巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白免疫保护效果及机制探究

巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白免疫保护效果及机制探究一、引言1.1研究背景与意义鸡球虫病是由艾美耳球虫属的多种球虫寄生于鸡肠道内所引起的一种寄生虫病，是对养鸡业危害最为严重的疾病之一。据统计，全球家禽业每年因球虫病造成的经济损失高达数十亿美元，给养鸡业带来了沉重的打击。球虫的种类繁多，能感染鸡的艾美耳球虫主要有7种，分别是柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）、堆型艾美耳球虫（Eimeriaacervulina）、毒害艾美耳球虫（Eimerianecatrix）、巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）、和缓艾美耳球虫（Eimeriamitis）、布氏艾美耳球虫（Eimeriabrunetti）和早熟艾美耳球虫（Eimeriapraecox），它们在鸡的肠道内寄生部位各异，致病力也有所不同。巨型艾美耳球虫是鸡球虫中较为常见且危害较大的一种。它主要寄生于鸡的小肠中段，感染后会导致小肠黏膜出现严重的病变，肠壁增厚、出血，肠道消化和吸收功能受到严重影响。病鸡表现为精神萎靡、食欲不振、腹泻、便血等症状，生长发育受阻，饲料转化率降低，严重时可导致鸡只死亡，给养殖户带来巨大的经济损失。目前，鸡球虫病的防控主要依赖于药物防治和疫苗免疫。然而，长期大量使用抗球虫药物，使得球虫对多种药物产生了耐药性，导致药物防治效果逐渐下降。同时，药物残留问题也日益凸显，严重影响了鸡肉和鸡蛋的品质安全，威胁着人类健康。传统的活疫苗虽然具有一定的免疫效果，但存在制作过程复杂、需要低温保存、保存期短以及使用不当易导致免疫失败等缺点，限制了其在养鸡业中的广泛应用。随着分子生物学和免疫学技术的不断发展，基因工程疫苗成为了鸡球虫病防控研究的热点。重组配子体蛋白疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，具有安全性高、免疫原性强、易于制备和保存等优点，为鸡球虫病的防治提供了新的思路和方法。研究巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白的免疫保护效果，对于开发高效、安全的鸡球虫病新型疫苗具有重要的理论意义和实际应用价值。一方面，深入了解重组配子体蛋白激发机体免疫应答的机制，能够为疫苗的设计和优化提供坚实的理论基础，有助于提升疫苗的免疫效果；另一方面，研发出有效的重组配子体蛋白疫苗，能够在养鸡生产中广泛应用，显著降低鸡球虫病的发生率和危害程度，提高养鸡业的经济效益和社会效益，保障鸡肉和鸡蛋的质量安全，促进养鸡业的健康可持续发展。1.2国内外研究现状在国外，鸡球虫病的研究起步较早，对巨型艾美耳球虫的生物学特性、致病机制等方面已经有了较为深入的了解。学者们发现巨型艾美耳球虫的生活史包括无性生殖和有性生殖两个阶段，在鸡体内的发育过程会对肠道组织造成严重的损伤，影响肠道的正常功能。关于球虫病的防控，早期主要依赖化学药物，如磺胺类、呋喃类等药物被广泛应用。但随着时间的推移，球虫对这些药物的耐药性问题逐渐凸显。于是，疫苗的研究成为了重点方向，活疫苗在一定程度上解决了药物耐药性的问题，但存在的缺陷也限制了其广泛应用。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，国外对重组配子体蛋白疫苗的研究取得了不少成果。有研究通过基因工程技术表达了巨型艾美耳球虫的配子体蛋白，并对其免疫原性进行了评估，发现该重组蛋白能够刺激机体产生一定的免疫应答，为重组配子体蛋白疫苗的开发奠定了基础。国内对于鸡球虫病的研究也在不断深入。在巨型艾美耳球虫的研究方面，国内学者对其在国内的流行情况、感染特点等进行了大量的调查和分析，明确了其在不同地区养鸡场的感染率和分布情况。在防治手段上，早期同样以药物防治为主，随着对食品安全和药物残留问题的重视，国内也加大了对疫苗的研究力度。对于重组配子体蛋白疫苗，国内众多科研团队开展了相关研究，通过优化基因表达系统、改进蛋白纯化方法等手段，提高重组配子体蛋白的表达量和纯度，并对其免疫保护效果进行了多方面的评价。例如，有研究将重组配子体蛋白与不同的佐剂联合使用，观察其对免疫效果的影响，发现合适的佐剂能够显著增强重组蛋白的免疫原性，提高免疫保护效果。尽管国内外在巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白的研究上取得了一定的进展，但仍存在一些不足之处。一方面，目前对于重组配子体蛋白激发机体免疫应答的详细机制尚未完全明确，这限制了疫苗的进一步优化和改进。不同的免疫途径、免疫剂量以及佐剂的选择等因素对免疫效果的影响还需要深入研究，以确定最佳的免疫方案。另一方面，现有的研究大多集中在实验室阶段，在实际生产中的应用还存在一定的差距。重组配子体蛋白疫苗的大规模生产工艺、稳定性、保存条件以及成本效益等问题都需要进一步解决，以实现其在养鸡业中的广泛应用。1.3研究目的与内容本研究旨在深入探究巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白的免疫保护效果，为开发高效、安全的鸡球虫病新型疫苗提供关键的理论依据和实践指导。具体研究目标如下：首先，明确巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白单独免疫以及不同组合联合免疫时，对鸡体产生的免疫保护效果，包括免疫后鸡体对球虫感染的抵抗力、临床症状的改善情况等。其次，筛选出针对巨型艾美耳球虫的最佳免疫组合，即确定哪种重组配子体蛋白或蛋白组合能够激发鸡体产生最为有效的免疫应答，提供最强的免疫保护。再者，研究不同佐剂与重组配子体蛋白联合使用时对免疫效果的影响，筛选出能够显著增强重组配子体蛋白免疫原性的最佳佐剂，以提高疫苗的免疫效果。为实现上述研究目标，本研究将开展以下内容的研究：一是进行巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白的制备，利用基因工程技术，克隆、表达和纯化巨型艾美耳球虫的重组配子体蛋白，为后续的免疫试验提供充足的蛋白材料。二是设计并实施免疫试验，将制备好的重组配子体蛋白以不同的组合方式和免疫剂量免疫鸡只，同时设置相应的对照组，包括未免疫攻虫组和空白对照组。三是进行攻虫试验，在免疫鸡只达到一定时间后，用巨型艾美耳球虫对其进行攻虫，观察鸡只的发病情况、临床表现，如精神状态、采食情况、腹泻和便血等症状。四是检测免疫指标，通过检测鸡只的存活率、排出血便数、平均增重、相对增重率、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数（ACI）和血清特异性抗体水平等指标，综合评价重组配子体蛋白的免疫保护效果。五是佐剂筛选试验，将不同的佐剂与重组配子体蛋白联合使用，重复上述免疫试验和攻虫试验，比较不同佐剂对免疫效果的影响，筛选出最佳佐剂。1.4研究方法与技术路线本研究综合运用多种先进的科学方法，从基因层面到动物实验，逐步深入探究巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白的免疫保护效果。在基因克隆与蛋白表达纯化方面，首先从巨型艾美耳球虫中精准提取总RNA，通过反转录巧妙地获得cDNA。接着，运用聚合酶链式反应（PCR）技术，以cDNA为模板，根据目的基因的特定序列设计引物，扩增出所需的重组配子体蛋白基因片段。将扩增得到的基因片段与合适的表达载体进行连接，构建出重组表达质粒。随后，把重组表达质粒转化至大肠杆菌等合适的表达宿主中，通过优化诱导表达条件，如诱导剂浓度、诱导时间和温度等，实现重组配子体蛋白的高效表达。表达后的蛋白经过一系列纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析等，去除杂质，获得高纯度的重组配子体蛋白，为后续实验提供优质的蛋白材料。动物免疫试验是本研究的关键环节。选用健康、体重相近的雏鸡作为实验动物，将其随机分为多个组，包括不同重组配子体蛋白免疫组、联合免疫组、佐剂与重组配子体蛋白联合免疫组、未免疫攻虫组和空白对照组。在免疫过程中，严格按照既定的免疫程序进行操作，确定合适的免疫剂量和免疫途径。例如，采用肌肉注射、皮下注射或口服等方式将重组配子体蛋白或其与佐剂的混合物接种到雏鸡体内。在规定的时间间隔后，对雏鸡进行加强免疫，以增强免疫效果。攻虫试验在免疫后的特定时间进行。用含有一定数量巨型艾美耳球虫孢子化卵囊的悬液对免疫组和未免疫攻虫组的雏鸡进行攻虫感染。攻虫后，密切观察雏鸡的发病情况，详细记录每只雏鸡的精神状态、采食情况、是否出现腹泻、便血等临床症状，以及发病的时间和严重程度。检测分析环节运用多种检测技术，全面评估重组配子体蛋白的免疫保护效果。每天仔细记录雏鸡的存活情况，统计存活率。通过观察和计数雏鸡排出的血便堆数，了解肠道出血情况。定期称量雏鸡的体重，计算平均增重和相对增重率，评估生长发育受影响程度。在攻虫后的特定时间，对雏鸡进行解剖，观察肠道病变情况，按照标准的病变记分方法对肠道病变进行评分，量化病变程度。收集雏鸡的粪便，采用饱和盐水漂浮法等方法检测粪便中的卵囊数量，计算卵囊减少率，反映免疫对球虫繁殖的抑制作用。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法检测血清中特异性抗体水平，了解体液免疫应答情况。本研究的技术路线以基因克隆和蛋白表达纯化为起点，获得重组配子体蛋白。然后，通过动物免疫试验和攻虫试验，模拟实际感染情况。最后，利用多种检测分析方法，从不同角度综合评价重组配子体蛋白的免疫保护效果，为鸡球虫病新型疫苗的开发提供全面、可靠的依据，具体技术路线如图1所示。[此处插入技术路线图，图中详细展示从基因克隆开始，到蛋白表达纯化、动物分组免疫、攻虫试验以及各项指标检测分析的整个流程，各步骤之间用箭头清晰连接，并标注关键操作和参数。例如，基因克隆部分标注提取RNA、反转录、PCR扩增的主要试剂和条件；蛋白表达纯化部分标注表达宿主、诱导剂及纯化方法；动物分组免疫部分列出各组别及免疫方式、剂量；攻虫试验标注攻虫时间、卵囊剂量；检测分析部分标注各项指标的检测时间和方法。][此处插入技术路线图，图中详细展示从基因克隆开始，到蛋白表达纯化、动物分组免疫、攻虫试验以及各项指标检测分析的整个流程，各步骤之间用箭头清晰连接，并标注关键操作和参数。例如，基因克隆部分标注提取RNA、反转录、PCR扩增的主要试剂和条件；蛋白表达纯化部分标注表达宿主、诱导剂及纯化方法；动物分组免疫部分列出各组别及免疫方式、剂量；攻虫试验标注攻虫时间、卵囊剂量；检测分析部分标注各项指标的检测时间和方法。]二、巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白的制备2.1相关基因的获取与分析本研究选用实验室保存的具有代表性的巨型艾美耳球虫虫株作为研究对象。从感染巨型艾美耳球虫的鸡肠道组织中，小心地收集球虫，确保收集过程中尽量减少杂质的混入。采用Trizol试剂法提取球虫的总RNA，该方法利用Trizol试剂能够迅速裂解细胞并抑制RNA酶活性的特性，有效地从复杂的生物样品中提取高质量的RNA。在提取过程中，严格按照试剂说明书的操作步骤进行，从匀浆处理到多次离心分离，每一步都确保操作的准确性和规范性，以保证获得纯度高、完整性好的总RNA。随后，利用反转录试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA，反转录过程中选用的试剂盒具有高效的反转录酶，能够以RNA为模板准确地合成互补的cDNA链。通过优化反转录反应条件，如反应温度、时间以及引物的选择等，确保反转录反应的高效进行，获得足量的cDNA用于后续的基因扩增。根据GenBank中已公布的巨型艾美耳球虫配子体蛋白基因序列，运用专业的引物设计软件，如PrimerPremier5.0，精心设计特异性引物。在设计引物时，充分考虑引物的长度、GC含量、Tm值以及引物之间是否存在二聚体等因素，以确保引物能够特异性地扩增目的基因。引物设计完成后，通过NCBI的BLAST工具进行比对分析，进一步验证引物的特异性，避免引物与其他非目的基因序列发生非特异性结合。以反转录得到的cDNA为模板，使用高保真的DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系经过多次优化，确定了各成分的最佳浓度，包括模板cDNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶以及缓冲液等。反应条件也经过反复摸索，确定了合适的变性温度、退火温度和延伸时间，以保证扩增反应的特异性和高效性。例如，变性温度设置为95℃，使DNA双链充分解链；退火温度根据引物的Tm值进行调整，一般在55-60℃之间，确保引物能够与模板特异性结合；延伸时间则根据目的基因的长度进行设定，保证DNA聚合酶能够沿着模板准确地合成新的DNA链。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。将扩增产物与DNAMarker一起上样到含有核酸染料的琼脂糖凝胶中，在合适的电压下进行电泳分离。在电泳过程中，DNA分子在电场的作用下向正极移动，根据其分子量的大小在凝胶中形成不同的条带。通过观察凝胶上条带的位置和亮度，与DNAMarker进行对比，判断扩增产物的大小和纯度。如果扩增产物条带清晰、单一，且大小与预期相符，则说明扩增成功；若出现多条非特异性条带，则需要进一步优化PCR反应条件，如调整引物浓度、改变退火温度等，或者重新设计引物。将扩增得到的目的基因片段连接到pMD18-T载体上，构建重组克隆质粒。连接反应使用高效的DNA连接酶，在合适的温度和时间条件下，将目的基因片段与载体进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过热激法使感受态细胞吸收重组质粒。将转化后的细胞涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，使转化成功的细胞形成单菌落。利用蓝白斑筛选法初步筛选阳性克隆，白色菌落表示含有重组质粒，而蓝色菌落则表示载体自身环化。对筛选出的白色菌落进行PCR鉴定和酶切鉴定，进一步验证重组质粒的正确性。PCR鉴定使用与扩增目的基因相同的引物，对菌落进行扩增，若能扩增出与目的基因大小一致的条带，则说明该菌落含有重组质粒；酶切鉴定则使用特定的限制性内切酶对重组质粒进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物的条带大小，与预期的酶切图谱进行对比，进一步确认重组质粒的构建是否正确。将鉴定正确的重组克隆质粒送往专业的测序公司进行测序。测序结果通过DNAStar、DNAMAN等生物信息学软件与GenBank中已有的巨型艾美耳球虫配子体蛋白基因序列进行比对分析，以确定所克隆的基因序列的准确性和同源性。同时，利用这些软件对基因的开放阅读框（ORF）进行预测，分析基因的编码区，确定其起始密码子和终止密码子的位置。通过对基因序列的分析，预测其编码的氨基酸序列，进一步对氨基酸序列进行分析，包括预测蛋白质的分子量、等电点、亲疏水性、信号肽、跨膜结构域以及潜在的抗原表位等。例如，使用ProtParam工具预测蛋白质的分子量和等电点；利用SignalP软件预测信号肽；通过TMHMMServerv.2.0预测跨膜结构域；运用在线的抗原表位预测工具，如ABCpred、BepiPred等，预测潜在的抗原表位，为后续对重组配子体蛋白的功能研究和免疫原性分析提供重要的理论依据。2.2基因克隆与载体构建将测序正确的重组克隆质粒和表达载体pET-32a(+)分别用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切。酶切体系按照限制性内切酶的说明书进行配制，确保酶切反应的高效进行。将重组克隆质粒和表达载体pET-32a(+)加入到含有相应限制性内切酶、缓冲液和BSA的反应体系中，在37℃条件下孵育一定时间，使酶切反应充分进行。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，利用凝胶回收试剂盒从凝胶中回收目的基因片段和线性化的表达载体片段，确保回收的片段纯度高、完整性好。将回收的目的基因片段与线性化的表达载体pET-32a(+)按照一定的摩尔比混合，加入T4DNA连接酶和连接缓冲液，在16℃条件下连接过夜。连接反应利用T4DNA连接酶能够催化DNA片段之间形成磷酸二酯键的特性，将目的基因片段与表达载体连接起来，构建成重组表达质粒pET-32a-EmGAM。连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，采用热激法进行转化。将连接产物加入到感受态细胞中，冰浴一段时间，使DNA与感受态细胞充分接触，然后迅速放入42℃水浴中热激一定时间，再立即冰浴，使感受态细胞吸收重组质粒。将转化后的细胞涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，使转化成功的细胞形成单菌落。从平板上挑取单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取重组表达质粒，进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。PCR鉴定使用与扩增目的基因相同的引物，对重组表达质粒进行扩增，若能扩增出与目的基因大小一致的条带，则说明重组表达质粒中含有目的基因；酶切鉴定使用与构建重组表达质粒时相同的限制性内切酶对重组表达质粒进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物的条带大小，与预期的酶切图谱进行对比，进一步确认重组表达质粒的构建是否正确；测序鉴定则将重组表达质粒送往专业的测序公司进行测序，将测序结果与目的基因序列进行比对，确保目的基因正确插入到表达载体中，且序列无突变。经过鉴定，成功构建了重组表达质粒pET-32a-EmGAM，为后续的蛋白表达和免疫保护效果研究奠定了基础。2.3重组蛋白的表达与纯化将鉴定正确的重组表达质粒pET-32a-EmGAM转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（OD600值达到0.6-0.8）。向培养物中加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导重组蛋白的表达。设置不同的诱导时间（如3h、4h、5h、6h）和诱导温度（如25℃、30℃、37℃），以优化重组蛋白的表达条件。诱导结束后，将培养物在4℃、5000rpm条件下离心10min，收集菌体沉淀。用适量的PBS缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎菌体细胞，超声条件为功率300W，工作3s，间歇5s，总时间10min。超声破碎后，将裂解液在4℃、12000rpm条件下离心30min，分别收集上清液和沉淀，通过SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达形式。结果显示，重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。对于包涵体形式存在的重组蛋白，采用尿素洗涤法进行处理。将包涵体沉淀用含有2M尿素的PBS缓冲液洗涤3次，每次在4℃、12000rpm条件下离心30min，去除杂蛋白。然后用含有8M尿素的PBS缓冲液溶解包涵体，在4℃搅拌过夜，使重组蛋白充分溶解。采用镍离子亲和层析柱对溶解的重组蛋白进行纯化。首先用含有20mM咪唑的PBS缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，然后将溶解的重组蛋白上样到层析柱中。用含有20mM咪唑的PBS缓冲液洗脱杂蛋白，直至流出液的OD280值接近基线。最后用含有250mM咪唑的PBS缓冲液洗脱目的重组蛋白，收集洗脱峰。通过SDS-PAGE电泳检测纯化后的重组蛋白，结果显示，纯化后的重组蛋白条带单一，纯度较高。将纯化后的重组蛋白进行透析复性。将重组蛋白溶液装入透析袋中，放入含有20mMTris-HCl（pH8.0）、100mMNaCl、1mMEDTA、10%甘油的透析缓冲液中，4℃透析过夜，去除尿素和咪唑等杂质。透析结束后，将重组蛋白溶液在4℃、12000rpm条件下离心30min，去除不溶性杂质。采用BCA蛋白定量试剂盒测定重组蛋白的浓度，将重组蛋白分装后，保存于-80℃冰箱中备用。2.4重组蛋白的鉴定将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，以确定其分子量大小。制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，按照标准的SDS-PAGE操作流程进行电泳。将适量的重组蛋白样品与上样缓冲液混合，在100℃条件下加热5min，使蛋白质充分变性。取变性后的样品加入到凝胶的加样孔中，同时加入蛋白Marker作为分子量标准。在恒压条件下进行电泳，先在浓缩胶中以80V的电压电泳，待样品进入分离胶后，将电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶取出，用考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，然后用脱色液进行脱色，直至背景清晰，条带明显。通过观察凝胶上重组蛋白条带的位置，并与蛋白Marker进行对比，确定重组蛋白的分子量。结果显示，重组蛋白的分子量约为[X]kDa，与预期的分子量大小相符。为了进一步鉴定重组蛋白的抗原性，进行Westernblot分析。将SDS-PAGE后的凝胶通过半干转膜法转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上。转膜条件为：电流250mA，时间30min。转膜结束后，将NC膜取出，用5%脱脂奶粉封闭液在37℃条件下封闭1h，以防止非特异性结合。封闭后，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次5min。然后将NC膜与制备的兔抗巨型艾美耳球虫多克隆抗体（一抗）在4℃条件下孵育过夜。一抗孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min。接着将NC膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（二抗）在37℃条件下孵育1h。二抗孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min。最后，用化学发光底物（ECL）对NC膜进行显色，在暗室中曝光显影，观察条带。结果显示，在与重组蛋白分子量相对应的位置出现了特异性条带，表明重组蛋白能够与兔抗巨型艾美耳球虫多克隆抗体发生特异性结合，具有良好的抗原性。三、免疫保护效果的评价指标与方法3.1动物模型的建立本研究选用14日龄健康的SPF雏鸡作为动物模型。SPF雏鸡具有无特定病原体感染的特性，能够排除其他病原体对实验结果的干扰，保证实验的准确性和可靠性。在实验开始前，对雏鸡进行严格的健康检查，确保其精神状态良好、采食正常、无明显疾病症状。将雏鸡饲养于专门的隔离饲养室内，饲养室环境保持清洁、干燥，温度控制在30-32℃，相对湿度维持在60%-70%。采用自然光照和人工补光相结合的方式，保证雏鸡每天有12-14小时的光照时间。饲养室内配备自动饮水系统和采食槽，为雏鸡提供充足、清洁的饮水和营养均衡的全价饲料，饲料中不添加任何抗球虫药物，以避免对实验结果产生影响。将雏鸡随机分为多个组，每组[X]只。具体分组如下：重组配子体蛋白单独免疫组，分别设不同的免疫剂量组，如低剂量组、中剂量组和高剂量组，用于探究不同剂量的重组配子体蛋白单独免疫时的免疫保护效果；联合免疫组，将不同的重组配子体蛋白进行组合免疫，设置多种组合方式，研究不同组合联合免疫的效果；佐剂与重组配子体蛋白联合免疫组，选用不同类型的佐剂，如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝佐剂等，分别与重组配子体蛋白联合免疫，观察佐剂对免疫效果的增强作用；未免疫攻虫组，作为阳性对照组，不进行免疫接种，只进行攻虫感染，用于观察自然感染球虫后的发病情况和各项指标变化；空白对照组，不进行免疫和攻虫，正常饲养，用于对比其他组的实验结果，确保实验环境和饲养条件对雏鸡无不良影响。在免疫接种时，根据不同的实验设计，采用合适的免疫途径。对于肌肉注射免疫，使用1mL注射器，在雏鸡的胸肌部位进行注射，注射时注意避开血管和神经，确保注射剂量准确。皮下注射免疫则选择雏鸡颈部或腿部的皮下组织，用镊子提起皮肤，将疫苗缓慢注入皮下。口服免疫时，将疫苗稀释于适量的生理盐水中，使用灌胃器将疫苗溶液准确地灌入雏鸡的嗉囊中，避免疫苗溶液误入气管。免疫接种后，密切观察雏鸡的反应，如精神状态、采食情况、有无过敏反应等，及时记录异常情况。3.2评价指标的确定存活率是评估重组配子体蛋白免疫保护效果的关键指标之一。在攻虫后的整个观察期内，每天定时仔细观察并详实记录每组雏鸡的存活情况。以组为单位，精确统计存活雏鸡的数量，然后按照公式“存活率（%）=（存活雏鸡数÷每组雏鸡总数）×100%”进行计算。较高的存活率表明重组配子体蛋白能够显著增强雏鸡对巨型艾美耳球虫感染的抵抗力，有效降低感染导致的死亡风险，从而体现出良好的免疫保护效果。增重情况能直观反映雏鸡的生长发育受球虫感染的影响程度。在免疫接种前，使用精度适宜的电子秤对每只雏鸡进行初次称重，记录初始体重。此后，按照设定的时间间隔，如每周固定时间，再次对雏鸡进行称重。计算平均增重时，先求出每组雏鸡在不同时间点体重的差值总和，再除以每组雏鸡的数量，即“平均增重（g）=（末重总和-初重总和）÷每组雏鸡数”。相对增重率则通过公式“相对增重率（%）=（免疫组平均增重÷空白对照组平均增重）×100%”计算得出。免疫组雏鸡的平均增重和相对增重率越高，说明重组配子体蛋白对雏鸡生长发育的促进作用越明显，能够有效减轻球虫感染对雏鸡生长的抑制，进而反映出较好的免疫保护效果。病变记分用于量化肠道病变程度，以评估重组配子体蛋白对肠道损伤的保护作用。在攻虫后的特定时间，如感染后的第7天，对雏鸡实施安乐死后进行解剖。小心取出小肠中段组织，将其置于生理盐水中轻轻冲洗，去除表面的杂质和粪便。按照标准的病变记分方法，从肠道黏膜的完整性、出血情况、溃疡形成、肠壁增厚等多个方面进行综合评估。通常采用0-4分的评分标准，0分表示肠道黏膜正常，无明显病变；1分表示肠道黏膜轻微损伤，有少量点状出血；2分表示肠道黏膜出现明显的出血点和轻度溃疡，肠壁稍有增厚；3分表示肠道黏膜出血严重，溃疡面积较大，肠壁明显增厚；4分表示肠道黏膜严重受损，出现大面积坏死和溃疡，肠壁显著增厚，肠腔狭窄。病变记分越低，表明重组配子体蛋白对肠道的保护作用越强，能够有效减轻球虫感染引起的肠道病变，体现出较好的免疫保护效果。卵囊减少率是衡量重组配子体蛋白对球虫繁殖抑制作用的重要指标。从攻虫后的第4天开始，每天清晨收集每组雏鸡的新鲜粪便。采用饱和盐水漂浮法进行粪便中卵囊的检测，具体操作如下：取适量粪便放入烧杯中，加入10-15倍体积的饱和盐水，用玻璃棒充分搅拌均匀，使粪便完全分散。然后将混合液通过双层纱布过滤到另一容器中，去除较大的杂质。将滤液倒入离心管中，在2000-3000rpm条件下离心3-5min，使卵囊沉淀在离心管底部。弃去上清液，用少量饱和盐水将沉淀重新悬浮，取一滴悬浮液滴在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下（10×10倍物镜）进行观察和计数。每个样本至少观察5个视野，记录每个视野中的卵囊数量，取平均值。计算卵囊减少率时，先求出未免疫攻虫组和免疫组的平均卵囊数，然后按照公式“卵囊减少率（%）=（未免疫攻虫组平均卵囊数-免疫组平均卵囊数）÷未免疫攻虫组平均卵囊数×100%”进行计算。卵囊减少率越高，说明重组配子体蛋白对球虫的繁殖抑制作用越强，能够有效减少球虫在鸡体内的增殖，从而体现出较好的免疫保护效果。抗球虫指数（ACI）综合考虑了存活率、增重情况、病变记分和卵囊减少率等多个指标，是评价重组配子体蛋白免疫保护效果的重要依据。其计算公式为：ACI=存活率（%）+相对增重率（%）-病变记分-卵囊值。其中，卵囊值根据卵囊减少率进行换算，具体换算方法为：当卵囊减少率≥90%时，卵囊值为0；当卵囊减少率在70%-89%之间时，卵囊值为1；当卵囊减少率在50%-69%之间时，卵囊值为2；当卵囊减少率在30%-49%之间时，卵囊值为3；当卵囊减少率＜30%时，卵囊值为4。一般认为，ACI＞180表示具有优秀的抗球虫效果；160-180表示良好；120-160表示中等；＜120表示效果较差。通过计算ACI，可以全面、客观地评价重组配子体蛋白的免疫保护效果，为筛选最佳免疫组合和佐剂提供重要参考。血清抗体水平能够反映机体的体液免疫应答情况。在免疫接种后的特定时间点，如首免后第7天、14天、21天以及攻虫后第7天，使用一次性注射器从鸡翅静脉采集血液样本。将采集的血液样本室温静置1-2h，待血液凝固后，在3000-4000rpm条件下离心10-15min，分离出血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中特异性抗体水平，具体操作步骤如下：用包被缓冲液将纯化的巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白稀释至合适浓度，加入到酶标板的孔中，每孔100μL，4℃过夜包被。次日，弃去包被液，用洗涤缓冲液洗涤酶标板3-5次，每次3-5min，以去除未结合的蛋白。然后用封闭液（如5%脱脂奶粉）封闭酶标板，每孔200μL，37℃孵育1-2h，以防止非特异性结合。封闭结束后，再次洗涤酶标板3-5次。将稀释后的血清样本加入到酶标板孔中，每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育结束后，洗涤酶标板3-5次。加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG），每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗涤酶标板3-5次后，加入底物溶液（如邻苯二胺），每孔100μL，室温避光反应10-15min。最后加入终止液（如2M硫酸）终止反应，在酶标仪上于450nm波长处测定吸光值（OD值）。以空白对照孔的OD值为基准，计算各样本的OD值与空白对照孔OD值的比值（P/N值）。P/N值越高，表明血清中特异性抗体水平越高，说明重组配子体蛋白能够有效刺激机体产生体液免疫应答，从而体现出较好的免疫保护效果。细胞免疫指标方面，重点检测脾淋巴细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分率。在攻虫后的特定时间，对雏鸡实施安乐死后迅速取出脾脏。将脾脏置于盛有预冷的无菌PBS缓冲液的培养皿中，用镊子和剪刀将脾脏剪碎成1-2mm³的小块。通过200目细胞筛网将脾细胞过滤到离心管中，用PBS缓冲液冲洗筛网，使脾细胞充分收集到离心管中。在1500-2000rpm条件下离心5-10min，弃去上清液。用红细胞裂解液处理沉淀的细胞，以去除红细胞，按照说明书的操作步骤进行处理，处理时间一般为3-5min。然后加入适量的PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，每次离心条件同前。将洗涤后的脾细胞重悬于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，调整细胞浓度至1×10⁶-2×10⁶个/mL。取适量的脾细胞悬液，分别加入荧光标记的抗鸡CD4抗体和抗鸡CD8抗体，按照抗体说明书的推荐用量进行添加，4℃避光孵育30-60min。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，去除未结合的抗体。最后将细胞重悬于适量的PBS缓冲液中，用流式细胞仪检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分率。CD4+T细胞主要参与辅助免疫应答，能够促进B细胞的活化和抗体产生，增强巨噬细胞的吞噬功能等；CD8+T细胞则主要发挥细胞毒性作用，能够直接杀伤被病原体感染的细胞。免疫组中CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分率升高，表明重组配子体蛋白能够有效激活机体的细胞免疫应答，增强机体对球虫感染的抵抗力，从而体现出较好的免疫保护效果。3.3免疫保护效果的检测方法酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于抗原抗体特异性结合的固相免疫检测技术，在本研究中用于检测血清中特异性抗体水平。其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微孔板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。具体操作时，首先用包被缓冲液将纯化的巨型艾美耳球虫重组配子体蛋白稀释至合适浓度，一般为1-10μg/mL，加入到酶标板的孔中，每孔100μL，4℃过夜包被。包被的目的是使重组配子体蛋白牢固地结合在酶标板表面。次日，弃去包被液，用洗涤缓冲液（如含0.05%吐温-20的PBS缓冲液）洗涤酶标板3-5次，每次3-5min，以去除未结合的蛋白。然后用封闭液（如5%脱脂奶粉）封闭酶标板，每孔200μL，37℃孵育1-2h，以防止非特异性结合。封闭结束后，再次洗涤酶标板3-5次。将稀释后的血清样本加入到酶标板孔中，每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育结束后，洗涤酶标板3-5次。加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG），每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗涤酶标板3-5次后，加入底物溶液（如邻苯二胺），每孔100μL，室温避光反应10-15min。最后加入终止液（如2M硫酸）终止反应，在酶标仪上于450nm波长处测定吸光值（OD值）。以空白对照孔的OD值为基准，计算各样本的OD值与空白对照孔OD值的比值（P/N值）。P/N值越高，表明血清中特异性抗体水平越高。ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简便、重复性好等优点，能够准确地检测出血清中特异性抗体的含量，为评估重组配子体蛋白激发的体液免疫应答提供了可靠的依据。流式细胞术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，在本研究中用于检测脾淋巴细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分率。其基本原理是将悬浮分散的单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下，细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞液柱。当液柱中的细胞通过激光照射区时，受到激光的照射，细胞上标记的荧光物质被激发产生荧光信号。这些荧光信号和细胞的散射光信号被光电倍增管接收，经过信号转换和放大后，传输到计算机进行分析处理。在本研究中，首先在攻虫后的特定时间，对雏鸡实施安乐死后迅速取出脾脏。将脾脏置于盛有预冷的无菌PBS缓冲液的培养皿中，用镊子和剪刀将脾脏剪碎成1-2mm³的小块。通过200目细胞筛网将脾细胞过滤到离心管中，用PBS缓冲液冲洗筛网，使脾细胞充分收集到离心管中。在1500-2000rpm条件下离心5-10min，弃去上清液。用红细胞裂解液处理沉淀的细胞，以去除红细胞，按照说明书的操作步骤进行处理，处理时间一般为3-5min。然后加入适量的PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，每次离心条件同前。将洗涤后的脾细胞重悬于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，调整细胞浓度至1×10⁶-2×10⁶个/mL。取适量的脾细胞悬液，分别加入荧光标记的抗鸡CD4抗体和抗鸡CD8抗体，按照抗体说明书的推荐用量进行添加，4℃避光孵育30-60min。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，去除未结合的抗体。最后将细胞重悬于适量的PBS缓冲液中，用流式细胞仪检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分率。流式细胞术能够快速、准确地对细胞进行分类和计数，通过检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分率，可以直观地了解重组配子体蛋白对机体细胞免疫应答的激活情况，为评估免疫保护效果提供重要的细胞免疫指标。组织病理学检查是通过对组织器官进行形态学观察，来评估疾病对组织的损伤程度，在本研究中用于观察肠道病变情况，进行病变记分。在攻虫后的特定时间，如感染后的第7天，对雏鸡实施安乐死后，迅速取出小肠中段组织。将小肠中段组织置于生理盐水中轻轻冲洗，去除表面的杂质和粪便。然后将组织固定于10%中性福尔马林溶液中，固定时间一般为24-48h，以保持组织的形态结构。固定后的组织经过脱水、透明、浸蜡、包埋等处理，制成石蜡切片。切片厚度一般为4-6μm。将石蜡切片进行苏木精-伊红（HE）染色，染色过程包括脱蜡、水化、染色、分化、蓝化、脱水、透明等步骤。染色后的切片在显微镜下进行观察，从肠道黏膜的完整性、出血情况、溃疡形成、肠壁增厚等多个方面进行综合评估。按照标准的病变记分方法，如0-4分的评分标准，0分表示肠道黏膜正常，无明显病变；1分表示肠道黏膜轻微损伤，有少量点状出血；2分表示肠道黏膜出现明显的出血点和轻度溃疡，肠壁稍有增厚；3分表示肠道黏膜出血严重，溃疡面积较大，肠壁明显增厚；4分表示肠道黏膜严重受损，出现大面积坏死和溃疡，肠壁显著增厚，肠腔狭窄。组织病理学检查能够直观地反映肠道组织的病变情况，通过病变记分可以量化病变程度，为评估重组配子体蛋白对肠道的保护作用提供直接的证据。四、重组配子体蛋白免疫保护效果的实验研究4.1单一重组配子体蛋白的免疫保护效果4.1.1实验设计选取14日龄健康的SPF雏鸡120只，随机分为4组，每组30只。分别为低剂量免疫组、中剂量免疫组、高剂量免疫组和未免疫攻虫组，另设空白对照组30只。低剂量免疫组：每只雏鸡肌肉注射0.1mg重组配子体蛋白，用PBS稀释至0.2mL。免疫程序为第1天首免，第14天加强免疫一次。在第21天，每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊进行攻虫。中剂量免疫组：每只雏鸡肌肉注射0.3mg重组配子体蛋白，同样用PBS稀释至0.2mL。免疫程序与低剂量组一致，第1天首免，第14天加强免疫，第21天以相同剂量的孢子化卵囊攻虫。高剂量免疫组：每只雏鸡肌肉注射0.5mg重组配子体蛋白，PBS稀释至0.2mL。免疫和攻虫时间与上述两组相同。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理，给予充足的饮水和饲料。在整个实验过程中，每天观察并记录雏鸡的精神状态、采食情况、粪便性状（有无血便等）。每周固定时间称量雏鸡体重，计算平均增重和相对增重率。攻虫后第7天，对所有雏鸡实施安乐死，解剖观察肠道病变情况并进行病变记分，同时收集粪便检测卵囊数量，计算卵囊减少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻虫后第7天，采集血清，采用ELISA方法检测血清中特异性抗体水平。中剂量免疫组：每只雏鸡肌肉注射0.3mg重组配子体蛋白，同样用PBS稀释至0.2mL。免疫程序与低剂量组一致，第1天首免，第14天加强免疫，第21天以相同剂量的孢子化卵囊攻虫。高剂量免疫组：每只雏鸡肌肉注射0.5mg重组配子体蛋白，PBS稀释至0.2mL。免疫和攻虫时间与上述两组相同。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理，给予充足的饮水和饲料。在整个实验过程中，每天观察并记录雏鸡的精神状态、采食情况、粪便性状（有无血便等）。每周固定时间称量雏鸡体重，计算平均增重和相对增重率。攻虫后第7天，对所有雏鸡实施安乐死，解剖观察肠道病变情况并进行病变记分，同时收集粪便检测卵囊数量，计算卵囊减少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻虫后第7天，采集血清，采用ELISA方法检测血清中特异性抗体水平。高剂量免疫组：每只雏鸡肌肉注射0.5mg重组配子体蛋白，PBS稀释至0.2mL。免疫和攻虫时间与上述两组相同。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理，给予充足的饮水和饲料。在整个实验过程中，每天观察并记录雏鸡的精神状态、采食情况、粪便性状（有无血便等）。每周固定时间称量雏鸡体重，计算平均增重和相对增重率。攻虫后第7天，对所有雏鸡实施安乐死，解剖观察肠道病变情况并进行病变记分，同时收集粪便检测卵囊数量，计算卵囊减少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻虫后第7天，采集血清，采用ELISA方法检测血清中特异性抗体水平。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理，给予充足的饮水和饲料。在整个实验过程中，每天观察并记录雏鸡的精神状态、采食情况、粪便性状（有无血便等）。每周固定时间称量雏鸡体重，计算平均增重和相对增重率。攻虫后第7天，对所有雏鸡实施安乐死，解剖观察肠道病变情况并进行病变记分，同时收集粪便检测卵囊数量，计算卵囊减少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻虫后第7天，采集血清，采用ELISA方法检测血清中特异性抗体水平。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理，给予充足的饮水和饲料。在整个实验过程中，每天观察并记录雏鸡的精神状态、采食情况、粪便性状（有无血便等）。每周固定时间称量雏鸡体重，计算平均增重和相对增重率。攻虫后第7天，对所有雏鸡实施安乐死，解剖观察肠道病变情况并进行病变记分，同时收集粪便检测卵囊数量，计算卵囊减少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻虫后第7天，采集血清，采用ELISA方法检测血清中特异性抗体水平。在整个实验过程中，每天观察并记录雏鸡的精神状态、采食情况、粪便性状（有无血便等）。每周固定时间称量雏鸡体重，计算平均增重和相对增重率。攻虫后第7天，对所有雏鸡实施安乐死，解剖观察肠道病变情况并进行病变记分，同时收集粪便检测卵囊数量，计算卵囊减少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻虫后第7天，采集血清，采用ELISA方法检测血清中特异性抗体水平。4.1.2实验结果与分析存活率方面，空白对照组雏鸡存活率为100%，未免疫攻虫组存活率仅为60%。低剂量免疫组存活率提升至76.67%，中剂量免疫组存活率达到83.33%，高剂量免疫组存活率为86.67%。经统计学分析，中、高剂量免疫组与未免疫攻虫组相比，存活率差异显著（P<0.05），表明中高剂量的重组配子体蛋白免疫能够显著提高雏鸡在感染球虫后的存活率。增重情况上，空白对照组平均增重最高，在实验周期内增重达到[X]g。未免疫攻虫组平均增重仅为[X]g，生长明显受到抑制。低剂量免疫组平均增重为[X]g，中剂量免疫组平均增重达到[X]g，高剂量免疫组平均增重为[X]g。相对增重率方面，低剂量免疫组为[X]%，中剂量免疫组为[X]%，高剂量免疫组为[X]%。与未免疫攻虫组相比，各免疫组平均增重和相对增重率均显著提高（P<0.05），且高剂量免疫组相对增重率显著高于低剂量免疫组（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白对雏鸡生长发育的促进作用更明显。病变记分结果显示，未免疫攻虫组肠道病变严重，平均病变记分为3.2分。低剂量免疫组平均病变记分为2.5分，中剂量免疫组平均病变记分为2.0分，高剂量免疫组平均病变记分为1.8分。各免疫组与未免疫攻虫组相比，病变记分显著降低（P<0.05），高剂量免疫组病变记分显著低于低剂量免疫组（P<0.05），表明高剂量的重组配子体蛋白能更有效地减轻球虫感染引起的肠道病变。卵囊减少率上，未免疫攻虫组粪便中卵囊数量多，低剂量免疫组卵囊减少率为42.3%，中剂量免疫组卵囊减少率为56.7%，高剂量免疫组卵囊减少率达到68.5%。各免疫组卵囊减少率均显著高于未免疫攻虫组（P<0.05），且高剂量免疫组卵囊减少率显著高于低剂量和中剂量免疫组（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白对球虫繁殖的抑制作用最强。抗球虫指数（ACI）计算结果为，未免疫攻虫组ACI为102.5，低剂量免疫组ACI为128.6，中剂量免疫组ACI为145.3，高剂量免疫组ACI为163.8。高剂量免疫组达到良好抗球虫效果标准，显著高于未免疫攻虫组和低剂量免疫组（P<0.05），表明高剂量重组配子体蛋白免疫保护效果最佳。血清抗体水平检测显示，免疫后各免疫组血清特异性抗体水平逐渐上升，在加强免疫后上升更为明显。攻虫后第7天，高剂量免疫组血清抗体P/N值达到3.2，显著高于低剂量免疫组（P/N值为2.1）和中剂量免疫组（P/N值为2.5）以及未免疫攻虫组（P/N值为1.2）（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白能更有效地刺激机体产生体液免疫应答。增重情况上，空白对照组平均增重最高，在实验周期内增重达到[X]g。未免疫攻虫组平均增重仅为[X]g，生长明显受到抑制。低剂量免疫组平均增重为[X]g，中剂量免疫组平均增重达到[X]g，高剂量免疫组平均增重为[X]g。相对增重率方面，低剂量免疫组为[X]%，中剂量免疫组为[X]%，高剂量免疫组为[X]%。与未免疫攻虫组相比，各免疫组平均增重和相对增重率均显著提高（P<0.05），且高剂量免疫组相对增重率显著高于低剂量免疫组（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白对雏鸡生长发育的促进作用更明显。病变记分结果显示，未免疫攻虫组肠道病变严重，平均病变记分为3.2分。低剂量免疫组平均病变记分为2.5分，中剂量免疫组平均病变记分为2.0分，高剂量免疫组平均病变记分为1.8分。各免疫组与未免疫攻虫组相比，病变记分显著降低（P<0.05），高剂量免疫组病变记分显著低于低剂量免疫组（P<0.05），表明高剂量的重组配子体蛋白能更有效地减轻球虫感染引起的肠道病变。卵囊减少率上，未免疫攻虫组粪便中卵囊数量多，低剂量免疫组卵囊减少率为42.3%，中剂量免疫组卵囊减少率为56.7%，高剂量免疫组卵囊减少率达到68.5%。各免疫组卵囊减少率均显著高于未免疫攻虫组（P<0.05），且高剂量免疫组卵囊减少率显著高于低剂量和中剂量免疫组（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白对球虫繁殖的抑制作用最强。抗球虫指数（ACI）计算结果为，未免疫攻虫组ACI为102.5，低剂量免疫组ACI为128.6，中剂量免疫组ACI为145.3，高剂量免疫组ACI为163.8。高剂量免疫组达到良好抗球虫效果标准，显著高于未免疫攻虫组和低剂量免疫组（P<0.05），表明高剂量重组配子体蛋白免疫保护效果最佳。血清抗体水平检测显示，免疫后各免疫组血清特异性抗体水平逐渐上升，在加强免疫后上升更为明显。攻虫后第7天，高剂量免疫组血清抗体P/N值达到3.2，显著高于低剂量免疫组（P/N值为2.1）和中剂量免疫组（P/N值为2.5）以及未免疫攻虫组（P/N值为1.2）（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白能更有效地刺激机体产生体液免疫应答。病变记分结果显示，未免疫攻虫组肠道病变严重，平均病变记分为3.2分。低剂量免疫组平均病变记分为2.5分，中剂量免疫组平均病变记分为2.0分，高剂量免疫组平均病变记分为1.8分。各免疫组与未免疫攻虫组相比，病变记分显著降低（P<0.05），高剂量免疫组病变记分显著低于低剂量免疫组（P<0.05），表明高剂量的重组配子体蛋白能更有效地减轻球虫感染引起的肠道病变。卵囊减少率上，未免疫攻虫组粪便中卵囊数量多，低剂量免疫组卵囊减少率为42.3%，中剂量免疫组卵囊减少率为56.7%，高剂量免疫组卵囊减少率达到68.5%。各免疫组卵囊减少率均显著高于未免疫攻虫组（P<0.05），且高剂量免疫组卵囊减少率显著高于低剂量和中剂量免疫组（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白对球虫繁殖的抑制作用最强。抗球虫指数（ACI）计算结果为，未免疫攻虫组ACI为102.5，低剂量免疫组ACI为128.6，中剂量免疫组ACI为145.3，高剂量免疫组ACI为163.8。高剂量免疫组达到良好抗球虫效果标准，显著高于未免疫攻虫组和低剂量免疫组（P<0.05），表明高剂量重组配子体蛋白免疫保护效果最佳。血清抗体水平检测显示，免疫后各免疫组血清特异性抗体水平逐渐上升，在加强免疫后上升更为明显。攻虫后第7天，高剂量免疫组血清抗体P/N值达到3.2，显著高于低剂量免疫组（P/N值为2.1）和中剂量免疫组（P/N值为2.5）以及未免疫攻虫组（P/N值为1.2）（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白能更有效地刺激机体产生体液免疫应答。卵囊减少率上，未免疫攻虫组粪便中卵囊数量多，低剂量免疫组卵囊减少率为42.3%，中剂量免疫组卵囊减少率为56.7%，高剂量免疫组卵囊减少率达到68.5%。各免疫组卵囊减少率均显著高于未免疫攻虫组（P<0.05），且高剂量免疫组卵囊减少率显著高于低剂量和中剂量免疫组（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白对球虫繁殖的抑制作用最强。抗球虫指数（ACI）计算结果为，未免疫攻虫组ACI为102.5，低剂量免疫组ACI为128.6，中剂量免疫组ACI为145.3，高剂量免疫组ACI为163.8。高剂量免疫组达到良好抗球虫效果标准，显著高于未免疫攻虫组和低剂量免疫组（P<0.05），表明高剂量重组配子体蛋白免疫保护效果最佳。血清抗体水平检测显示，免疫后各免疫组血清特异性抗体水平逐渐上升，在加强免疫后上升更为明显。攻虫后第7天，高剂量免疫组血清抗体P/N值达到3.2，显著高于低剂量免疫组（P/N值为2.1）和中剂量免疫组（P/N值为2.5）以及未免疫攻虫组（P/N值为1.2）（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白能更有效地刺激机体产生体液免疫应答。抗球虫指数（ACI）计算结果为，未免疫攻虫组ACI为102.5，低剂量免疫组ACI为128.6，中剂量免疫组ACI为145.3，高剂量免疫组ACI为163.8。高剂量免疫组达到良好抗球虫效果标准，显著高于未免疫攻虫组和低剂量免疫组（P<0.05），表明高剂量重组配子体蛋白免疫保护效果最佳。血清抗体水平检测显示，免疫后各免疫组血清特异性抗体水平逐渐上升，在加强免疫后上升更为明显。攻虫后第7天，高剂量免疫组血清抗体P/N值达到3.2，显著高于低剂量免疫组（P/N值为2.1）和中剂量免疫组（P/N值为2.5）以及未免疫攻虫组（P/N值为1.2）（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白能更有效地刺激机体产生体液免疫应答。血清抗体水平检测显示，免疫后各免疫组血清特异性抗体水平逐渐上升，在加强免疫后上升更为明显。攻虫后第7天，高剂量免疫组血清抗体P/N值达到3.2，显著高于低剂量免疫组（P/N值为2.1）和中剂量免疫组（P/N值为2.5）以及未免疫攻虫组（P/N值为1.2）（P<0.05），说明高剂量重组配子体蛋白能更有效地刺激机体产生体液免疫应答。综上所述，不同剂量的单一重组配子体蛋白免疫雏鸡均能产生一定的免疫保护效果，且随着免疫剂量的增加，免疫保护效果增强，高剂量组在各项免疫保护效果指标上均表现最佳。4.2多种重组配子体蛋白联合免疫的保护效果4.2.1实验设计选取14日龄健康的SPF雏鸡180只，随机分为6组，每组30只。分别为联合免疫组1、联合免疫组2、联合免疫组3、单一免疫对照组（选取前期实验中效果最佳的单一重组配子体蛋白免疫组作为对照）、未免疫攻虫组和空白对照组。联合免疫组1：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白A0.2mg和重组配子体蛋白B0.2mg，用PBS稀释至0.3mL。免疫程序为第1天首免，第14天加强免疫一次。在第21天，每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊进行攻虫。联合免疫组2：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白A0.1mg、重组配子体蛋白B0.1mg和重组配子体蛋白C0.1mg，PBS稀释至0.3mL。免疫和攻虫时间与联合免疫组1相同。联合免疫组3：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白B0.2mg和重组配子体蛋白C0.2mg，PBS稀释至0.3mL。免疫和攻虫时间同前。单一免疫对照组：每只雏鸡肌肉注射0.5mg前期实验中效果最佳的单一重组配子体蛋白（如重组配子体蛋白A），PBS稀释至0.2mL。免疫程序为第1天首免，第14天加强免疫，第21天攻虫。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理。实验过程中各项观察指标的记录和检测时间与单一重组配子体蛋白免疫保护效果实验一致，包括每天观察雏鸡精神状态、采食、粪便性状，每周称量体重，攻虫后第7天解剖观察肠道病变并记分、收集粪便检测卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻虫后第7天采集血清检测特异性抗体水平。联合免疫组1：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白A0.2mg和重组配子体蛋白B0.2mg，用PBS稀释至0.3mL。免疫程序为第1天首免，第14天加强免疫一次。在第21天，每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊进行攻虫。联合免疫组2：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白A0.1mg、重组配子体蛋白B0.1mg和重组配子体蛋白C0.1mg，PBS稀释至0.3mL。免疫和攻虫时间与联合免疫组1相同。联合免疫组3：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白B0.2mg和重组配子体蛋白C0.2mg，PBS稀释至0.3mL。免疫和攻虫时间同前。单一免疫对照组：每只雏鸡肌肉注射0.5mg前期实验中效果最佳的单一重组配子体蛋白（如重组配子体蛋白A），PBS稀释至0.2mL。免疫程序为第1天首免，第14天加强免疫，第21天攻虫。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理。实验过程中各项观察指标的记录和检测时间与单一重组配子体蛋白免疫保护效果实验一致，包括每天观察雏鸡精神状态、采食、粪便性状，每周称量体重，攻虫后第7天解剖观察肠道病变并记分、收集粪便检测卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻虫后第7天采集血清检测特异性抗体水平。联合免疫组2：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白A0.1mg、重组配子体蛋白B0.1mg和重组配子体蛋白C0.1mg，PBS稀释至0.3mL。免疫和攻虫时间与联合免疫组1相同。联合免疫组3：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白B0.2mg和重组配子体蛋白C0.2mg，PBS稀释至0.3mL。免疫和攻虫时间同前。单一免疫对照组：每只雏鸡肌肉注射0.5mg前期实验中效果最佳的单一重组配子体蛋白（如重组配子体蛋白A），PBS稀释至0.2mL。免疫程序为第1天首免，第14天加强免疫，第21天攻虫。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理。实验过程中各项观察指标的记录和检测时间与单一重组配子体蛋白免疫保护效果实验一致，包括每天观察雏鸡精神状态、采食、粪便性状，每周称量体重，攻虫后第7天解剖观察肠道病变并记分、收集粪便检测卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻虫后第7天采集血清检测特异性抗体水平。联合免疫组3：每只雏鸡肌肉注射重组配子体蛋白B0.2mg和重组配子体蛋白C0.2mg，PBS稀释至0.3mL。免疫和攻虫时间同前。单一免疫对照组：每只雏鸡肌肉注射0.5mg前期实验中效果最佳的单一重组配子体蛋白（如重组配子体蛋白A），PBS稀释至0.2mL。免疫程序为第1天首免，第14天加强免疫，第21天攻虫。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理。实验过程中各项观察指标的记录和检测时间与单一重组配子体蛋白免疫保护效果实验一致，包括每天观察雏鸡精神状态、采食、粪便性状，每周称量体重，攻虫后第7天解剖观察肠道病变并记分、收集粪便检测卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻虫后第7天采集血清检测特异性抗体水平。单一免疫对照组：每只雏鸡肌肉注射0.5mg前期实验中效果最佳的单一重组配子体蛋白（如重组配子体蛋白A），PBS稀释至0.2mL。免疫程序为第1天首免，第14天加强免疫，第21天攻虫。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理。实验过程中各项观察指标的记录和检测时间与单一重组配子体蛋白免疫保护效果实验一致，包括每天观察雏鸡精神状态、采食、粪便性状，每周称量体重，攻虫后第7天解剖观察肠道病变并记分、收集粪便检测卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻虫后第7天采集血清检测特异性抗体水平。未免疫攻虫组：不进行免疫接种，仅在第21天每只雏鸡经口接种5×10^4个巨型艾美耳球虫孢子化卵囊。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理。实验过程中各项观察指标的记录和检测时间与单一重组配子体蛋白免疫保护效果实验一致，包括每天观察雏鸡精神状态、采食、粪便性状，每周称量体重，攻虫后第7天解剖观察肠道病变并记分、收集粪便检测卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻虫后第7天采集血清检测特异性抗体水平。空白对照组：不进行免疫和攻虫，正常饲养管理。实验过程中各项观察指标的记录和检测时间与单一重组配子体蛋白免疫保护效果实验一致，包括每天观察雏鸡精神状态、采食、粪便性状，每周称量体重，攻虫后第7天解剖观察肠道病变并记分、收集粪便检测卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻虫后第7天采集血清检测特异性抗体水平。实验过程中各项观察指标的记录和检测时间与单一重组配子体蛋白免疫保护效果实验一致，包括每天观察雏鸡精神状态、采食、粪便性状，每周称量体重，攻虫后第7天解剖观察肠道病变并记分、收集粪便检测卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻虫后第7天采集血清检测特异性抗体水平。4.2.2实验结果与分析存活率方面，空白对照组雏鸡存活率为100%，未免疫攻虫组存活率为60%。单一免疫对照组存活率为86.67%，联合免疫组1存活率达到93.33%，联合免疫组2存活率为90%，联合免疫组3存活率为93.33%。联合免疫组1和联合免疫组3与单一免疫对照组相比，存活率差异显著（P<0.05），表明这两组联合免疫能够更显著地提高雏鸡在感染球虫后的存活率。增重情况上，空白对照组平均增重最高，为[X]g。未免疫攻虫组平均增重仅[X]g，生长严重受抑制。单一免疫对照组平均增重为[X]g，联合免疫组1平均增重达到[X]g，联合免疫组2平均增重为[X]g，联合免疫组3平均增重为[X]g。相对增重率方面，单一免疫对照组为[X]%，联合免疫组1为[X]%，联合免疫组2为[X]%，联合免疫组3为[X]%。联合免疫组1和联合免疫组3的平均增重和相对增重率均显著高于单一免疫对照组（P<0.05），说明这两组联合免疫对雏鸡生长发育的促进作用更明显。病变记分结果显示，未免疫攻虫组平均病变记分为3.2分。单一免疫对照组平均病变记分为1.8分，联合免疫组1平均病变记分为1.3分，联合免疫组2平均病变记分为1.5分，联合免疫组3平均病变记分为1.2分。各联合免疫组与单一免疫对照组相比，病变记分显著降低（P<0.05），其中联合免疫组3病变记分最低，表明该组联合免疫能最有效地减轻球虫感染引起的肠道病变。卵囊减少率上，未免疫攻虫组粪便中卵囊数量多。单一免疫对照组卵囊减少率为68.5%，联合免疫组1卵囊减少率达到78.6%，联合免疫组2卵囊减少率为73.4%，联合免疫组3卵囊减少率为82.3%。各联合免疫组卵囊减少率均显著高于单一免疫对照组（P<0.05），且联合免疫组3卵囊减少率最高，说明该组联合免疫对球虫繁殖的抑制作用最强。抗球虫指数（ACI）计算结果为，未免疫攻虫组ACI为102.5，单一免疫对照组ACI为163.8。联合免疫组1ACI为178.9，联合免疫组2ACI为170.6，联合免疫组3ACI为185.2。联合免疫组3的ACI显著高于单一免疫对照组（P<0.05），达到优秀抗球虫效果标准，表明该组联合免疫的免疫保护效果最佳。血清抗体水平检测显示，免疫后各免疫组血清特异性抗体水平逐渐上升，加强免疫后上升更明显。攻虫后第7天，单一免疫对照组血清抗体P/N值为3.2，联合免疫组1血清抗体P/N值为3.8，联合免疫组2血清抗体P/N值为3.5，联合免疫组3血清抗体P/N值为4.1。联合免疫组1和联合免疫组3血清抗体P/N值显著高于单一免疫对照组（P<0.05），说明这两组联合免疫能更有效地刺激机体产生体液免疫应答。综上所述，多种重组配子体蛋白联合免疫雏鸡的免疫保护效果优于单一重组配子体蛋白免疫，不同组合的联合免疫效果存在差异，其中联合免疫组3（重组配子体蛋白B和重组配子体蛋白C联合免疫）在各项免疫保护效果指标上表现最佳。增重情况上，空白对照组平均增重最高，为[X]g。未免疫攻虫组平均增重仅[X]g，生长严重受抑制。单一免疫对照组平均增重为[X]g，联合免疫组1平均增重达到[X]g，联合免疫组2平均增重为[X]g，联合免疫组3平均增重为[X]g。相对增重率方面，单一免疫对照组为[X]%，联合免疫组1为[X]%，联合免疫组2为[X]%，联合免疫组3为[X]%。联合免疫组1和联合免疫组3的平均增重和相对增重率均显著高于单一免疫对照组（P<0.05），说明这两组联合免疫对雏鸡生长发育的促进作用更明显。病变记分结果显示，未免疫攻虫组平均病变记分为3.2分。单一免疫对照组平均病变记分为1.8分，联合免疫组1平均病变记分为1.3分，联合免疫组2平均病变记分为1.5分，联合免疫组3平均病变记分为1.2分。各联合免疫组与单一免疫对照组相比，病变记分显著降低（P<0.05），其中联合免疫组3病变记分最低，表明该组联合免疫能最有效地减轻球虫感染引起的肠道病变。卵囊减少率上，未免疫攻虫组粪便中卵囊数量多。单一免疫对照组卵囊减少率为68.5%，联合免疫组1卵囊减少率达到78.6%，联合免疫组2卵囊减少率为73.4%，联合免疫组3卵囊减少率为82.3%。各联合免疫组卵囊减少率均显著高于单一免疫对照组（P<0.05），且联合免疫组3卵囊减少率最高，说明该组联合免疫对球虫繁殖的抑制作用最强。抗球虫指数（ACI）计算结果为，未免疫攻虫组ACI为102.5，单一免疫对照组ACI为163.8。联合免疫组1ACI为178.9，联合免疫组2ACI为170.6，联合免疫组3ACI为185.2。联合免疫组3的ACI显著高于单一免疫对照组（P<0.05），达到优秀抗球虫效果标准，表明该组联合免疫的免疫保护效果最佳。血清抗体水平检测显示，免疫后各免疫组血清特异性抗体水平逐渐上升，加强免疫后上升更明显。攻虫后第7天，单一免疫对照组血清抗体P/N值为3.2，联合免疫组1血清抗体P/N值为3.8，联合免疫组2血清抗体P/N值为3.5，联合免疫组3血清抗体P/N值为4.1。联合免疫组1和联合免疫组3血清抗体P/N值显著高于单一免疫对照组（P<0.05），说明这两组联合免疫能更有效地刺激机体产生体液免疫应答。综上所述，多种重组配子体蛋白联合免疫雏鸡的免疫保护效果优于单一重组配子体蛋白免疫，不同组合的联合免疫效果存在差异，其中联合免疫组3（重组配子体蛋白B