《仪器分析》课件-项目3：紫外-可见分光光度法

1.认识紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法介绍01目视比色法起源与应用

目视比色法起源约公元60年，老普林尼用目视比色法验证铁离子。目视比色法现代应用现代应用包括pH试纸、甲醛检测盒、家庭怀孕检测盒等。分光光度法发展分光光度法发展20世纪60年代后，精度更高的分光光度法逐渐替代比色法。紫外-可见分光光度法定义

紫外-可见分光光度法定义基于物质对紫外光（200~400nm）和可见光（400~760nm）的选择性吸收，实现定性与定量分析。物质颜色的产生02光的性质

复合光的定义由不同波长的光组合而成，如太阳光、灯光。

单色光的定义具有单一波长的光，如不同颜色的激光。

互补光的概念两种不同颜色的单色光按一定强度比例混合得到白光。互补光黄绿紫黄蓝橙青蓝红青紫红绿紫黄绿蓝黄青蓝橙青红物质颜色成因物质颜色的产生原理物质对可见光区域的光选择性吸收后呈现出互补光的颜色。高锰酸钾溶液颜色示例高锰酸钾溶液呈紫红色，因吸收了其互补色绿色。物质颜色与吸收光波长关系物质颜色与吸收光的对应关系，如高锰酸钾吸收525nm波长的绿色光。光的吸收定律03光的吸收相关定义入射光、吸收光、透过光关系入射光I₀等于吸收光Iₐ与透过光Iₜ之和。透光率定义透光率T为透过光Iₜ与入射光I₀的比值乘以100%。吸光度计算吸光度A等于负对数透光率，与透光率成反比。朗伯-比尔定律

朗伯-比尔定律内容吸光度A与溶液浓度c及液层厚度L成正比。

成立条件需平行单色光、溶液均匀无散射、条件恒定。

定量分析理论依据是分光光度法定量分析的理论基础。A=KcLK：吸光系数吸光度的加和性

吸光度加和性定义溶液的吸光度等于各吸光性物质吸光度总和。

多组分溶液分析适用于多组分溶液的定量分析。A（a+b+c）=Aa+Ab+Ac吸光系数吸光系数性质吸光系数是物质的物理常数，与浓度标度有关。摩尔吸光系数ε摩尔吸光系数ε单位为L/(mol·cm)与摩尔质量相关。百分吸光系数百分吸光系数单位为ml/(g·cm)与质量浓度相关。吸收强度判断ε值在10⁴~10⁵为强吸收，小于10²为弱吸收。吸收光谱04吸收光谱定义

定义溶液浓度、液层厚度一定时，以波长为横坐标，对应吸光度为纵坐标绘制的曲线关键参数及特征吸收光谱特性吸收光谱图形相似性同一物质不同浓度在相同条件下的吸收光谱图形相似，最大吸收波长相同定性分析和结构分析依据同一物质最大吸收波长相同，是定性分析和结构分析的依据2.紫外-可见分光光度法分析条件选择仪器测量条件选择01检测波长选择

最佳选择：最大吸收波长最大吸收波长（λmax）是定量分析的最佳工作波长，对光的吸收灵敏度最高，相对误差小；曲线平缓，吸光系数变化小，偏离吸收定律程度小。

干扰情况处理当最大吸收波长处存在干扰时，可选择另外的吸收峰或肩峰。例如，分析钴配合物时，最大吸收波长处受显色剂干扰，可选择肩峰作为工作波长。读数范围调整最佳范围：吸光度0.2~0.8为使浓度测量的相对误差较小，吸光度应保持在0.2~0.8的范围。调整方法吸光度过大时，应稀释溶液；吸光度过小时，应使用光程更大的比色皿。显色反应条件选择02显色反应理想条件

显色剂选择性好显色剂应具有良好的选择性，干扰少，以确保反应的特异性。

生成物摩尔吸光系数高生成物的摩尔吸光系数ε应大于或等于10⁴，以提高检测灵敏度。

颜色对比度大显色剂颜色与生成物颜色对比度要大，最大吸收波长之差应超过60nm。

生成物组成恒定稳定生成物的组成应恒定，性质稳定，以保证测定结果的可靠性。具体条件选择

显色剂用量控制根据显色反应的稳定性，显色剂用量需精准控制或可在一定范围内选择。

溶液酸度适宜考虑酸效应，选择适宜的pH值，以获得最佳显色效果。

显色时间确定通过绘制显色时间与吸光度曲线，确定吸光度稳定的合适时间。

溶剂选择选择有机溶剂以降低有色物质的解离度，提高灵敏度。比色皿配套要求

石英比色皿透光率石英比色皿在220nm处，透光率之差应控制在±0.5%以内。

玻璃比色皿透光率玻璃比色皿在440nm处，透光率之差应控制在±0.5%以内。参比溶液选择03选择依据吸光度加和性原理通过参比溶液消除背景吸收，确保吸光度测量准确性。消除背景吸收使用参比溶液来消除除待测离子外的其他背景吸收。常见参比溶液类型溶剂参比适用于仅含溶剂和试样的待测溶液，参比溶液为溶剂。试剂参比适用于含溶剂、其他试剂和显色剂的待测溶液，参比溶液为溶剂+其他试剂+显色剂。试样参比适用于基质复杂且干扰测定的待测溶液，参比溶液为溶剂+显色剂+去除待测离子的试样。平行操作参比适用于经过复杂前处理的待测溶液，参比溶液为进行同步前处理的空白液。3.紫外-可见分光光度法的应用定性分析方法01比较吸收光谱一致性吸收光谱特征对比对比吸收光谱的形状、肩峰、吸收峰数目、峰位和吸光系数。测定条件需保持一致，以确保数据的可比性。吸收光谱不一致吸收光谱不一致时，表明不是同一种化合物。吸收光谱相同需进一步分析吸收光谱相同，并不能完全确定是同一种化合物。比较吸收光谱特征数据最大吸收波长对比对比最大吸收波长及其对应的吸光系数。实例分析氟胞嘧啶片在286nm有最大吸收，在245nm有最小吸收。杂质检查方法供试品与标准光谱比较将供试品吸收光谱与标准吸收光谱进行比较。供试品与药典值比较将供试品吸收光谱与药典的值进行比较。杂质检定实例如甲醇中杂质苯的检定，乙醇在特定波长处吸光度的规定。定量分析方法02单组分溶液定量方法

吸光系数法操作：查手册得吸光系数，相同条件下测试样吸光度，按公式计算浓度。

标准对比法操作：配制标准溶液和试样溶液，在最大吸收波长处测吸光度，通过两式相除计算浓度。

标准曲线法原理：固定比色皿光程L，吸收定律为A=KC，以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线法测定步骤：

01

02

03

04配制标准系列：用标准物质配制一系列不少于5种不同浓度的标准溶液。测定标准系列的吸光度：选择合适的参比溶液，用最大吸收波长测定标准溶液吸光度绘制标准曲线：以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。确定供试品溶液浓度：按照相同实