利用和异丙醇的最大化生产。此外，还需要解决产物分离和纯化等下游工艺问题，提高异丙醇的纯度和质量，降低分离纯化成本，以满足工业生产的需求。未来的研究可以围绕这些挑战展开，进一步完善基于乙醇的异丙醇生物合成技术，推动其在工业生产中的应用，为实现绿色、可持续的异丙醇生产提供技术支持。3.2.23-羟基丙酸的合成3-羟基丙酸（3-HP）作为一种重要的三碳非手性有机酸，与乳酸（2-羟基丙酸）互为同分异构体，在化工领域占据着重要地位，被美国能源部（DOE）列为2004年提出的12种重要平台化合物的第四位。其分子结构中含有羟基和羧基这两种活性官能团，这赋予了3-HP独特的化学性质，使其能够参与多种化学反应，进而用于合成多种多样的化学衍生物。例如，通过脱水反应，3-HP可以转化为丙烯酸，丙烯酸是一种重要的有机化工原料，广泛应用于合成树脂、涂料、胶粘剂等领域；通过加氢反应，3-HP可以生成1,3-丙二醇，1,3-丙二醇是生产聚酯、聚醚等高分子材料的重要单体；3-HP还可以与其他化合物发生酯化、酰胺化等反应，生成甲基丙烯酸盐、丙烯酰胺、丙二酸等衍生物，这些衍生物在塑料、纤维、橡胶、医药等行业都有着广泛的应用。目前，3-HP的合成方法主要包括化学合成法和生物合成法。化学合成法通常需要使用具有毒性或昂贵的底物和催化剂，这不仅对环境造成潜在的危害，还增加了生产成本。例如，某些化学合成方法中使用的催化剂可能含有重金属，在生产过程中会产生大量的废弃物，对环境造成污染；同时，这些催化剂的价格昂贵，增加了生产成本，使得化学合成法在实际应用中受到一定的限制。相比之下，生物合成法因其具有可持续性和环境友好等优点，逐渐成为研究的热点。生物合成法利用微生物的代谢能力，将可再生的碳源转化为3-HP，避免了使用有毒有害的底物和催化剂，减少了对环境的污染。同时，生物合成法可以利用生物质等可再生资源作为原料，实现碳资源的循环利用，具有良好的可持续性。近期，华东理工大学生物工程学院吴辉教授研究团队在利用大肠杆菌以乙醇为碳源合成3-HP的研究中取得了显著进展，相关成果发表于《BioresourceTechnology》期刊。该研究通过构建工程化的大肠杆菌，为3-HP的生物合成提供了新的策略和方法。野生型大肠杆菌无法利用乙醇进行有氧生长，研究团队首先将双功能氧化还原酶突变体AdhEA267T/E568K引入大肠杆菌，使得携带乙醇利用途径的大肠杆菌能够在50h内以乙醇为唯一碳源快速生长。在此基础上，研究团队引入3-羟基丙酸合成途径，初步实现了3-HP的生产，产量达到1.51g/L。为了深入了解3-HP合成的代谢机制，并进一步提高其产量，研究团队对乙醛酸循环、TCA氧化分支以及辅因子对3-HP生产的影响进行了全面而深入的探索。乙醛酸循环是微生物代谢中的一条重要途径，它能够在某些条件下补充TCA循环的中间产物，同时也与碳源的利用和能量代谢密切相关。TCA氧化分支则涉及到TCA循环中不同代谢途径的分支点和调控机制，对细胞的能量产生和物质合成具有重要影响。辅因子如NADPH等在生物合成过程中起着关键作用，它们作为电子供体或受体，参与多种酶促反应，对代谢途径的进行和产物的合成具有重要的调控作用。研究结果显示，TCA氧化臂的动态调控和乙醛酸途径的控制能够有效地调节菌体的生长速度和最终菌体浓度。在3-HP合成过程中，TCA氧化臂的通量变化会影响细胞的能量代谢和碳源分配。当TCA氧化臂通量较高时，细胞能够产生更多的能量，但同时也会消耗更多的碳源用于细胞生长和维持代谢平衡，可能会减少用于3-HP合成的碳源供应；而当TCA氧化臂通量较低时，虽然可以节省碳源用于3-HP合成，但可能会影响细胞的生长和代谢活性。因此，通过动态调控TCA氧化臂，可以根据细胞生长和3-HP合成的需求，合理分配碳源和能量，从而有效地调节菌体的生长速度和最终菌体浓度。乙醛酸途径的控制也具有重要意义。乙醛酸途径可以在特定条件下将乙酸等碳源转化为TCA循环的中间产物，补充细胞的代谢需求。通过调节乙醛酸途径的关键酶活性或基因表达，可以控制乙醛酸途径的通量，进而影响细胞的碳源利用和代谢平衡，最终调节菌体的生长速度和最终菌体浓度。为了增加3-HP合成途径所需辅酶NADPH的供应，研究团队采取了一系列有效的策略。首先，将内源转氢酶编码基因pntAB启动子替换为组成型强启动子。在野生型大肠杆菌中，pntAB的表达受到严格的调控，其启动子的活性较低，导致转氢酶的表达量不足，从而限制了NADPH的供应。通过将启动子替换为组成型强启动子，可以使pntAB在细胞内持续高表达，增强转氢酶的活性，促进NADPH的生成。实验结果表明，这一策略使得3-HP产量提升至1.65g/L，证明了通过调节辅酶供应可以有效地提高3-HP的产量。此外，研究团队还对工程菌株的生产潜力进行了全面评估。将生产能力最好的工程菌株进行全细胞催化，产量达到3.17g/L。在此基础上，研究团队进一步对底物浓度、温度以及催化培养基等因素进行了优