单克隆抗体筛选及杂交瘤细胞培养方法

摘要单克隆抗体技术是生物医学研究与临床应用的核心工具之一，杂交瘤细胞的高效筛选与稳定培养是获得高特异性、高亲和力单抗的关键环节。本文系统阐述单克隆抗体制备中杂交瘤细胞融合、选择性培养、抗体筛选、克隆化及细胞扩增的优化方法，结合实践经验分析常见问题的解决方案，为单抗研发提供兼具理论指导与实操价值的技术参考。引言1975年Kohler与Milstein创立的杂交瘤技术，通过将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合，开创了单克隆抗体（mAb）规模化制备的新纪元。单抗凭借其特异性强、批间一致性高的优势，已广泛应用于疾病诊断、靶向治疗及基础研究。然而，杂交瘤细胞的筛选效率与培养稳定性直接决定单抗的质量与产量，因此优化筛选策略与培养体系是单抗研发的核心挑战。本文从细胞准备、融合、筛选到克隆化培养的全流程入手，解析关键技术节点的优化方案，助力研究者高效获得稳定分泌目标抗体的杂交瘤细胞株。材料与方法1.细胞与试剂准备免疫脾细胞：选择6-8周龄Balb/c小鼠，采用多轮免疫策略（基础免疫+2-3次加强免疫），末次免疫后3天处死，无菌分离脾脏，经200目筛网研磨获得单细胞悬液，红细胞裂解液（如ACK裂解液）处理后，台盼蓝染色计数，确保细胞活力＞95%。骨髓瘤细胞：选用对数生长期的SP2/0或NS-1细胞，融合前12-24小时传代，调整密度至5×10⁵cells/mL，保证融合时细胞活力＞90%。试剂与培养基：聚乙二醇（PEG，分子量____）、HAT选择培养基（含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）、完全培养基（RPMI1640+10-20%胎牛血清+1%双抗）、无血清培养基（如HyCloneSFM4MAb）、冻存液（10%DMSO+40%FBS+50%完全培养基）。2.细胞融合1.细胞混合：按脾细胞:骨髓瘤细胞=5:1~10:1的比例混合，500g离心5分钟，弃上清后轻弹管底使细胞松散。2.PEG介导融合：37℃水浴预热PEG溶液，逐滴加入细胞沉淀（1mLPEG/1×10⁸细胞），边加边轻柔旋转，作用1分钟后，逐滴加入20mL无血清培养基终止反应，全程控制温度在37℃。3.接种与培养：500g离心5分钟，弃上清后用HAT选择培养基重悬细胞，调整密度至1×10⁶cells/mL，接种于96孔板（每孔200μL），37℃、5%CO₂培养箱静置培养。3.杂交瘤筛选选择性培养：融合后第5天更换半量HAT培养基（或全量，根据细胞生长密度），第10-14天观察到杂交瘤克隆（直径＞1mm）时，取上清进行抗体检测。抗体检测：采用ELISA法筛选阳性克隆：①抗原包被酶标板（1-10μg/mL，4℃过夜）；②封闭后加入杂交瘤上清（1:1稀释），37℃孵育1小时；③洗涤后加HRP标记的二抗，显色后酶标仪读取OD值，阳性孔OD值需为阴性孔的2.1倍以上。特异性验证：阳性克隆需进一步通过Westernblot、免疫荧光或竞争ELISA验证抗体与目标抗原的特异性结合，排除交叉反应。4.克隆化培养有限稀释法：将阳性孔细胞计数，用含饲养细胞（小鼠腹腔巨噬细胞，1×10⁴cells/孔）的完全培养基稀释至0.5-1cell/孔，接种于96孔板，培养7-10天后检测抗体，重复克隆化2-3次，直至100%克隆阳性。软琼脂法：底层琼脂（0.5%琼脂糖+完全培养基）铺板，上层细胞悬液（0.3%琼脂糖+细胞）铺于底层，37℃培养10-14天，挑取单克隆至24孔板扩增，检测抗体活性。5.杂交瘤细胞扩增与冻存规模化培养：阳性克隆转至24孔板或T25培养瓶，使用完全培养基（含10%FBS），当细胞密度达80%汇合时传代，或收集上清用于抗体纯化。无血清培养时，更换为无血清培养基，减少血清批次差异对抗体产量的影响。细胞冻存与复苏：对数生长期细胞用冻存液重悬（1×10⁷cells/mL），梯度降温（4℃30min→-20℃1h→-80℃过夜→液氮）；复苏时37℃水浴快速融化，离心去冻存液，重悬于完全培养基，24小时内更换培养基以去除DMSO。结果与讨论1.融合效率的影响因素PEG的分子量、作用时间及温度是融合效率的核心变量。实践中，PEG1500（浓度50%）作用1分钟、37℃条件下，融合率可达30-50%。若融合率偏低，需检查细胞活力（尤其是骨髓瘤细胞）或PEG的新鲜度（PEG易氧化，建议现配现用）。2.杂交瘤生长与抗体分泌的优化饲养细胞的作用：小鼠腹腔巨噬细胞可分泌IL-6等生长因子，显著提高杂交瘤克隆形成率（无饲养细胞时克隆形成率降低40-60%）。培养基优化：无血清培养基（如SFM4MAb）可使抗体产量提升2-3倍，且避免血清蛋白对抗体纯化的干扰，适合大规模生产。3.常见问题及解决方案克隆化失败：若多次克隆化后仍存在多克隆混合，需延长有限稀释的间隔时间（如每轮克隆化间隔7天），或采用显微操作法挑取单克隆。抗体效价低：可通过调整免疫方案（如增加免疫次数、更换佐剂）或优化抗原表位（如使用重组抗原替代天然抗原）提高抗体亲和力。注意事项1.无菌操作：所有试剂、耗材需经高压灭菌或过滤除菌，操作全程在超净台内完成，避免真菌或细菌污染。2.细胞活力监控：融合前需确保脾细胞与骨髓瘤细胞活力＞90%，台盼蓝染色时死细胞呈蓝色，活细胞透明。3.HAT培养基使用：氨基蝶呤对光敏感，需避光保存，培养基配制后2周内使用，否则需补加新鲜氨基蝶呤。4.筛选时机把握：杂交瘤克隆长至孔底1/3大小时（约融合后10-14天）检测抗体，过早检测易漏检低分泌克隆，过晚则孔间污染风险增加。结语单克隆抗体筛选与杂交瘤细胞培养是一项兼具技术精度与经验依赖性的工作，从细胞融合到克隆化的每一步优化都直接影响单抗的质量与