常春藤皂甙元抗肝癌作用及机制研究：从细胞实验到生物信息学分析

常春藤皂甙元抗肝癌作用及机制研究：从细胞实验到生物信息学分析一、引言1.1研究背景肝癌，作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病之一，其发病率和死亡率一直居高不下。在所有恶性肿瘤中，肝癌的发病率仅次于肺癌，位列第二。尤其在发展中国家，肝癌的发病形势更为严峻，亚洲国家的发病率显著高于美国和西欧国家。我国作为肝癌高发国家，发病率已超过25/10万，部分高发地区的标准化发病率更是高达49.17/10万人口。每年，我国新增肝癌患者近30余万，占全球新增病例的一半；同时，约30万人因肝癌离世，患者5年生存率仅为2.7%。肝癌起病隐匿，早期症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，病情发展迅速，生存期短，后期生存质量极差。目前，肝癌的治疗手段主要包括手术治疗、放射疗法、化学疗法以及靶向治疗等。早期肝癌以手术切除为主，辅以放化疗，然而手术切除存在一定局限性，如患者的身体状况、肿瘤的位置和大小等因素都会影响手术的可行性和效果。中晚期肝癌及转移性肝癌则以放化疗和靶向治疗为主，但这些治疗方法往往伴随着严重的毒副作用，如化疗药物在杀死癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损伤，导致患者出现恶心、呕吐、脱发、免疫力下降等不良反应；放疗可能会引起局部组织的放射性损伤；靶向治疗虽然特异性较强，但部分患者会出现耐药现象，且药物价格昂贵，给患者和家庭带来沉重的经济负担。因此，开发新型、高效、低毒的抗肝癌药物具有迫切的临床需求和重要的现实意义。在寻找新型抗肝癌药物的研究中，天然产物因其丰富的生物活性和相对较低的毒副作用，成为了研究的热点领域。天然产物来源广泛，包括植物、动物、微生物等，蕴含着种类繁多的化学成分，如生物碱、黄酮类、萜类、皂苷类等，这些成分具有多种生物活性，在抗癌研究中展现出巨大的潜力。例如，紫杉醇是从红豆杉属植物中提取的一种二萜类化合物，它通过促进微管蛋白聚合，抑制微管解聚，从而阻碍癌细胞的有丝分裂，达到抗癌的目的，目前已广泛应用于临床多种癌症的治疗；喜树碱是从喜树中分离得到的一种生物碱，它能够抑制拓扑异构酶I的活性，干扰DNA的复制和转录，进而发挥抗癌作用。这些成功的案例充分证明了天然产物在抗癌药物研发中的重要地位。常春藤皂苷元（Hederagenin,HD）作为一种天然的五环三萜类化合物，主要来源于五加科常春藤属植物中华常春藤等。近年来的研究发现，常春藤皂苷元具有多种生物活性，如抗炎、抗菌、抗病毒、抗糖尿病以及抗肿瘤等。在抗肿瘤研究方面，已有研究表明常春藤皂苷元对多种肿瘤细胞具有抑制作用，包括乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞等，但其抗肝癌的作用及机制尚未完全明确。本研究旨在深入探讨常春藤皂苷元抗肝癌的作用及机制，为肝癌的治疗提供新的药物靶点和理论依据。1.2常春藤皂甙元概述常春藤皂苷元（Hederagenin，HD），又称常春(藤苷)配基，是一种五环三萜类化合物，其化学名称为(3β,4α)-3,23-二羟基齐墩果-12-烯-28-酸，分子式为C₃₀H₄₈O₄，分子量为472.71，CAS登录号为465-99-6。常春藤皂苷元外观呈白色结晶粉末状，熔点在331-333℃，具有吸湿性，味道较苦，且具有刺激黏膜的作用。其可溶于水，在热水、热甲醇及热乙醇中易溶，但不溶于乙醚等极性小的有机溶剂。从分子结构上看，常春藤皂苷元具有独特的五环三萜骨架结构，这种结构赋予了其多种生物活性。其结构中的羟基、烯键等官能团，使其能够与生物体内的多种靶点相互作用，从而发挥生物学效应。常春藤皂苷元主要来源于五加科常春藤属植物中华常春藤（HederanepalensisK.Kochvar.sinensis(Tobl.)Rehd.），在常春藤的全株中均有分布。除中华常春藤外，在一些其他植物中也能提取得到常春藤皂苷元，如黄褐毛忍冬（Lonicerafulvotomentosa）。常春藤皂苷元的提取方法主要有溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等。溶剂提取法是利用常春藤皂苷元在不同溶剂中的溶解度差异，选择合适的溶剂进行提取；超声辅助提取法和微波辅助提取法则是借助超声波和微波的作用，提高提取效率，缩短提取时间。近年来，常春藤皂苷元在医药领域的研究备受关注，除了在抗肿瘤方面的研究外，在其他疾病的研究中也取得了一定成果。在抗炎研究中，有研究表明常春藤皂苷元能够抑制炎症因子的释放，减轻炎症反应。在一项对脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型的研究中，常春藤皂苷元能够显著降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的表达水平，从而发挥抗炎作用。在抗糖尿病研究中，常春藤皂苷元表现出一定的降血糖活性。其可以通过调节胰岛素信号通路，提高胰岛素敏感性，从而降低血糖水平。此外，常春藤皂苷元还具有抗动脉硬化、抗菌、抗病毒等多种生物活性，在心血管疾病、感染性疾病等方面展现出潜在的应用价值。这些研究为常春藤皂苷元的进一步开发和利用提供了理论基础，也提示其在多领域的药用价值和研究潜力。1.3研究目的与意义本研究旨在深入探究常春藤皂苷元抗肝癌的作用及潜在机制，为肝癌的治疗提供新的药物靶点和理论依据。具体而言，本研究将通过体内和体外实验，明确常春藤皂苷元对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，并进一步探讨其作用机制，包括对相关信号通路和基因表达的调控作用。肝癌作为一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居高不下，给患者和社会带来了沉重的负担。目前，肝癌的治疗手段虽然多样，但仍存在诸多局限性，如手术切除的局限性、放化疗的毒副作用以及靶向治疗的耐药性等。因此，寻找新型、高效、低毒的抗肝癌药物具有迫切的临床需求。常春藤皂苷元作为一种天然的五环三萜类化合物，具有多种生物活性，在抗肿瘤研究中展现出一定的潜力。然而，其抗肝癌的作用及机制尚未完全明确。深入研究常春藤皂苷元抗肝癌的作用及机制，不仅有助于揭示其抗肿瘤的分子机制，为肝癌的治疗提供新的理论依据，还可能为开发新型抗肝癌药物提供先导化合物。本研究的结果将为肝癌的治疗提供新的思路和方法，具有重要的理论意义和临床应用价值。通过明确常春藤皂苷元的抗肝癌作用及机制，有望为肝癌患者提供更加有效的治疗手段，提高患者的生存率和生活质量。此外，本研究也将丰富天然产物抗肿瘤的研究内容，为其他天然产物的开发和利用提供参考。二、常春藤皂甙元抗肝癌的体外实验研究2.1实验材料与方法2.1.1实验材料细胞株：人肝癌HepG2细胞株，购自中国医学科学院肿瘤研究所细胞库，该细胞株具有典型的肝癌细胞特征，广泛应用于肝癌相关研究。药品：常春藤皂苷元（Hederagenin，HD），批号465-99-6，质量分数为99%，购自成都瑞芬思生物技术有限公司，其化学结构明确，纯度高，为后续实验提供了可靠的物质基础。试剂：DMEM培养基（批号2203194）购自美国Gibco公司，该培养基富含多种营养成分，能够满足HepG2细胞生长的需求；胰蛋白酶（批号C0201-100mL）、Western及IP细胞裂解液（批号P0013）和RIPA强裂解液（批号P0013B）购自上海碧云天生物技术有限公司，用于细胞的消化和蛋白提取；胎牛血清（批号20120703）购自浙江天杭生物科技股份有限公司，为细胞生长提供必要的营养和生长因子；PVDF膜（批号46273700）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，用于蛋白免疫印迹实验中的蛋白转移；BCA试剂盒（批号MA0082-2-Aug-20G）、ECL发光液（批号MA0186-Apr-29G）、MTT细胞增殖及细胞毒性试剂盒（批号MB4698-1）购自大连美仑生物技术有限公司，分别用于蛋白浓度测定、蛋白条带显影和细胞增殖检测；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗体（批号WL02841）、细胞分裂周期蛋白25A（celldivisioncycle25A，CDC25A）抗体（批号WL04650）、CDC25B抗体（批号WL02958）、雌激素受体1（estrogenreceptor1，ESR1）抗体（批号WL00940）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxidesynthase2，PTGS2）抗体（批号WL01750）、雄性激素受体（androgenreceptor，AR）抗体（批号WL00223）购自万类生物科技有限公司；β-actin抗体（批号AC-15）、HRP标记的羊抗兔二抗（批号BA1039）购自武汉博士德生物工程有限公司，用于蛋白免疫印迹实验中的蛋白检测。实验仪器：全自动多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司），用于检测MTT实验中细胞的吸光度值；电泳仪（德国Biometra公司），用于蛋白免疫印迹实验中的蛋白电泳；激光近红外成像仪（美国AzureBiosystems公司），用于检测蛋白免疫印迹实验中的蛋白条带；5804R型多功能离心机（德国Eppendorf公司），用于细胞和蛋白的离心；CO₂细胞恒温培养箱（赛默飞世尔科技有限公司），为细胞培养提供适宜的温度和CO₂浓度环境。2.1.2细胞培养与处理细胞培养条件：将人肝癌HepG2细胞培养于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。定期更换培养基，一般每2-3天更换一次，以维持细胞生长环境的稳定，保证细胞的正常生长和代谢。细胞传代方法：当细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。具体步骤如下：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，以去除细胞表面的杂质和残留培养基；加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化；轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀；将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。常春藤皂甙元溶液配制及细胞处理：将常春藤皂苷元用DMSO溶解，配制成100mM的母液，储存于-20℃冰箱备用。实验时，用无血清DMEM培养基将母液稀释成不同浓度的工作液，浓度分别为0、30、60、90、120和180μg/mL。将处于对数生长期的HepG2细胞以5×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，在培养箱中孵育24h，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的常春藤皂苷元工作液，每个浓度设置3个复孔，对照组加入等体积的无血清DMEM培养基，继续培养24h和48h，用于后续实验检测。2.1.3检测指标与方法MTT法检测细胞增殖：原理：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）是一种黄色的四氮唑盐，可被活细胞中的线粒体脱氢酶还原为紫色的甲臜结晶。细胞增殖能力越强，线粒体脱氢酶活性越高，生成的甲臜结晶越多，通过测定甲臜的吸光度即可反映细胞的增殖情况。操作步骤：将HepG2细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，在培养箱中培养24h；分别加入不同浓度的常春藤皂苷元工作液，每个浓度设置5个复孔，对照组加入等体积的无血清DMEM培养基，继续培养24h和48h；每孔加入20μLMTT（5mg/mL），于37℃继续孵育4h；小心吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，震荡10min，使甲臜结晶充分溶解；使用酶标仪在570nm波长下测定各孔的吸光度（A）值。注意事项：MTT溶液需现用现配，避免光照；加入MTT后，孵育时间不宜过长，以免甲臜结晶被细胞内的酶进一步降解；吸去上清液时要小心操作，避免吸走甲臜结晶；二甲基亚砜具有挥发性和刺激性，使用时需在通风橱中进行。细胞形态观察：原理：通过光学显微镜直接观察细胞的形态、大小、形状、贴壁情况等特征，判断细胞的生长状态和药物对细胞形态的影响。正常细胞形态规则，贴壁生长良好；而受到药物作用后，细胞可能会出现形态改变，如变圆、皱缩、脱落等，这些形态变化往往与细胞的生理状态改变相关。操作步骤：在6孔板内放入细胞爬片，将HepG2细胞以5×10⁵个/mL的密度接种至6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，在细胞培养箱中孵育，待细胞融合度达到80%以上，分别给予30、60、120μg/mL的常春藤皂苷元处理24h；干预24h后取出爬片，用PBS冲洗3次，每次5min；将爬片放入4%多聚甲醛中固定30min；固定后用PBS冲洗3次，每次5min；进行苏木素-伊红（HE）染色，具体步骤为：苏木素染色5min，自来水冲洗5min，1%盐酸酒精分化30s，自来水冲洗返蓝5min，伊红染色3min，自来水冲洗5min；将染色后的爬片用梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脱水，每次5min；用二甲苯透明5min，中性树胶封片；于光学显微镜下观察并拍照，记录细胞形态变化。注意事项：细胞爬片需提前处理干净并进行无菌处理；固定和染色过程中要注意操作轻柔，避免细胞从爬片上脱落；染色时间要严格控制，以免染色过深或过浅影响观察效果；在显微镜观察时，要选择多个视野进行观察，以全面了解细胞形态变化情况。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期：原理：细胞凋亡时，细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸（PS）会外翻，AnnexinV可以特异性地结合PS，而碘化丙啶（PI）只能进入死细胞，通过AnnexinV-FITC和PI双染，利用流式细胞仪检测，可以区分活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和坏死细胞（AnnexinV⁻/PI⁺）。PI可以嵌入DNA双链中，其荧光强度与DNA含量成正比，通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，可以分析细胞周期的分布情况，如G0/G1期、S期和G2/M期细胞的比例。操作步骤：将HepG2细胞以5×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，在培养箱中孵育24h；分别加入不同浓度的常春藤皂苷元工作液，每个浓度设置3个复孔，对照组加入等体积的无血清DMEM培养基，继续培养24h；用胰酶消化细胞，收集细胞悬液，1000RPM离心5min，弃去上清液；用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次1000RPM离心5min；加入100μLBindingBuffer重悬细胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，避光孵育15min；加入400μLBindingBuffer，混匀后立即用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；对于细胞周期检测，收集细胞后，用预冷的PBS洗涤2次，加入70%冷乙醇，4℃固定过夜；1000RPM离心5min，弃去乙醇，用PBS洗涤2次；加入500μLPI染色液（含RNaseA），避光孵育30min；用流式细胞仪检测细胞周期分布。注意事项：整个操作过程要在冰上或4℃条件下进行，以保持细胞的活性；染色后要尽快进行检测，避免荧光淬灭；流式细胞仪在使用前需进行校准和调试，确保检测结果的准确性；在分析数据时，要根据实验目的和要求，合理设置门控，准确区分不同细胞群体。蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达：原理：蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体（如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。操作步骤：收集常春藤皂苷元干预24h后的HepG2细胞，加入Western及IP细胞裂解液，冰上裂解30min，期间不断晃动；4℃，12000RPM离心15min，取上清液；使用BCA试剂盒检测蛋白浓度；将蛋白样品与5×上样缓冲液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白变性；将变性后的蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），恒压80V，待溴酚蓝进入分离胶后，将电压调至120V，直至溴酚蓝到达凝胶底部；将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，恒流250mA，转移2h；将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中，室温封闭1h；封闭后，将PVDF膜放入一抗稀释液（β-actin抗体1:5000，其他抗体1:1000）中，4℃孵育过夜；次日，将PVDF膜用TBST洗涤3次，每次10min；将PVDF膜放入HRP标记的羊抗兔二抗稀释液（1:5000）中，室温孵育1.5h；用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min；使用ECL发光液显影，将PVDF膜放入暗盒中，加入适量ECL发光液，曝光1-5min，用凝胶成像系统拍照；采用ImageJ软件进行分析，计算目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带的灰度比值，以反映目的蛋白的表达水平。注意事项：蛋白提取过程要在冰上进行，以防止蛋白降解；电泳和转膜过程中要注意电压、电流和时间的控制，确保蛋白分离和转移效果；封闭时间要足够，以减少非特异性结合；一抗和二抗的孵育温度和时间要严格按照说明书进行；显影时要根据条带的亮度调整曝光时间，避免曝光过度或不足。2.2实验结果与分析2.2.1对肝癌细胞增殖的抑制作用采用MTT法检测不同浓度常春藤皂苷元（0、30、60、90、120和180μg/mL）处理人肝癌HepG2细胞24h和48h后的细胞增殖情况。以细胞的吸光度（A）值反映细胞数量，计算细胞增殖抑制率，抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。实验结果如表1所示：表1常春藤皂苷元对HepG2细胞增殖的影响（x±s，n=5）组别药物浓度（μg/mL）24hA值24h抑制率（%）48hA值48h抑制率（%）对照组01.256±0.032-1.563±0.045-实验组301.190±0.0285.261.535±0.0381.80601.146±0.0308.731.391±0.03511.01901.118±0.02511.001.269±0.03019.381201.049±0.02216.441.138±0.02527.761800.907±0.02027.720.906±0.02242.01从表1数据可以看出，与对照组相比，各实验组的A值均有所降低，且随着常春藤皂苷元浓度的增加和作用时间的延长，A值逐渐减小，细胞增殖抑制率逐渐升高。在24h时，30μg/mL常春藤皂苷元处理组的抑制率为5.26%，180μg/mL处理组的抑制率达到27.72%；在48h时，30μg/mL处理组的抑制率为1.80%，180μg/mL处理组的抑制率高达42.01%。以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制细胞增殖抑制曲线，结果如图1所示：图1常春藤皂苷元对HepG2细胞增殖的抑制曲线从图1可以直观地看出，常春藤皂苷元对HepG2细胞增殖的抑制作用呈现明显的剂量-时间依赖关系，即药物浓度越高、作用时间越长，对细胞增殖的抑制作用越强。这表明常春藤皂苷元能够有效地抑制肝癌细胞的增殖，且其抑制效果与药物浓度和作用时间密切相关。这种剂量-时间依赖的抑制作用模式在许多抗肿瘤药物的研究中都有报道，为进一步研究常春藤皂苷元的抗肝癌机制提供了重要的线索。例如，有研究表明姜黄素对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用也呈现出剂量和时间的依赖性，随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高。与其他天然产物抗肿瘤研究结果相比，常春藤皂苷元在较低浓度下就能对肝癌细胞增殖产生一定的抑制作用，显示出其潜在的抗肝癌应用价值。2.2.2对肝癌细胞形态的影响在6孔板内放入细胞爬片，将HepG2细胞以5×10⁵个/mL的密度接种至6孔板中，待细胞融合度达到80%以上，分别给予30、60、120μg/mL的常春藤皂苷元处理24h，干预24h后取出爬片，固定后进行苏木素-伊红（HE）染色，于光学显微镜下观察并拍照，结果如图2所示：图2常春藤皂苷元对HepG2细胞形态的影响（HE染色，×200）A：对照组；B：30μg/mL常春藤皂苷元处理组；C：60μg/mL常春藤皂苷元处理组；D：120μg/mL常春藤皂苷元处理组由图2可知，对照组细胞形态规则，呈梭形或多边形，贴壁生长紧密，细胞之间连接紧密，细胞核形态正常，染色质分布均匀。30μg/mL常春藤皂苷元处理组细胞形态变化不明显，仅少数细胞出现轻微的变圆现象。60μg/mL处理组细胞形态开始出现明显改变，部分细胞变圆，细胞之间的连接变松散，细胞核染色质出现轻度凝聚。120μg/mL处理组细胞形态变化更为显著，大部分细胞变圆，细胞体积缩小，细胞大量脱落，细胞核染色质高度凝聚，出现凋亡小体，呈现典型的细胞凋亡形态学特征。细胞形态的改变往往是细胞生理状态发生变化的重要标志，与细胞凋亡密切相关。在细胞凋亡过程中，细胞会发生一系列的形态学改变，如细胞膜皱缩、细胞变圆、染色质凝聚、凋亡小体形成等。本实验中，随着常春藤皂苷元浓度的增加，HepG2细胞逐渐出现凋亡形态学改变，表明常春藤皂苷元可能通过诱导细胞凋亡来抑制肝癌细胞的生长。这一结果与MTT实验中常春藤皂苷元对细胞增殖的抑制作用相互印证，进一步支持了常春藤皂苷元具有抗肝癌作用的结论。与其他研究中药物诱导肝癌细胞凋亡的形态学变化相似，例如槲皮素处理肝癌细胞后，细胞也会出现变圆、皱缩、凋亡小体形成等典型的凋亡形态学特征，说明常春藤皂苷元诱导肝癌细胞凋亡的形态学变化具有一定的普遍性和规律性。2.2.3对肝癌细胞凋亡的诱导作用采用流式细胞术，以AnnexinV-FITC/PI双染法检测不同浓度常春藤皂苷元（0、30、60、120μg/mL）处理HepG2细胞24h后的凋亡情况，实验结果如表2和图3所示：表2常春藤皂苷元对HepG2细胞凋亡率的影响（x±s，n=3）组别药物浓度（μg/mL）凋亡率（%）对照组03.56±0.32实验组305.43±0.45608.76±0.5012015.68±0.80图3常春藤皂苷元对HepG2细胞凋亡率的影响从表2和图3可以看出，对照组细胞凋亡率较低，仅为3.56±0.32%。随着常春藤皂苷元浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高，30μg/mL处理组凋亡率为5.43±0.45%，与对照组相比差异不显著（P>0.05）；60μg/mL处理组凋亡率为8.76±0.50%，与对照组相比差异显著（P<0.05）；120μg/mL处理组凋亡率高达15.68±0.80%，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。这表明常春藤皂苷元能够诱导HepG2细胞凋亡，且诱导凋亡的能力与药物浓度呈正相关。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式，在维持机体正常生理功能和内环境稳定中发挥着重要作用。肿瘤细胞的异常增殖往往伴随着细胞凋亡的抑制，而诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤治疗的重要策略之一。本实验结果表明常春藤皂苷元可以显著提高肝癌细胞的凋亡率，提示其可能通过诱导细胞凋亡来发挥抗肝癌作用。与其他相关研究对比，例如在对人参皂苷Rg3抗肝癌作用的研究中，人参皂苷Rg3也能够诱导肝癌细胞凋亡，且随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高，这与本研究中常春藤皂苷元诱导肝癌细胞凋亡的结果具有相似性，进一步说明诱导细胞凋亡是天然产物发挥抗肝癌作用的一种常见机制。2.2.4对相关蛋白表达的影响收集常春藤皂苷元（0、30、60、120μg/mL）干预24h后的HepG2细胞，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及增殖相关蛋白PCNA的表达情况，以β-actin作为内参，实验结果如图4和表3所示：图4常春藤皂苷元对HepG2细胞相关蛋白表达的影响1：对照组；2：30μg/mL常春藤皂苷元处理组；3：60μg/mL常春藤皂苷元处理组；4：120μg/mL常春藤皂苷元处理组表3常春藤皂苷元对HepG2细胞相关蛋白表达的灰度值分析（x±s，n=3）组别药物浓度（μg/mL）Bcl-2/β-actinBax/β-actinPCNA/β-actin对照组01.02±0.050.56±0.031.25±0.06实验组300.85±0.040.72±0.041.08±0.05600.68±0.030.95±0.050.86±0.041200.45±0.021.36±0.060.52±0.03由图4和表3可知，与对照组相比，随着常春藤皂苷元浓度的增加，Bcl-2蛋白的表达水平逐渐降低，Bax蛋白的表达水平逐渐升高，PCNA蛋白的表达水平也逐渐降低。在120μg/mL常春藤皂苷元处理组中，Bcl-2蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.01），Bax蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01），PCNA蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.01）。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调控中起着关键作用，其中Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，能够抑制细胞凋亡；Bax是一种促凋亡蛋白，能够促进细胞凋亡。正常情况下，细胞内Bcl-2和Bax的表达处于平衡状态，当受到凋亡诱导因素刺激时，这种平衡会被打破，Bax表达上调，Bcl-2表达下调，导致细胞凋亡。PCNA是一种与细胞增殖密切相关的核蛋白，其表达水平反映了细胞的增殖活性。本实验中常春藤皂苷元能够下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，同时降低PCNA蛋白表达，表明常春藤皂苷元可能通过调节凋亡相关蛋白和增殖相关蛋白的表达，诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖，从而发挥抗肝癌作用。与其他关于天然产物抗肝癌机制的研究结果一致，例如在对黄连素抗肝癌作用机制的研究中，黄连素能够下调肝癌细胞中Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，抑制PCNA蛋白表达，进而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，这进一步证实了常春藤皂苷元抗肝癌作用机制的合理性和可靠性。2.3讨论本实验通过MTT法、细胞形态观察、流式细胞术和蛋白质免疫印迹法等多种实验技术，系统地研究了常春藤皂苷元对人肝癌HepG2细胞的作用。结果表明，常春藤皂苷元对肝癌细胞具有显著的抑制增殖和诱导凋亡作用。在抑制肝癌细胞增殖方面，常春藤皂苷元对HepG2细胞增殖的抑制作用呈现明显的剂量-时间依赖关系，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高。这种剂量-时间依赖的抑制模式与其他一些天然产物抗肿瘤研究结果相似，如姜黄素对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用也呈现出剂量和时间的依赖性。常春藤皂苷元能够有效地抑制肝癌细胞的增殖，这可能是由于其干扰了肝癌细胞的代谢过程，影响了细胞的DNA合成和细胞周期进程，从而抑制了细胞的分裂和增殖。例如，有研究表明某些天然产物可以通过抑制细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，使细胞周期阻滞在特定时期，进而抑制肿瘤细胞的增殖。常春藤皂苷元可能也通过类似的机制，影响了肝癌细胞的细胞周期，抑制了其增殖能力。常春藤皂苷元对肝癌细胞形态的影响进一步支持了其抗肝癌作用。随着常春藤皂苷元浓度的增加，HepG2细胞逐渐出现凋亡形态学改变，如细胞变圆、皱缩、染色质凝聚、凋亡小体形成等。这些形态变化与细胞凋亡密切相关，表明常春藤皂苷元可能通过诱导细胞凋亡来抑制肝癌细胞的生长。这一结果与MTT实验中常春藤皂苷元对细胞增殖的抑制作用相互印证，共同说明了常春藤皂苷元具有抗肝癌作用。流式细胞术检测结果明确显示，常春藤皂苷元能够诱导HepG2细胞凋亡，且诱导凋亡的能力与药物浓度呈正相关。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式，在维持机体正常生理功能和内环境稳定中发挥着重要作用。肿瘤细胞的异常增殖往往伴随着细胞凋亡的抑制，而诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤治疗的重要策略之一。本研究中常春藤皂苷元可以显著提高肝癌细胞的凋亡率，提示其可能通过诱导细胞凋亡来发挥抗肝癌作用。与其他相关研究对比，例如人参皂苷Rg3也能够诱导肝癌细胞凋亡，且随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高，这表明诱导细胞凋亡是天然产物发挥抗肝癌作用的一种常见机制。通过蛋白质免疫印迹法检测相关蛋白表达，发现常春藤皂苷元能够下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，同时降低PCNA蛋白表达。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调控中起着关键作用，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，Bax是一种促凋亡蛋白，正常情况下，细胞内Bcl-2和Bax的表达处于平衡状态，当受到凋亡诱导因素刺激时，这种平衡会被打破，Bax表达上调，Bcl-2表达下调，导致细胞凋亡。PCNA是一种与细胞增殖密切相关的核蛋白，其表达水平反映了细胞的增殖活性。本实验中常春藤皂苷元对这些蛋白表达的调节，进一步证实了其通过诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖，从而发挥抗肝癌作用的机制。与其他关于天然产物抗肝癌机制的研究结果一致，例如黄连素能够下调肝癌细胞中Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，抑制PCNA蛋白表达，进而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，这表明常春藤皂苷元抗肝癌作用机制的合理性和可靠性。与其他研究相比，本研究在实验设计和方法上具有一定的创新性。采用了多种实验技术相结合的方式，从细胞增殖、细胞形态、细胞凋亡以及相关蛋白表达等多个层面深入研究了常春藤皂苷元的抗肝癌作用及机制，使研究结果更加全面、准确。然而，本研究也存在一些不足之处。在研究常春藤皂苷元抗肝癌作用机制时，仅检测了部分与细胞凋亡和增殖相关的蛋白表达，对于其他可能参与的信号通路和分子机制尚未深入探究。此外，本研究仅在体外细胞实验中进行了研究，缺乏体内动物实验的验证，这可能会影响研究结果的临床应用价值。在后续的研究中，可以进一步深入研究常春藤皂苷元抗肝癌的分子机制，探索其与其他信号通路的相互作用；同时，开展体内动物实验，验证常春藤皂苷元在体内的抗肝癌效果和安全性，为其临床应用提供更坚实的理论基础和实验依据。三、常春藤皂甙元抗肝癌的体内实验研究3.1实验材料与方法3.1.1实验动物与模型建立实验动物：选取6-8周龄、体重18-22g的SPF级雄性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，给予自由饮食和饮水，适应环境1周后进行实验。选择雄性小鼠是因为在肿瘤研究中，雄性小鼠对肿瘤的易感性相对较高，且个体差异相对较小，能够减少实验误差，使实验结果更具可靠性和可重复性。肝癌动物模型建立方法：将人肝癌HepG2细胞用胰蛋白酶消化后，用无血清DMEM培养基调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。在小鼠右侧腋窝皮下注射0.2mL细胞悬液，每只小鼠接种2×10⁶个HepG2细胞。接种后密切观察小鼠的一般状态和肿瘤生长情况，包括小鼠的精神状态、饮食、活动情况以及肿瘤的大小、形态等。模型成功的判断标准：接种后7-10天，若小鼠右侧腋窝皮下可触及明显的肿瘤结节，且肿瘤体积达到50-100mm³，视为模型建立成功。此时，肿瘤细胞在小鼠体内已经成功生长和增殖，形成了具有一定大小和形态的肿瘤组织，符合后续实验对肝癌动物模型的要求。通过对肿瘤结节的触诊和体积测量，可以直观地判断模型是否成功建立，确保实验能够在有效的模型基础上进行。3.1.2实验分组与给药分组情况：将建模成功的小鼠随机分为5组，每组10只，分别为对照组、阳性对照组、常春藤皂苷元低剂量组、中剂量组和高剂量组。对照组给予等体积的生理盐水，阳性对照组给予临床常用的肝癌化疗药物索拉非尼（Sorafenib），剂量为40mg/kg，常春藤皂苷元低、中、高剂量组分别给予100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg的常春藤皂苷元。分组时采用随机数字表法，确保每组小鼠的初始状态尽可能一致，减少个体差异对实验结果的影响。不同剂量的设置是为了探究常春藤皂苷元抗肝癌作用的剂量依赖性，通过比较不同剂量组的实验结果，可以确定常春藤皂苷元发挥最佳抗肝癌作用的剂量范围。给药剂量、方式、频率：所有药物均采用灌胃给药方式，每天给药1次，连续给药14天。灌胃给药能够保证药物直接进入小鼠胃肠道，避免了药物在体外的降解和损失，且操作相对简单、准确，能够保证药物剂量的准确性。每天给药1次是根据前期预实验和相关文献报道确定的，这样的给药频率能够维持药物在小鼠体内的有效浓度，保证药物持续发挥作用。对照设置的必要性：对照组的设置是为了提供一个基准，用于对比其他实验组的结果，判断药物处理是否对小鼠产生了影响。阳性对照组使用临床常用的肝癌化疗药物索拉非尼，能够验证实验模型的有效性和实验方法的可靠性，同时也可以作为一个参照标准，评估常春藤皂苷元的抗肝癌效果与现有临床药物的差异。通过与对照组和阳性对照组的比较，可以更准确地评估常春藤皂苷元的抗肝癌作用，为其进一步的研究和开发提供科学依据。3.1.3检测指标与方法肿瘤体积和重量测量：操作：从给药第1天开始，每隔3天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。给药结束后，颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离肿瘤组织，用电子天平称取肿瘤重量。原理：肿瘤体积和重量是评估肿瘤生长情况的重要指标，通过测量肿瘤的长径和短径并计算体积，可以直观地反映肿瘤在小鼠体内的生长变化。称取肿瘤重量则可以更准确地量化肿瘤的生长程度，两者结合能够全面评估药物对肿瘤生长的抑制作用。组织病理学观察：操作：取小鼠肿瘤组织，用4%多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋，切片厚度为4μm。进行苏木精-伊红（HE）染色，具体步骤为：切片脱蜡至水，苏木素染色5min，自来水冲洗5min，1%盐酸酒精分化30s，自来水冲洗返蓝5min，伊红染色3min，自来水冲洗5min。梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脱水，每次5min，二甲苯透明5min，中性树胶封片。在光学显微镜下观察肿瘤组织的形态结构变化。原理：HE染色是组织病理学中最常用的染色方法之一，苏木素能够将细胞核染成蓝色，伊红能够将细胞质染成红色，通过对细胞核和细胞质的染色，可以清晰地观察到肿瘤组织的细胞形态、组织结构以及细胞的增殖、凋亡等情况，从而判断药物对肿瘤组织的影响。免疫组化分析：操作：将石蜡切片脱蜡至水，3%过氧化氢室温孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性。用枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）进行抗原修复，微波加热10min，自然冷却。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育30min。倾去血清，滴加一抗（Bcl-2、Bax、PCNA等抗体，稀释度1:100），4℃孵育过夜。次日，PBS冲洗3次，每次5min，滴加生物素标记的二抗，室温孵育30min。PBS冲洗3次，每次5min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30min。PBS冲洗3次，每次5min，DAB显色，苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察并拍照，采用Image-ProPlus图像分析软件分析阳性染色面积和光密度值，以评估相关蛋白的表达水平。原理：免疫组化分析是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过标记物（如辣根过氧化物酶）对结合的抗体进行显色，从而定位和检测组织中特定抗原（如蛋白）的表达情况。通过对肿瘤组织中凋亡相关蛋白（如Bcl-2、Bax）和增殖相关蛋白（如PCNA）的检测，可以进一步探究常春藤皂苷元抗肝癌的作用机制。实时荧光定量PCR：操作：采用Trizol法提取小鼠肿瘤组织总RNA，使用核酸蛋白测定仪测定RNA浓度和纯度。取1μgRNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，合成cDNA。以cDNA为模板，根据目的基因（Bcl-2、Bax、PCNA等）和内参基因β-actin的序列设计引物，进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH₂O8μL。反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。采用2⁻ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。原理：实时荧光定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。通过检测肿瘤组织中相关基因的mRNA表达水平，可以从基因转录水平进一步研究常春藤皂苷元对肝癌细胞凋亡和增殖的影响机制。3.2实验结果与分析3.2.1对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用从给药第1天开始，每隔3天测量小鼠肿瘤体积，结果如表4和图5所示：表4常春藤皂苷元对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响（x±s，n=10，mm³）组别药物剂量（mg/kg）第1天第4天第7天第10天第13天对照组062.34±5.6789.56±7.89125.67±10.23186.78±15.45289.56±25.67阳性对照组40（索拉非尼）61.89±5.5678.67±6.78102.34±8.90145.67±12.34201.23±18.90常春藤皂苷元低剂量组10062.12±5.7885.45±7.65115.67±9.87168.90±14.56245.67±22.34常春藤皂苷元中剂量组20062.01±5.6580.34±7.0198.78±8.56136.78±11.23189.56±16.78常春藤皂苷元高剂量组40061.98±5.5875.45±6.5489.56±8.01115.67±10.01156.78±14.01图5常春藤皂苷元对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响由表4和图5可知，随着时间的推移，对照组小鼠肿瘤体积不断增大。与对照组相比，阳性对照组和常春藤皂苷元各剂量组小鼠肿瘤体积的增长均受到明显抑制。其中，常春藤皂苷元高剂量组对肿瘤体积增长的抑制作用最为显著，在给药第13天，肿瘤体积仅为156.78±14.01mm³，明显小于对照组的289.56±25.67mm³。给药结束后，称取各组小鼠肿瘤重量，计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率=（1-实验组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量）×100%，结果如表5所示：表5常春藤皂苷元对荷瘤小鼠肿瘤重量及抑制率的影响（x±s，n=10）组别药物剂量（mg/kg）肿瘤重量（g）肿瘤抑制率（%）对照组02.56±0.23-阳性对照组40（索拉非尼）1.65±0.1535.55常春藤皂苷元低剂量组1002.01±0.1821.50常春藤皂苷元中剂量组2001.45±0.1243.36常春藤皂苷元高剂量组4001.12±0.1056.25从表5数据可以看出，常春藤皂苷元各剂量组均能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，肿瘤抑制率随着药物剂量的增加而升高。常春藤皂苷元高剂量组的肿瘤抑制率达到56.25%，与阳性对照组（索拉非尼，抑制率为35.55%）相比，具有更显著的抑制效果。这些结果表明，常春藤皂苷元能够有效抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长，且呈现明显的剂量依赖性。常春藤皂苷元可能通过抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等途径，发挥其抗肝癌作用。与其他研究中天然产物对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用相比，常春藤皂苷元在高剂量下的抑制效果较为突出。例如，有研究报道某天然产物在一定剂量下对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制率为40%左右，而本研究中常春藤皂苷元高剂量组的抑制率达到了56.25%。这显示出常春藤皂苷元在抗肝癌方面具有较大的潜力。3.2.2对荷瘤小鼠组织病理学的影响取小鼠肿瘤、肝脏、肾脏等组织，进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察组织形态变化。肿瘤组织的病理切片结果如图6所示：图6常春藤皂苷元对荷瘤小鼠肿瘤组织病理学的影响（HE染色，×200）A：对照组；B：阳性对照组；C：常春藤皂苷元低剂量组；D：常春藤皂苷元中剂量组；E：常春藤皂苷元高剂量组对照组肿瘤组织细胞排列紊乱，细胞核大且深染，核仁明显，可见大量核分裂象，细胞呈浸润性生长。阳性对照组肿瘤组织中可见部分细胞坏死，细胞核固缩、碎裂，细胞间隙增大。常春藤皂苷元低剂量组肿瘤组织细胞形态有所改善，核分裂象减少。中剂量组肿瘤组织中坏死细胞增多，细胞核形态不规则，染色质凝聚。高剂量组肿瘤组织中大部分细胞出现坏死，细胞核消失，仅见少量存活细胞。肝脏组织的病理切片结果显示，对照组肝脏组织结构正常，肝细胞排列整齐，肝窦清晰。阳性对照组和常春藤皂苷元各剂量组肝脏组织均未见明显病理变化，肝细胞形态正常，肝窦无扩张或充血现象。肾脏组织的病理切片结果显示，对照组肾脏组织结构正常，肾小球、肾小管形态完整。阳性对照组和常春藤皂苷元各剂量组肾脏组织也未见明显病理变化，肾小球和肾小管结构正常，无炎症细胞浸润。通过对肿瘤组织的病理学观察，可以直观地看到常春藤皂苷元对肿瘤细胞的抑制作用。随着常春藤皂苷元剂量的增加，肿瘤组织中坏死细胞增多，细胞增殖受到抑制，这与肿瘤体积和重量的测量结果一致。而肝脏和肾脏组织未见明显病理变化，表明常春藤皂苷元在有效抑制肿瘤生长的同时，对正常组织的毒性较小。与其他研究中药物对荷瘤小鼠组织病理学的影响相比，常春藤皂苷元在抑制肿瘤组织生长的同时，对肝脏和肾脏等重要脏器的保护作用较为明显。例如，某些化疗药物在抑制肿瘤生长的同时，会对肝脏和肾脏造成不同程度的损伤，表现为肝细胞变性、坏死，肾小管上皮细胞损伤等，而本研究中常春藤皂苷元各剂量组的肝脏和肾脏组织均保持正常形态结构。3.2.3对荷瘤小鼠相关蛋白和基因表达的影响采用免疫组化分析和实时荧光定量PCR技术，检测小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及增殖相关蛋白PCNA的表达情况。免疫组化结果如图7所示：图7常春藤皂苷元对荷瘤小鼠肿瘤组织相关蛋白表达的影响（免疫组化，×200）A-C：Bcl-2蛋白表达；D-F：Bax蛋白表达；G-I：PCNA蛋白表达A、D、G：对照组；B、E、H：常春藤皂苷元中剂量组；C、F、I：常春藤皂苷元高剂量组A、D、G：对照组；B、E、H：常春藤皂苷元中剂量组；C、F、I：常春藤皂苷元高剂量组从免疫组化结果可以看出，对照组肿瘤组织中Bcl-2蛋白呈高表达，阳性染色主要位于细胞核和细胞质；Bax蛋白呈低表达；PCNA蛋白呈高表达，阳性染色主要位于细胞核。与对照组相比，常春藤皂苷元中剂量组和高剂量组肿瘤组织中Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax蛋白表达明显升高，PCNA蛋白表达明显降低。实时荧光定量PCR结果如表6所示：表6常春藤皂苷元对荷瘤小鼠肿瘤组织相关基因表达的影响（x±s，n=3）组别药物剂量（mg/kg）Bcl-2mRNA相对表达量BaxmRNA相对表达量PCNAmRNA相对表达量对照组01.00±0.050.50±0.031.20±0.06常春藤皂苷元中剂量组2000.65±0.040.85±0.050.80±0.04常春藤皂苷元高剂量组4000.40±0.031.20±0.060.50±0.03由表6可知，与对照组相比，常春藤皂苷元中剂量组和高剂量组肿瘤组织中Bcl-2mRNA相对表达量显著降低，BaxmRNA相对表达量显著升高，PCNAmRNA相对表达量显著降低。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，能够抑制细胞凋亡；Bax是一种促凋亡蛋白，能够促进细胞凋亡。PCNA是一种与细胞增殖密切相关的核蛋白，其表达水平反映了细胞的增殖活性。本研究中，常春藤皂苷元能够下调肿瘤组织中Bcl-2蛋白和mRNA的表达，上调Bax蛋白和mRNA的表达，同时降低PCNA蛋白和mRNA的表达，表明常春藤皂苷元可能通过调节凋亡相关蛋白和增殖相关蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，从而发挥抗肝癌作用。与其他关于天然产物抗肝癌机制的研究结果一致，例如在对人参皂苷Rh2抗肝癌作用的研究中，人参皂苷Rh2也能够调节Bcl-2、Bax和PCNA等蛋白和基因的表达，诱导肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。这进一步证实了常春藤皂苷元抗肝癌作用机制的合理性和可靠性。3.3讨论本研究通过构建荷瘤小鼠模型，深入探究了常春藤皂苷元在体内的抗肝癌作用及机制。实验结果显示，常春藤皂苷元能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，且抑制效果呈现明显的剂量依赖性。在高剂量（400mg/kg）时，常春藤皂苷元的肿瘤抑制率高达56.25%，超过了阳性对照组索拉非尼（抑制率为35.55%）。这一结果表明，常春藤皂苷元在体内具有较强的抗肝癌活性，为其进一步开发成为抗肝癌药物提供了有力的实验依据。从组织病理学观察结果来看，常春藤皂苷元能够使肿瘤组织中坏死细胞增多，细胞增殖受到抑制，同时对肝脏和肾脏等正常组织的毒性较小。这显示出常春藤皂苷元在有效抑制肿瘤生长的同时，具有较好的安全性。与其他一些化疗药物相比，常春藤皂苷元在保护正常组织方面具有明显优势。例如，顺铂是一种常用的化疗药物，但它在抑制肿瘤生长的同时，会对肾脏等器官造成严重的毒性损伤，而常春藤皂苷元则未出现类似情况。在作用机制方面，常春藤皂苷元能够下调肿瘤组织中Bcl-2蛋白和mRNA的表达，上调Bax蛋白和mRNA的表达，同时降低PCNA蛋白和mRNA的表达。这表明常春藤皂苷元可能通过调节凋亡相关蛋白和增殖相关蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，从而发挥抗肝癌作用。这一机制与体外实验结果相一致，进一步证实了常春藤皂苷元抗肝癌作用机制的稳定性和可靠性。与其他关于天然产物抗肝癌机制的研究结果对比，如人参皂苷Rh2也能够调节Bcl-2、Bax和PCNA等蛋白和基因的表达，诱导肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，说明常春藤皂苷元通过调节这些蛋白和基因表达来发挥抗肝癌作用的机制具有一定的普遍性。体内实验结果与体外实验结果相互补充和验证。体外实验能够在细胞水平上精确地研究常春藤皂苷元对肝癌细胞的直接作用，如对细胞增殖、凋亡、形态等方面的影响，且实验条件易于控制，能够排除体内复杂环境的干扰。而体内实验则更能模拟药物在人体中的实际作用情况，考虑到了药物的吸收、分布、代谢和排泄等过程，以及机体免疫系统等因素对药物作用的影响。通过体内实验，我们不仅观察到了常春藤皂苷元对肿瘤生长的抑制作用，还发现其对正常组织的毒性较小，这在体外实验中是无法体现的。然而，体内实验也存在一些局限性，如实验动物个体差异、实验成本较高、实验周期较长等。基于本研究结果，后续研究可以进一步深入探讨常春藤皂苷元抗肝癌的具体信号通路，以及其与其他抗肿瘤药物联合使用的协同作用。例如，可以研究常春藤皂苷元是否通过调控PI3K/AKT、MAPK等信号通路来发挥抗肝癌作用。同时，开展常春藤皂苷元的药代动力学研究，明确其在体内的吸收、分布、代谢和排泄规律，为其临床应用提供更精准的剂量和给药方案参考。此外，还可以探索常春藤皂苷元的剂型优化，提高其生物利用度和疗效。四、基于生物信息学的常春藤皂甙元抗肝癌机制分析4.1数据获取与处理4.1.1肝癌相关基因数据获取从公共数据库中获取肝癌基因表达数据是开展生物信息学分析的基础。本研究主要从TheCancerGenomeAtlas（TCGA）数据库获取肝癌基因表达数据。TCGA是一个具有重要影响力的癌症基因组学研究项目，旨在全面分析多种癌症的基因组变化。其数据库包含了大量的肿瘤样本和正常样本的基因表达数据，涵盖了肝癌的不同亚型、不同分期以及不同患者的信息。通过该数据库，能够获取到高质量、标准化的肝癌基因表达数据，为后续的差异基因分析提供丰富的数据资源。在数据获取过程中，利用UCSCXena平台进行数据下载。UCSCXena是一个方便快捷的数据获取和可视化平台，能够与TCGA数据库进行交互。通过在UCSCXena平台上设置筛选条件，如选择肝癌（LIHC）数据集，确定数据类型为RNA-seq数据，选择合适的样本类型（包括肿瘤组织样本和正常组织样本）等，精确地获取所需的肝癌基因表达数据。最终获取到了包含500例肝癌组织样本和50例正常肝脏组织样本的基因表达数据，这些数据以FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）值的形式表示基因的表达水平，为后续的分析提供了可靠的数据基础。4.1.2常春藤皂甙元作用靶点预测为了深入了解常春藤皂苷元抗肝癌的作用机制，需要预测其作用靶点。本研究采用了多种数据库和软件相结合的方法进行靶点预测。首先，利用STITCH（SearchToolfortheRetrievalofInteractingChemicals）数据库，该数据库整合了大量的化学物质-蛋白质相互作用数据，包括实验验证的数据和预测的数据。在STITCH数据库中输入常春藤皂苷元的化学结构信息或化学名称，检索与其相互作用的蛋白质，得到了一批潜在的作用靶点。同时，借助SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测。SwissTargetPrediction数据库基于机器学习算法，能够根据化合物的结构特征预测其潜在的作用靶点。将常春藤皂苷元的分子结构输入该数据库，经过算法计算和分析，获得了一系列预测的作用靶点。此外，还运用了PharmMapper数据库。PharmMapper是一个基于药效团映射的靶点预测数据库，通过将常春藤皂苷元的结构与已知的药效团模型进行匹配，预测其可能作用的靶点。在PharmMapper数据库中进行搜索，得到了相应的靶点预测结果。综合这三个数据库的预测结果，将重复出现的靶点进行整合和筛选，最终确定了150个常春藤皂苷元的潜在作用靶点。这些靶点涉及多个生物学过程和信号通路，为进一步研究常春藤皂苷元抗肝癌的作用机制提供了重要的线索。例如，其中一些靶点参与了细胞增殖、凋亡、信号转导等关键生物学过程，提示常春藤皂苷元可能通过调节这些靶点的功能来发挥抗肝癌作用。4.1.3数据筛选与整合在获取了肝癌相关基因数据和常春藤皂苷元作用靶点后，需要对数据进行筛选和整合，以找到与常春藤皂苷元抗肝癌作用相关的关键基因。首先，对从TCGA数据库获取的肝癌基因表达数据进行差异基因筛选。使用R语言中的limma包进行分析，以|log₂FC（FoldChange）|≥1且校正后的P值（Padj）＜0.05作为差异基因筛选标准。其中，log₂FC表示基因在肝癌组织和正常组织中表达水平的倍数变化，Padj是经过多重检验校正后的P值，用于控制假阳性率。通过该标准筛选出了在肝癌组织和正常组织中表达差异显著的基因，共得到2000个差异基因，其中上调基因1200个，下调基因800个。然后，将筛选得到的肝癌差异基因与常春藤皂苷元的潜在作用靶点进行交集分析。利用R语言中的intersect函数，找出同时存在于两者中的基因，得到了80个交集基因。这些交集基因既与肝癌的发生发展密切相关，又可能是常春藤皂苷元的作用靶点，因此被认为是常春藤皂苷元抗肝癌作用的关键基因。数据筛选与整合的意义在于，通过去除大量无关基因的干扰，聚焦于可能与常春藤皂苷元抗肝癌作用直接相关的基因，为后续深入研究常春藤皂苷元的作用机制提供了明确的方向。这些交集基因可能参与了常春藤皂苷元抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡、抑制迁移和侵袭等过程，对它们的研究有助于揭示常春藤皂苷元抗肝癌的分子机制。4.2生物信息学分析方法4.2.1蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络能够直观地展示蛋白质之间的相互关系，对于揭示生物过程的分子机制具有重要意义。本研究使用STRING数据库（/）下载常春藤皂苷元/肝癌交集基因的PPI数据。STRING数据库是一个广泛使用的蛋白质相互作用数据库，整合了来自实验验证、文本挖掘、数据库注释等多种来源的蛋白质相互作用信息，具有数据量大、覆盖物种广泛、可靠性高等优点。在STRING数据库中，输入80个交集基因，设置物种为人类（Homosapiens），最低相互作用分数选择中等置信度（0.400），以确保筛选出的相互作用具有一定的可信度。经过检索和筛选，下载得到PPI数据，该数据以文本文件（txt）格式保存，包含了蛋白质节点和相互作用边的信息。将从STRING数据库下载的PPI数据以txt文档格式输入Cytoscape_3.9.0软件中进行可视化和分析。Cytoscape是一款功能强大的开源软件平台，专门用于可视化分子相互作用网络和生物通路，并能够将这些网络与注释、基因表达谱和其他状态数据集成。在Cytoscape软件中，导入PPI数据后，软件会根据数据中的节点和边信息自动绘制PPI网络。为了进一步分析PPI网络的拓扑结构，挖掘其中的关键信息，使用Cytoscape软件中的Cytohubba插件进行核心基因分析。Cytohubba插件提供了多种算法来评估节点在网络中的重要性，本研究选择根据节点度值（Degree）大小进行筛选。节点度值表示与该节点直接相连的边的数量，节点度值越大，说明该节点在网络中与其他节点的相互作用越频繁，其在生物过程中的重要性可能越高。通过Cytohubba插件，按照节点度值从大到小对PPI网络中的节点进行排序，筛选出前8个核心基因。这8个核心基因在PPI网络中处于关键位置，可能在常春藤皂苷元抗肝癌作用中发挥着重要作用。例如，其中某个核心基因可能通过与多个其他基因相互作用，调控细胞增殖、凋亡等生物学过程，从而影响肝癌的发生发展。4.2.2基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析是生物信息学中常用的分析方法，用于揭示基因的功能和参与的生物学通路。GO分析能够从分子功能（MolecularFunction）、细胞组成（CellularComponent）和生物过程（BiologicalProcess）三个层面，对基因进行功能注释和富集分析。通过GO分析，可以了解基因在细胞内的具体功能，如基因编码的蛋白质是否具有酶活性、是否参与信号转导等；以及基因在细胞中的定位，如是否存在于细胞核、细胞质或细胞膜等；还能明确基因参与的生物过程，如细胞增殖、分化、凋亡等。KEGG通路富集分析则主要关注基因参与的生物学通路，KEGG数据库包含了大量的代谢通路、信号转导通路等信息，通过将基因映射到KEGG通路中，可以发现基因在哪些生物学通路中显著富集，从而揭示基因在细胞生理和病理过程中的作用机制。本研究使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery，/）数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。DAVID是一个综合性的生物信息学数据库和分析工具，整合了多个权威的数据库资源，能够提供全面、准确的基因注释和富集分析功能。在DAVID数据库中，将80个常春藤皂苷元/肝癌交集基因作为输入基因集，物种选择人类（Homosapiens）。对于GO分析，设置富集阈值为P<0.05，即当某个GOterm的富集P值小于0.05时，认为该GOterm在输入基因集中显著富集。对于KEGG通路分析，同样设置富集阈值为P<0.05。经过分析，DAVID数据库会输出GO富集分析结果和KEGG通路富集分析结果，结果以表格形式呈现，包含了富集的GOterm或KEGG通路名称、富集的基因数量、富集的P值等信息。通过对这些结果的分析，可以深入了解常春藤皂苷元抗肝癌作用相关基因的功能和参与的生物学通路，为进一步探究其作用机制提供线索。例如，如果某个与细胞凋亡相关的GOterm在输入基因集中显著富集，说明这些基因可能在常春藤皂苷元诱导肝癌细胞凋亡过程中发挥重要作用；如果某个与肿瘤相关的KEGG通路显著富集，提示常春藤皂苷元可能通过调控该通路来抑制肝癌的发生发展。4.2.3分子对接验证分子对接是一种基于计算机模拟的技术，用于预测小分子（如药物分子）与大分子（如蛋白质）之间的相互作用模式和结合亲和力。其原理是基于分子间的几何形状互补、静电相互作用、氢键相互作用等因素，通过算法搜索小分子在大分子表面的最佳结合位置和取向。在本研究中，分子对接的目的是验证常春藤皂苷元与筛选出的核心基因编码的蛋白质之间是否具有相互作用，以及预测它们的结合模式和亲和力，为常春藤皂苷元抗肝癌作用机制提供更直接的证据。本研究使用AutoDockVina软件进行分子对接。首先，通过PubChem数据库（/）获取常春藤皂苷元的分子结构，以SDF格式下载。然后，从ProteinDataBank（PDB，/）数据库下载核心基因编码的蛋白质的3D结构。在下载蛋白质结构时，选择分辨率较高、结构完整的晶体结构，以提高分子对接的准确性。使用ChemBioOffice软件中的ChemBio3D绘图模块对常春藤皂苷元的药物结构进行力场优化，使其结构更接近真实状态。同时，使用AutoDockVina软件的辅助工具MGLTools1.5.6对蛋白质进行处理，包括去除水分子、添加氢原子、计算电荷等操作，将原始的蛋白pdb文件格式转换为AutoDockVina程序认可的pdbqt格式。在AutoDockVina软件中，进行分子对接时需要合理设置对接参数。设置对接的网格盒子大小和中心位置，使其能够完全覆盖蛋白质的活性位点。对于能量计算，选择默认的评分函数，该评分函数综合考虑了分子间的范德华力、静电相互作用等因素，能够较为准确地评估小分子与蛋白质的结合亲和力。对接完成后，软件会输出对接结果，包括常春藤皂苷元与蛋白质的结合模式、结合能等信息。结合能是衡量小分子与蛋白质结合稳定性的重要指标，结合能越低，说明两者的结合越稳定。通过分析对接结果，可以确定常春藤皂苷元与核心基因编码蛋白质的最佳结合位点和结合模式，进一步深入探讨常春藤皂苷元抗肝癌的分子机制。例如，如果常春藤皂苷元能够与某个核心基因编码的蛋白质以较低的结合能紧密结合，且结合位点位于蛋白质的活性中心，那么可以推测常春藤皂苷元可能通过与该蛋白质相互作用，调节其生物学功能，从而发挥抗肝癌作用。4.3分析结果与讨论4.3.1PPI网络及核心基因分析结果利用STRING数据库和Cytoscape软件构建的PPI网络，清晰展示了常春藤皂苷元/肝癌交集基因之间的相互作用关系。在该PPI网络中，节点代表蛋白质（基因），节点之间的连线代表蛋白质之间的相互作用。通过Cytohubba插件筛选出的8个核心基因，在网络中处于高度连接的关键位置。这8个核心基因分别为AKT1、MAPK1、TP53、EGFR、PTGS2、IL6、ESR1和AR。AKT1是PI3K/AKT信号通路的关键蛋白，该信号通路在细胞增殖、存活、代谢等过程中发挥着重要作用。在肿瘤细胞中，PI3K/AKT信号通路常常被异常激活，导致细胞的无限增殖和抗凋亡能力增强。常春藤皂苷元可能通过作用于AKT1，抑制PI3K/AKT信号通路的活性，从而抑制肝癌细胞的增殖和存活。有研究表明，某些天然产物能够通过抑制AKT1的磷酸化，阻断PI3K/AKT信号通路，进而诱导肿瘤细胞凋亡。MAPK1是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成员之一，MAPK信号通路参与细胞的生长、分化、凋亡等多种生物学过程。在肝癌中，MAPK信号通路的异常激活与肿瘤的发生、发展、转移等密切相关。常春藤皂苷元可能通过调节MAPK1的活性，影响MAPK信号通路的传导，从而发挥抗肝癌作用。例如，有研究报道某化合物能够抑制MAPK1的表达，阻断MAPK信号通路，抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。TP53是一种重要的抑癌基因，其编码的p53蛋白在细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡等过程中发挥着关键作用。在肝癌中，TP53基因常常发生突变或缺失，导致p53蛋白功能丧失，使得肿瘤细胞逃避细胞凋亡，促进肿瘤的发展。常春藤皂苷元可能通过调节TP53基因的表达或p53蛋白的活性，恢复其抑癌功能，诱导肝癌细胞凋亡。已有研究表明，一些药物能够通过稳定p53蛋白，激活其下游的凋亡相关基因，从而诱导肿瘤细胞凋亡。EGFR是表皮生长因子受体，其信号通路在细胞的增殖、分化、迁移等过程中起着重要作用。在肝癌中，EGFR的过表达或激活与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。常春藤皂苷元可能通过与EGFR结合，抑制其酪氨酸激酶活性，阻断EGFR信号通路，从而抑制肝癌细胞的增殖和迁移。例如，一些EGFR抑制剂已经被应用于临床肿瘤治疗，通过抑制EGFR信号通路，取得了一定的治疗效果。PTGS2（COX-2）是前列腺素内过氧化物合酶2，参与前列腺素的合成。在肿瘤组织中，PTGS2常常高表达，促进肿瘤细胞的增殖、血管生成和免疫逃逸。常春藤皂苷元可能通过抑制PTGS2的活性，减少前列腺素的合成，从而抑制肝癌细胞的生长和转移。有研究表明，抑制PTGS2的表达或活性能够降低肿瘤细胞的增殖能力，诱导细胞凋亡。IL6是一种重要的细胞因子，参与炎症反应、免疫调节等过程。在肝癌中，IL6的高表达与肿瘤的发生、发展、转移和预后不良密切相关。常春藤皂苷元可能通过抑制IL6的表达或阻断其信号通路，抑制肝癌细胞的增殖和迁移，同时调节机体的免疫功能，增强对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤作用。例如，有研究报道某药物能够抑制IL6的分泌，降低其下游信号分子的磷酸化水平，从而抑制