平滑肌细胞内源性CSE-H₂S体系在腹主动脉瘤发病中的机制探究：从分子通路到病理进程

平滑肌细胞内源性CSE/H₂S体系在腹主动脉瘤发病中的机制探究：从分子通路到病理进程一、引言1.1研究背景与意义腹主动脉瘤（AbdominalAorticAneurysm，AAA）是一种严重威胁人类健康的血管疾病，其主要特征为腹主动脉局部异常扩张。当腹主动脉某段直径扩张至正常直径的1.5倍以上时，即可诊断为腹主动脉瘤。AAA的危害极大，一旦破裂，高速、高压的动脉血会迅速喷射入腹腔，短时间内患者就会大量失血，随即出现休克、大出血，死亡率高达85%-90%，因此被临床医生形象地称为“不定时炸弹”。近年来，AAA的发病率呈上升趋势。在我国，随着人口老龄化、饮食结构改变和检测手段的增多，AAA发病率有所增加。有数据称，我国腹主动脉瘤发病率为36.2/10万，《中国心血管健康与疾病报告2020概要》显示，中部地区40岁以上具有危险因素的人群中腹主动脉瘤的发病率为0.33％。在欧美国家，AAA同样是一个不容忽视的健康问题，在美国每年约有15000人死于腹主动脉瘤，占死因的第13位。目前认为AAA的致病原因较为复杂，动脉粥样硬化被视为最重要的病因，粥样斑块的进展会破坏血管内膜，并侵蚀动脉壁中层。此外，高血压、抽烟、创伤、年龄、性别、高脂血症或家族史等均是其常见危险因素。尽管对AAA的发病机制进行了大量研究，但目前其发病机制仍未完全明确，这也导致治疗药物相对匮乏。硫化氢（HydrogenSulfide，H₂S）作为一种新型气体信号分子，与一氧化碳、一氧化氮等气体分子一样，在生物体内参与了众多生理功能的调节。在心血管系统中，H₂S能调节血管张力，维持血管的正常舒张和收缩功能。研究表明，适量的H₂S可以抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，从而预防动脉粥样硬化等心血管疾病的发生。在生物体内，H₂S主要由胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionineγ-Lyase，CSE）催化合成，CSE在诸多生理和病理过程中扮演着不可或缺的角色，当CSE的活性异常改变时，会导致H₂S生成量的失衡，进而引发一系列病理变化。然而，CSE/H₂S体系在腹主动脉瘤发病机制中的作用尚未完全阐明。探究平滑肌细胞内源性CSE/H₂S在腹主动脉瘤发病中的机制，有助于深入理解AAA的发病过程，为AAA的防治提供新的理论依据和潜在的治疗靶点，具有重要的科学意义和临床应用价值。1.2研究目的本研究旨在深入探究平滑肌细胞内源性CSE/H₂S在腹主动脉瘤发病中的具体机制。通过细胞实验和动物实验，观察CSE/H₂S体系功能改变对平滑肌细胞生物学行为的影响，如增殖、迁移、凋亡以及细胞外基质代谢等。分析CSE/H₂S体系与腹主动脉瘤发病过程中关键信号通路的相互作用关系，明确其在腹主动脉瘤发病机制中的关键节点和调控网络。此外，研究还期望基于所揭示的机制，为腹主动脉瘤的防治提供新的理论依据和潜在的治疗靶点，为开发更加有效的治疗策略奠定基础，最终降低腹主动脉瘤的发病率和死亡率，改善患者的预后和生活质量。1.3国内外研究现状在腹主动脉瘤发病机制的研究方面，国内外学者已取得了诸多成果。动脉粥样硬化被公认为是腹主动脉瘤最重要的病因，其过程中粥样斑块的进展会破坏血管内膜，并侵蚀动脉壁中层。相关研究表明，动脉壁血管细胞外基质的损坏在腹主动脉瘤发病中扮演重要角色，基质金属蛋白酶家族（matrixmetalloproteinases，MMPs）参与其中，如在主动脉瘤病变区域，MMP的重要抑制酶TIM－P2含量降低。同时，腹主动脉瘤被证实为炎症性疾病，病变区域存在大量炎症细胞浸润，巨噬细胞、肥大细胞、各种T细胞等参与其中，巨噬细胞可分泌MMPs、ILs、TNFα等导致局部细胞外基质破坏；肥大细胞分泌组胺、蛋白酶等细胞因子，引发平滑肌细胞（SMCs）凋亡与细胞外基质损伤；T细胞则通过Fas－FasL途径使SMCs凋亡，不过Treg细胞可通过分泌IL－10发挥动脉保护作用，抑制腹主动脉瘤的进展。高血压是夹层腹主动脉瘤的重要危险因素，我国夹层主动脉瘤患者中具有高血压病史的比例大于80％，可能与高血压导致的血管壁长期代偿性变化相关，当超出代偿能力时，会引起动脉壁的损害。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）不仅可升高血压，还可通过强化SMCs的TGF－β信号通路，诱导其分泌大量MMP－9破坏细胞外基质，或刺激内皮细胞分泌内皮素并活化单核细胞的NF－κB细胞通路，进而调控SMCs的增殖并诱发动脉粥样斑块的形成。吸烟是腹主动脉瘤最重要的外界危险因素，吸烟人群罹患腹主动脉瘤的风险是不吸烟人群的四倍，烟草中的尼古丁经代谢生成的古丁素，可氧化α1抗胰蛋白酶（α1－AT）中的蛋氨酸，降低α1－AT对弹力蛋白酶的抑制作用，导致动脉壁中的弹力蛋白纤维降解。肥胖与腹主动脉瘤相关，脂肪细胞释放的瘦素和FABP4可诱导IL－18、IL－18r和NCC的表达，IL－18通过后两者参与腹主动脉瘤的形成。家族史也是腹主动脉瘤的危险因素之一，虽已发现多个基因突变可能与腹主动脉瘤相关，但这些基因突变在不同家系的患者中不具共同性，遗传因素在腹主动脉瘤发生发展中的作用尚未明确。在CSE/H₂S体系与疾病关联的研究中，国外研究人员较早关注到CSE在心血管系统疾病中的作用，并针对其抑制剂展开探索，发现某些小分子化合物能够抑制CSE活性，减少H₂S生成，在高血压动物模型中，使用这些抑制剂后，血压得到一定控制，血管平滑肌的异常增殖也得到缓解，表明CSE抑制剂在心血管疾病治疗中具有潜在应用价值。国内研究发现，在非酒精性脂肪性肝病中，肝脏CSE缺乏会促进疾病发生发展，CSE/H₂S系统可促进法尼醇X受体(FXR)蛋白DBD区锌指结构Cys138/141位点发生巯基化修饰，促进FXR对肝细胞糖代谢、脂质代谢相关靶基因调控，减轻肝细胞内脂质蓄积，对非酒精性脂肪肝起保护作用。在肺动脉高压研究中，首次揭示H₂S通过过硫化修饰内皮素A型受体（ETAR）蛋白第69位半胱氨酸巯基基团，抑制肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖，从而抑制肺动脉高压。在主动脉瘤/夹层研究中，发现较高血浆H₂S与较低夹层发生风险相关，内皮细胞CSE/H₂S系统功能障碍通过降低PDI第343和400位点的巯基硫化修饰，诱导内质网应激和内皮损伤，促进主动脉瘤/夹层的发生，同时发现HDAC1-ZEB2-NuRD复合物调控CSE表达的新机制，以及H₂S供体GYY4137和HDAC1抑制剂恩替诺特对主动脉瘤/夹层的防治作用。然而，当前研究仍存在不足。在腹主动脉瘤发病机制方面，虽然已明确多种危险因素和相关病理过程，但各因素之间的相互作用及具体分子调控网络尚未完全阐明。对于CSE/H₂S体系在腹主动脉瘤发病中的作用研究较少，平滑肌细胞内源性CSE/H₂S如何参与腹主动脉瘤发病过程，以及其与其他已知发病机制之间的关联尚不明确，亟待进一步深入探究。二、腹主动脉瘤概述2.1定义与分类腹主动脉瘤是一种较为常见的血管疾病，当腹主动脉的某一段因各种原因导致其直径扩张至正常直径的1.5倍以上时，即可被定义为腹主动脉瘤。正常情况下，腹主动脉的直径会因个体差异、性别、年龄、种族以及体表面积等因素而有所不同。一般来说，成年男性的腹主动脉直径平均值略大于女性，且随着年龄的增长，腹主动脉直径也会有一定程度的增加。腹主动脉瘤按照形态学可分为囊状动脉瘤和梭状动脉瘤。囊状动脉瘤通常表现为动脉壁的一侧向外呈囊袋状突出，瘤体与正常动脉壁的连接较为狭窄，其形态犹如一个挂在动脉上的小口袋。这种类型的动脉瘤在腹主动脉瘤中相对较为常见，其形成可能与局部动脉壁的结构薄弱以及血流动力学异常有关。梭状动脉瘤则呈现为动脉壁均匀性地向四周扩张，瘤体的形状类似梭子，两端逐渐过渡到正常的动脉管径。梭状动脉瘤的发生往往与动脉粥样硬化等全身性疾病导致的动脉壁广泛受损有关，其病变范围相对较大，对动脉整体结构和功能的影响也更为显著。依据病因，腹主动脉瘤又可分为动脉粥样硬化性动脉瘤、非动脉粥样硬化性动脉瘤和创伤性动脉瘤等。动脉粥样硬化性动脉瘤是最为常见的类型，其发病机制主要与动脉粥样硬化密切相关。随着年龄的增长，尤其是在高血压、高血脂、吸烟等危险因素的长期作用下，血液中的脂质会逐渐在腹主动脉内膜下沉积，形成粥样斑块。这些斑块会不断进展，导致动脉内膜增厚、变硬，弹性下降，进而使得动脉壁的中层结构受到破坏，在血流的冲击下，局部动脉壁逐渐向外扩张，最终形成动脉瘤。非动脉粥样硬化性动脉瘤的病因较为复杂，其中一些与遗传性疾病相关，如马凡综合征，这是一种常染色体显性遗传性结缔组织疾病，由于编码原纤维蛋白-1的基因突变，导致患者的结缔组织异常，主动脉中层弹力纤维减少、断裂，使得主动脉壁的强度降低，容易引发腹主动脉瘤。此外，某些感染性因素，如梅毒螺旋体感染引起的梅毒性主动脉炎，也可能破坏动脉壁结构，引发动脉瘤。创伤性动脉瘤则是由于腹部受到直接或间接的外力创伤，如车祸、高处坠落、暴力撞击等，导致腹主动脉壁破裂。如果破裂处被周围的软组织包裹，形成一个与动脉腔相通的血肿，随着时间的推移，血肿机化，就会形成创伤性腹主动脉瘤。这种类型的动脉瘤在发病时间和临床表现上与其他类型有所不同，通常有明确的外伤史，且发病较为突然。2.2流行病学特征腹主动脉瘤的发病率在全球范围内呈上升趋势，已成为严重威胁人类健康的重要疾病之一。在欧美国家，AAA的发病率相对较高。有研究表明，在65岁以上的人群中，AAA的发病率约为5%-10%，且男性发病率明显高于女性，男性患者约为女性患者的3-8倍。美国的一项大规模流行病学调查显示，每年新增AAA患者约有10万人，每年因AAA死亡的人数超过1.5万人，在死因顺位中位居第13位。在欧洲，AAA同样是一个不容忽视的健康问题，部分国家的AAA发病率甚至高达10%以上。在我国，虽然缺乏大规模的全国性流行病学调查数据，但从部分地区的研究结果来看，AAA的发病率也呈上升态势。随着人口老龄化的加剧、生活方式的改变以及高血压、高血脂等危险因素的增加，AAA的发病风险逐渐提高。有学者对我国某地区的老年人群进行筛查后发现，AAA的患病率约为3%-5%。而且，AAA的发病与年龄密切相关，随着年龄的增长，发病率显著上升，70岁以上的老年人群是AAA的高发群体。在性别差异方面，与欧美国家相似，我国男性AAA的发病率也明显高于女性，这可能与男性吸烟、饮酒等不良生活习惯更为普遍，以及雄激素对血管壁的影响等因素有关。不同种族之间，AAA的发病率也存在差异。白人的AAA发病率相对较高，而亚裔和西班牙裔人群的发病率较低。例如，有研究对比了白人、亚裔和西班牙裔人群的AAA发病情况，发现白人的AAA患病率为8.1%，而亚裔和西班牙裔人群的患病率均小于3.0%。这种种族差异可能与遗传因素、生活环境以及饮食习惯等多种因素有关。在地域分布上，AAA的发病率也有所不同。欧美地区的发病率普遍高于亚非地区。据报道，美洲国家的AAA发病率为1.4%-2.3%，欧洲国家为4.0%-4.9%，澳洲为4.0%-7.2%，而我国香港地区报道的发病率为0.14%。这种地域差异可能与不同地区的经济发展水平、医疗条件、生活方式以及环境因素等有关。在经济发达地区，人们的生活水平较高，饮食结构中高脂肪、高胆固醇食物摄入较多，同时运动量相对较少，这些因素都可能增加AAA的发病风险。此外，医疗条件的差异也会影响AAA的早期诊断和治疗，进而影响其发病率和死亡率。AAA的发病还与多种危险因素密切相关。吸烟是AAA最重要的危险因素之一，约80%的AAA患者有吸烟史。研究表明，相对于不吸烟者，现在仍吸烟者患AAA的风险为3-6倍，曾经吸烟者的患病风险为1-2倍。吸烟会导致血管内皮细胞损伤，促进动脉粥样硬化的发生发展，进而增加AAA的发病风险。动脉粥样硬化也是AAA的重要病因，动脉粥样硬化斑块的形成会破坏血管内膜，使动脉壁的弹性降低，在血流的冲击下，容易形成动脉瘤。高血压会增加血管壁的压力，长期的高血压状态可导致血管壁结构受损，促进AAA的发生和发展。有研究指出，高血压患者患AAA的风险是血压正常者的2-3倍。家族史也是AAA的一个重要危险因素，先证者一级亲属的患病风险为一般人群的2-5倍。遗传因素在AAA的发病中起着重要作用，目前已发现多个与AAA相关的基因突变，但这些基因突变在不同家系的患者中不具共同性，遗传因素在AAA发生发展中的具体作用机制尚未完全明确。此外，高血脂、肥胖、慢性阻塞性肺疾病等因素也与AAA的发病存在一定关联。2.3病理特征与临床表现腹主动脉瘤的病理变化主要集中在血管壁结构的改变。正常的腹主动脉壁由内膜、中膜和外膜三层结构组成，各层协同维持血管的正常形态和功能。在腹主动脉瘤形成过程中，动脉粥样硬化起着关键作用。动脉粥样硬化斑块的形成会导致内膜增厚，这些斑块主要由脂质、胆固醇结晶、纤维组织以及炎性细胞等组成。随着斑块的不断进展，其会逐渐侵蚀动脉壁中层，使中层的平滑肌细胞和弹性纤维受损、减少。研究表明，在腹主动脉瘤患者的病变血管组织中，中层弹性纤维的含量明显低于正常血管，这使得血管壁的弹性和强度显著下降。此外，炎症反应在腹主动脉瘤的病理过程中也扮演着重要角色，病变区域会有大量炎症细胞浸润，如巨噬细胞、T淋巴细胞等。巨噬细胞可分泌多种细胞因子和蛋白酶，其中基质金属蛋白酶（MMPs）能降解细胞外基质成分，包括胶原蛋白和弹性蛋白，进一步破坏血管壁的结构。正常情况下，血管壁中存在着MMPs的抑制剂，如组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs），以维持细胞外基质的合成与降解平衡。然而，在腹主动脉瘤中，MMPs的活性升高，而TIMPs的表达相对不足，导致这种平衡被打破，细胞外基质过度降解，血管壁变薄、扩张。在腹主动脉瘤的早期阶段，由于瘤体较小且未对周围组织造成明显压迫，大多数患者通常没有明显的症状。这使得许多患者在疾病初期难以察觉，往往是在进行其他疾病的检查或体检时偶然发现。随着瘤体的逐渐增大，部分患者可能会出现一些非特异性症状，如腹部隐痛、胀痛或不适感。这种疼痛通常较为轻微，容易被患者忽视或误认为是胃肠道等其他疾病引起的症状。当瘤体进一步增大，压迫周围组织和器官时，就会出现相应的压迫症状。如果瘤体压迫胃肠道，患者可能会出现腹胀、消化不良、恶心、呕吐等消化系统症状。压迫输尿管时，可导致输尿管梗阻，引起肾盂积水，患者会出现腰部疼痛、血尿等泌尿系统症状。若压迫下腔静脉，会阻碍下肢静脉血液回流，导致下肢水肿。腹主动脉瘤最危险的情况是破裂，这是导致患者死亡的主要原因。一旦瘤体破裂，高速、高压的动脉血会迅速喷射入腹腔或腹膜后间隙，短时间内患者就会大量失血。患者会突然出现剧烈的腹痛或腰背部疼痛，这种疼痛通常难以忍受，常伴有大汗淋漓、面色苍白、心慌、头晕等症状。随着出血量的增加，患者会迅速进入失血性休克状态，表现为血压急剧下降、心率加快、意识模糊甚至昏迷。如果不及时进行救治，患者往往会在短时间内死亡。据统计，腹主动脉瘤破裂后的死亡率高达85%-90%，即使患者能够及时被送至医院接受治疗，手术的难度和风险也非常大，术后的并发症发生率和死亡率仍然较高。此外，瘤腔内还可能形成血栓，当血栓脱落时，可随血流进入腹主动脉的分支血管，导致动脉栓塞。如果栓塞发生在肠系膜动脉，会引起肠道缺血、坏死，患者出现剧烈腹痛、呕吐、血便等症状。若栓塞发生在下肢动脉，会导致下肢缺血，出现下肢疼痛、麻木、发凉、皮肤苍白等症状，严重时可导致肢体坏死。三、平滑肌细胞与腹主动脉瘤的关系3.1平滑肌细胞在血管中的正常生理功能平滑肌细胞是构成血管壁中膜的主要细胞成分，在维持血管的正常结构和功能方面发挥着举足轻重的作用。从结构角度来看，平滑肌细胞呈长梭形，它们紧密排列在血管中膜，与周围的细胞外基质相互交织，共同构成了一个坚韧且富有弹性的结构框架。细胞内富含肌丝，这些肌丝是平滑肌细胞实现收缩功能的关键结构基础。此外，平滑肌细胞还含有丰富的线粒体，为细胞的各种生理活动提供充足的能量。粗面内质网和高尔基体则参与蛋白质的合成与加工，确保细胞能够合成并分泌维持血管正常结构和功能所需的各种物质，如胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质成分。在调节血管张力方面，平滑肌细胞起着核心作用。血管张力的稳定对于维持正常的血压和血液循环至关重要。平滑肌细胞通过自身的收缩和舒张来调节血管的口径，进而改变血管阻力和血流量。当机体处于应激状态或需要调节局部组织的血液供应时，平滑肌细胞会迅速做出反应。例如，在运动时，为了满足肌肉组织对氧气和营养物质的需求增加，供应肌肉的血管平滑肌细胞会舒张，使血管口径增大，血流量增加。相反，在血压升高时，血管平滑肌细胞会收缩，减小血管口径，增加血管阻力，从而降低血压。这种精确的调节机制主要依赖于一系列复杂的信号传导通路。神经递质、激素等信号分子与平滑肌细胞表面的相应受体结合，激活细胞内的信号转导途径。以去甲肾上腺素为例，它作为一种重要的神经递质，与平滑肌细胞上的α1肾上腺素受体结合后，通过激活蛋白激酶C（PKC）通路，促使肌球蛋白轻链激酶（MLCK）磷酸化并激活。激活的MLCK进一步催化肌球蛋白轻链磷酸化，使得肌球蛋白与肌动蛋白结合，形成肌动蛋白-肌球蛋白复合物，引发平滑肌细胞收缩。而当乙酰胆碱与平滑肌细胞上的M3胆碱受体结合时，会激活磷脂酶C（PLC）通路，使细胞内钙离子浓度降低，导致平滑肌细胞舒张。平滑肌细胞还参与了血管的重塑过程。在生理状态下，血管会根据机体的生长发育、代谢需求以及血流动力学的变化进行适应性的重塑。平滑肌细胞在这个过程中能够合成和分泌多种细胞外基质成分，如胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖等。这些成分相互交织，形成了一个复杂的网络结构，赋予血管壁坚韧的力学性能和良好的弹性。同时，平滑肌细胞还可以通过调节自身的增殖、迁移和凋亡等生物学行为，参与血管壁的结构调整和修复。在血管受到轻微损伤时，平滑肌细胞会从收缩型表型转变为合成型表型，增殖并迁移到损伤部位，合成新的细胞外基质，促进血管的修复和重塑。3.2平滑肌细胞在腹主动脉瘤发病中的异常变化在腹主动脉瘤的发病过程中，平滑肌细胞会发生一系列显著的异常变化，这些变化对血管壁的结构和功能产生了深远的影响。平滑肌细胞的表型转换是腹主动脉瘤发病中的关键病理变化之一。在正常生理状态下，血管平滑肌细胞主要以收缩型表型存在，其特征是表达高水平的收缩蛋白，如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结蛋白（desmin）以及特定的肌球蛋白重链亚型（SM1和SM2）。收缩型平滑肌细胞具有发达的肌丝结构，富含线粒体等细胞器，能够有效地执行收缩功能，维持血管的正常张力和形态。然而，在腹主动脉瘤形成过程中，受到多种因素的刺激，平滑肌细胞会从收缩型表型向合成型表型转换。合成型平滑肌细胞的收缩蛋白表达显著降低，而与细胞增殖、迁移和合成细胞外基质相关的基因和蛋白表达上调。研究发现，在腹主动脉瘤组织中，α-SMA、SM1和SM2的表达明显低于正常血管组织，而合成型表型标志物，如胚胎型肌球蛋白重链（SMemb）的表达则显著升高。这种表型转换使得平滑肌细胞的收缩能力下降，无法有效地维持血管壁的张力。同时，合成型平滑肌细胞的增殖和迁移能力增强，它们会迁移到血管内膜下，增殖并合成大量细胞外基质，导致血管壁增厚、变硬，进一步破坏血管的正常结构和功能。平滑肌细胞的凋亡在腹主动脉瘤发病中也起着重要作用。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，在维持组织稳态和正常生理功能中具有重要意义。然而，在腹主动脉瘤患者的血管组织中，平滑肌细胞的凋亡明显增加。通过原位DNA末端标记（TUNEL）技术检测发现，腹主动脉瘤组织中平滑肌细胞的凋亡指数显著高于正常腹主动脉组织。平滑肌细胞凋亡的增加导致血管壁中平滑肌细胞数量减少，破坏了血管壁的正常结构。平滑肌细胞是血管壁中主要的结构和功能细胞，其数量的减少使得血管壁的强度和弹性下降，无法承受血流的冲击，从而促进腹主动脉瘤的发展。多种因素可诱导平滑肌细胞凋亡，炎症细胞分泌的细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等，能够激活细胞内的凋亡信号通路，导致平滑肌细胞凋亡。氧化应激产生的大量活性氧（ROS）也可损伤平滑肌细胞的DNA和线粒体等细胞器，引发细胞凋亡。除了表型转换和凋亡，平滑肌细胞的增殖异常也与腹主动脉瘤的发病密切相关。在腹主动脉瘤形成的早期阶段，平滑肌细胞可能会出现短暂的增殖现象。这是机体对血管损伤的一种代偿性反应，试图通过平滑肌细胞的增殖来修复受损的血管壁。然而，这种增殖反应往往是失控的，平滑肌细胞过度增殖，导致血管壁结构紊乱。随着疾病的进展，平滑肌细胞的增殖能力逐渐下降，而凋亡增加，使得血管壁中平滑肌细胞的数量进一步减少。平滑肌细胞增殖异常与多种信号通路的失调有关，血小板衍生生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等生长因子及其受体的异常激活，可促进平滑肌细胞的增殖。而一些抑癌基因的表达下调，如p53基因，也会导致平滑肌细胞的增殖失控。平滑肌细胞的这些异常变化相互作用，共同促进了腹主动脉瘤的发生和发展。表型转换使得平滑肌细胞从维持血管张力的收缩型转变为具有增殖和迁移能力的合成型，为平滑肌细胞的异常增殖和迁移提供了条件。而平滑肌细胞的过度增殖和迁移又进一步破坏了血管壁的结构，增加了细胞凋亡的风险。平滑肌细胞凋亡导致血管壁中平滑肌细胞数量减少，使得血管壁的强度和弹性下降，无法承受血流的冲击，从而促进腹主动脉瘤的扩张。3.3相关研究案例分析国内外诸多研究案例为深入理解平滑肌细胞功能异常如何导致腹主动脉瘤发生发展提供了丰富的证据。吴建秋和景在平选取豚鼠—大鼠异种移植腹主动脉瘤模型，利用平滑肌细胞α2肌动蛋白、增殖细胞核抗原抗体免疫组织化学检测和原位末端DNA标记法，动态观测术后1-4周相关指标。结果显示，1-2周移植腹主动脉直径中度扩张，细胞增殖指数大于细胞凋亡指数；3-4周移植物显著扩张，细胞凋亡指数大于细胞增殖指数，且移植组血管平滑肌细胞凋亡与移植动脉直径呈现显著正相关。该研究清晰地表明，细胞增殖和凋亡贯穿于腹主动脉损伤重构的全过程，两者平衡失调是导致腹主动脉瘤形成和发展的重要因素。在腹主动脉瘤形成的早期，平滑肌细胞的增殖本是机体对血管损伤的一种代偿反应，但这种增殖未能持续有效维持血管壁结构，随着病情发展，凋亡逐渐占据主导，使得血管壁中平滑肌细胞数量减少，无法维持正常的血管壁强度和弹性，最终促进了腹主动脉瘤的发展。张健等人对25例腹主动脉瘤（AAA）和10例正常腹主动脉组织进行研究，采用原位DNA末端标记（TUNEL）技术联合抗-CD3、抗-CD20、抗-CD68及抗α-actin的免疫组化染色。研究发现，AAA中层平滑肌细胞数量为（38±8）SMC/HPF，较正常腹主动脉的（179±16）SMC/HPF减少79.1%，P＜0.01；正常腹主动脉TUNEL阳性细胞约为1.0%，AAA组织中则为8.6%，P＜0.01，且免疫组化染色显示这些凋亡细胞多为平滑肌细胞。这一研究直接证实了AAA中层平滑肌细胞的凋亡是平滑肌细胞数量减少的重要原因。平滑肌细胞数量的大幅减少，破坏了血管壁的正常结构和功能，使其难以承受血流的冲击，从而推动了腹主动脉瘤的发展。北京大学郑乐民团队在小鼠的血管平滑肌细胞（VSMC）中特异性敲除胃泌素蛋白D（GSDMD），并观察血管紧张素II诱导的AAA模型。结果显示，GSDMD的缺失改善了AAA的发生与发展，同时促进VSMC向收缩型表型转换。通过非靶向代谢组学分析发现，VSMC特异性GSDMD敲除小鼠的血浆和主动脉组织中的腐胺显著减少。进一步研究表明，高腐胺水平触发了VSMC的促炎表型，并增加了小鼠对血管紧张素II诱导的AAA形成的易感性，而腐胺生成酶ODC1的过表达可促进AAA的发生，用ODC1抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）治疗可减少血管紧张素II诱导的AAA形成。从机制上讲，GSDMD增强了PERK-eIF-2α通路，进而增强了内质网应激-C/EBP同源蛋白(CHOP)信号，最后促进了腐胺生成酶ODC1的合成，而腐胺通过上调C/EBPβ和NF-κB转录因子的含量及磷酸化水平，促进了平滑肌细胞向合成型转化，在主动脉中促进了AAA的发生发展。该研究从分子机制层面揭示了平滑肌细胞相关因素对腹主动脉瘤的影响，即平滑肌细胞中GSDMD通过影响腐胺合成，调控平滑肌细胞表型转化和炎症反应，最终影响腹主动脉瘤的发生发展。四、CSE/H₂S体系概述4.1CSE的生物学特性与功能胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）是一种在生物体内具有关键作用的酶，其生物学特性与功能对维持机体正常生理状态至关重要。CSE的基因结构较为复杂，人类CSE基因位于第1号染色体短臂（1p36.11）上，包含11个外显子和10个内含子。通过对CSE基因序列的分析发现，其启动子区域存在多个转录因子结合位点，如Sp1、AP-1等，这些转录因子可通过与启动子区域结合，调控CSE基因的转录水平。在蛋白质结构方面，CSE是一种磷酸吡哆醛-5'-磷酸（PLP）依赖性酶，其相对分子质量约为63kDa。CSE蛋白由多个结构域组成，其中催化结构域负责与底物L-胱硫醚结合，并在PLP的参与下催化其分解。研究表明，CSE蛋白的催化活性中心含有半胱氨酸残基，这些残基对于维持酶的催化活性至关重要。当半胱氨酸残基发生氧化或修饰时，CSE的活性会受到显著影响。CSE在体内的分布具有明显的组织特异性。在心血管系统中，CSE主要表达于血管平滑肌细胞和心肌细胞。免疫组化研究显示，在主动脉、冠状动脉等血管组织中，CSE蛋白呈阳性表达，且在血管平滑肌细胞中的表达水平较高。在肝脏中，CSE也有一定程度的表达，参与肝脏的代谢过程。而在神经系统中，CSE的表达相对较低，但在某些特定的神经元群体中仍可检测到其存在。这种组织特异性分布使得CSE能够在不同组织中发挥独特的生理功能。CSE的主要功能是催化L-胱硫醚分解，生成L-半胱氨酸、α-酮丁酸和H₂S。这一过程在生物体内的H₂S生成中起着关键作用。H₂S作为一种新型气体信号分子，参与了众多生理功能的调节。在心血管系统中，CSE催化生成的H₂S能够调节血管张力。当血管平滑肌细胞受到刺激时，CSE活性增强，H₂S生成增加，H₂S可作用于血管平滑肌细胞上的钾离子通道，使钾离子外流增加，细胞膜超极化，从而导致血管平滑肌舒张，血管扩张。研究表明，给予CSE抑制剂后，血管组织中H₂S生成减少，血管张力升高，提示CSE-H₂S体系在维持血管正常舒张功能中具有重要作用。在细胞增殖和凋亡方面，CSE-H₂S体系也发挥着重要调节作用。在血管平滑肌细胞中，适量的H₂S可以抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。体外细胞实验表明，用H₂S供体处理血管平滑肌细胞后，细胞增殖相关蛋白PCNA的表达降低，细胞周期相关蛋白cyclinD1的表达也受到抑制，同时细胞凋亡相关蛋白Bax的表达增加，Bcl-2的表达减少，表明H₂S能够通过调节细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达，抑制血管平滑肌细胞的增殖，促进其凋亡。这一调节作用对于维持血管壁细胞的稳态具有重要意义，可防止血管平滑肌细胞过度增殖导致的血管壁增厚和狭窄。CSE还参与了氧化应激和炎症反应的调节。在氧化应激条件下，细胞内活性氧（ROS）水平升高，会对细胞造成损伤。CSE生成的H₂S具有抗氧化作用，可通过清除ROS，减轻氧化应激对细胞的损伤。研究发现，在心肌缺血再灌注损伤模型中，给予CSE激活剂，可增加心肌组织中H₂S含量，降低ROS水平，减少心肌细胞凋亡，改善心脏功能。在炎症反应中，CSE-H₂S体系可抑制炎症细胞的活化和炎症因子的释放。在脂多糖（LPS）诱导的炎症模型中，H₂S能够抑制巨噬细胞中NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子TNF-α、IL-6等的表达和释放，从而减轻炎症反应。4.2H₂S的生理功能与信号转导途径H₂S在心血管系统中展现出多方面的生理功能，对维持心血管系统的稳态起着关键作用。在血管舒张方面，H₂S是一种重要的血管舒张因子。大量研究表明，它能够直接作用于血管平滑肌细胞，调节血管张力。其作用机制主要与钾离子通道和氯离子/碳酸氢根离子交换体有关。H₂S可以激活血管平滑肌细胞膜上的ATP敏感性钾离子通道（KATP通道），使钾离子外流增加，细胞膜超极化。细胞膜的超极化状态使得电压依赖性钙离子通道难以开放，细胞外钙离子内流减少，导致血管平滑肌细胞内钙离子浓度降低。而钙离子是平滑肌细胞收缩的关键信号分子，其浓度降低会使得平滑肌细胞的收缩能力减弱，从而实现血管舒张。在一项动物实验中，给实验动物注射H₂S供体后，观察到其动脉血压明显下降，血管内径增大，进一步证实了H₂S的血管舒张作用。研究还发现，H₂S可以通过调节氯离子/碳酸氢根离子交换体，影响细胞内的酸碱平衡，进而影响血管平滑肌的舒张功能。当H₂S作用于血管平滑肌细胞时，会促进氯离子外流和碳酸氢根离子内流，使细胞内pH值升高，这种细胞内环境的改变有助于血管平滑肌的舒张。在抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移方面，H₂S同样发挥着重要作用。血管平滑肌细胞的过度增殖和迁移是动脉粥样硬化等心血管疾病发生发展的重要病理基础。H₂S可以通过多种途径抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。H₂S能够调节细胞周期相关蛋白的表达。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）在细胞周期的G1期向S期转换过程中起着关键作用，它的表达上调会促进细胞增殖。而H₂S可以抑制CyclinD1的表达，使细胞周期停滞在G1期，从而抑制血管平滑肌细胞的增殖。H₂S还可以通过调节细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路来影响血管平滑肌细胞的增殖和迁移。ERK信号通路的激活会促进细胞增殖和迁移，而H₂S可以抑制ERK的磷酸化，使其活性降低，进而抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。在体外细胞实验中，用H₂S供体处理血管平滑肌细胞后，发现细胞的增殖活性明显降低，迁移能力也受到显著抑制，细胞中CyclinD1的表达减少，ERK的磷酸化水平降低。H₂S还参与了心肌功能的调节。在心肌细胞中，H₂S可以调节心肌的收缩力和心率。研究表明，H₂S能够作用于心肌细胞膜上的离子通道，如L型钙离子通道和钾离子通道，影响心肌细胞的电生理特性，从而调节心肌的收缩和舒张功能。适量的H₂S可以增强心肌的收缩力，改善心脏的泵血功能。当心肌缺血再灌注损伤发生时，心肌组织中H₂S的生成会减少，导致心肌细胞的损伤加重。而外源性给予H₂S可以减轻心肌缺血再灌注损伤，保护心肌细胞。其机制可能与H₂S的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用有关。H₂S可以清除心肌细胞内的活性氧（ROS），减少氧化应激对心肌细胞的损伤。H₂S还可以抑制炎症因子的释放，减轻炎症反应对心肌细胞的损害。H₂S能够抑制心肌细胞的凋亡，减少心肌细胞的死亡，从而保护心脏功能。H₂S参与心血管系统调节的信号转导途径较为复杂，涉及多个信号分子和通路。除了上述提到的KATP通道、ERK信号通路等，H₂S还可以通过调节蛋白激酶G（PKG）信号通路来发挥作用。一氧化氮（NO）是一种重要的血管舒张因子，它可以激活鸟苷酸环化酶（GC），使细胞内cGMP水平升高，进而激活PKG。PKG的激活会导致血管平滑肌舒张。研究发现，H₂S可以与NO相互作用，协同调节血管张力。H₂S可以通过增加细胞内cGMP水平，激活PKG，从而发挥血管舒张作用。H₂S还可以通过调节其他信号分子，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路等，参与心血管系统的生理和病理过程。PI3K/Akt信号通路在细胞存活、增殖和抗凋亡等方面发挥着重要作用，H₂S可以激活PI3K/Akt信号通路，促进血管平滑肌细胞的存活和抗凋亡。而NF-κB信号通路在炎症反应中起着关键作用，H₂S可以抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子的释放，减轻炎症反应对心血管系统的损害。4.3平滑肌细胞内CSE/H₂S体系的特点在平滑肌细胞中，CSE的表达呈现出一定的特异性。免疫组化和蛋白质印迹实验表明，CSE蛋白在血管平滑肌细胞中呈高表达状态。通过对不同血管部位的平滑肌细胞检测发现，主动脉平滑肌细胞中CSE的表达水平相对较高，而小动脉平滑肌细胞中的表达水平略低。在细胞内的定位方面，CSE主要分布于平滑肌细胞的细胞质中，与其他参与细胞代谢和信号传导的蛋白相互作用。利用免疫荧光技术对平滑肌细胞进行染色观察，可清晰看到CSE在细胞质中呈现出均匀分布的状态，且与线粒体、内质网等细胞器存在一定程度的共定位现象，这暗示着CSE可能与这些细胞器的功能密切相关。平滑肌细胞内CSE的活性也具有独特之处。CSE的活性受到多种因素的调节，其中底物浓度、辅酶水平以及细胞内的氧化还原状态等对其活性影响较大。当细胞内L-胱硫醚的浓度增加时，CSE的活性会相应增强，从而促进H₂S的生成。研究表明，在体外培养的平滑肌细胞中，向培养基中添加适量的L-胱硫醚，细胞内H₂S的含量会显著上升，说明底物浓度对CSE活性的正向调节作用。辅酶磷酸吡哆醛-5'-磷酸（PLP）是CSE发挥催化作用所必需的，当细胞内PLP水平降低时，CSE的活性会受到抑制。通过干扰细胞内PLP的合成或摄取，可观察到平滑肌细胞中CSE活性下降，H₂S生成减少。细胞内的氧化还原状态也会影响CSE的活性，氧化应激条件下，细胞内活性氧（ROS）水平升高，可导致CSE蛋白中的半胱氨酸残基发生氧化修饰，从而降低CSE的活性。在过氧化氢处理的平滑肌细胞中，CSE的活性明显降低，H₂S生成减少，而给予抗氧化剂后，CSE活性和H₂S生成量有所恢复。与其他细胞类型相比，平滑肌细胞内CSE/H₂S体系存在明显差异。在血管内皮细胞中，虽然也存在CSE的表达，但表达水平相对较低。通过对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中CSEmRNA和蛋白表达水平的定量分析发现，内皮细胞中CSE的表达量仅为平滑肌细胞的1/3-1/2。这使得内皮细胞内H₂S的生成量也相对较少。在生理功能方面，平滑肌细胞内CSE/H₂S体系主要参与血管张力的调节、平滑肌细胞的增殖和迁移等过程。而内皮细胞中H₂S的功能更多地与血管内皮的完整性、抗血栓形成以及调节血管内皮细胞与血液中细胞成分的相互作用有关。在肝脏细胞中，CSE的表达模式和功能也与平滑肌细胞不同。肝脏细胞中CSE参与肝脏的代谢过程，如参与蛋氨酸代谢循环，调节肝脏内的氧化还原状态等。而平滑肌细胞内CSE/H₂S体系主要关注对血管功能的调节。这些差异表明，CSE/H₂S体系在不同细胞类型中具有特异性的表达和功能，以适应各细胞类型的生理需求。五、平滑肌细胞内源性CSE/H₂S在腹主动脉瘤发病中的作用机制5.1对血管壁细胞外基质代谢的影响在正常生理状态下，血管壁细胞外基质（ECM）的合成与降解保持着精细的平衡，这对于维持血管壁的结构完整性和正常功能至关重要。平滑肌细胞在其中发挥着关键作用，它们能够合成和分泌多种细胞外基质成分，如胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖等。这些成分相互交织，形成了一个坚韧且富有弹性的网络结构，赋予血管壁良好的力学性能，使其能够承受血流的冲击。正常血管壁中存在着一系列的酶和调节因子，它们共同维持着ECM代谢的平衡。基质金属蛋白酶（MMPs）家族在ECM降解过程中扮演着重要角色，而组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）则可以抑制MMPs的活性，防止ECM过度降解。在腹主动脉瘤发病过程中，这一平衡被打破，导致血管壁结构受损。平滑肌细胞内源性CSE/H₂S体系对血管壁细胞外基质代谢有着重要的调节作用。研究表明，CSE/H₂S体系能够影响MMPs和TIMPs的表达与活性。在体外实验中，给予血管平滑肌细胞H₂S供体处理后，发现MMP-2和MMP-9的表达和活性显著降低。MMP-2和MMP-9是两种重要的基质金属蛋白酶，它们能够降解胶原蛋白和弹性蛋白等细胞外基质成分。H₂S通过抑制MMP-2和MMP-9的表达和活性，减少了细胞外基质的降解，从而有助于维持血管壁的结构稳定性。进一步的研究发现，H₂S可以通过调节相关信号通路来实现对MMPs的调控。H₂S能够抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活。在血管平滑肌细胞受到刺激时，MAPK信号通路会被激活，进而促进MMP-2和MMP-9的表达和活性。而H₂S可以抑制MAPK信号通路中关键激酶的磷酸化，使其活性降低，从而减少MMP-2和MMP-9的表达和分泌。H₂S还可以通过调节转录因子的活性来影响MMPs的表达。核因子κB（NF-κB）是一种重要的转录因子，它可以调控MMP-2和MMP-9等基因的转录。H₂S能够抑制NF-κB的活化，减少其与MMPs基因启动子区域的结合，从而降低MMPs的表达水平。CSE/H₂S体系对TIMPs的表达也有调节作用。研究发现，H₂S供体处理血管平滑肌细胞后，TIMPs的表达水平升高。TIMPs可以与MMPs结合，形成复合物，从而抑制MMPs的活性。H₂S通过促进TIMPs的表达，增强了对MMPs的抑制作用，进一步维持了细胞外基质代谢的平衡。在体内实验中，通过构建CSE基因敲除小鼠模型，发现小鼠血管壁中MMP-2和MMP-9的活性明显升高，而TIMPs的表达降低，导致细胞外基质降解增加，血管壁结构受损。给予这些小鼠H₂S供体干预后，MMP-2和MMP-9的活性得到抑制，TIMPs的表达升高，血管壁的结构和功能得到一定程度的改善。细胞外基质的异常代谢会导致血管壁强度下降，这是腹主动脉瘤发生发展的重要病理基础。当细胞外基质中的胶原蛋白和弹性蛋白等成分被过度降解时，血管壁的弹性和韧性降低，无法承受血流的冲击。在长期的血流压力作用下，血管壁逐渐扩张，形成动脉瘤。胶原蛋白是血管壁中重要的结构蛋白，它赋予血管壁一定的强度和韧性。弹性蛋白则使血管壁具有良好的弹性，能够在心脏收缩和舒张时发生相应的扩张和回缩。当这些成分减少时，血管壁的力学性能发生改变，容易出现局部扩张和变形。研究表明，在腹主动脉瘤患者的血管组织中，胶原蛋白和弹性蛋白的含量明显低于正常血管组织，且MMPs的活性升高，TIMPs的表达相对不足。这种细胞外基质代谢的失衡导致血管壁强度下降，增加了腹主动脉瘤破裂的风险。5.2对血管炎症反应的调控在腹主动脉瘤的发病进程中，血管炎症反应贯穿始终，是推动疾病发展的关键因素之一。炎症细胞的大量浸润和炎症因子的过度释放，会对血管壁的结构和功能造成严重破坏。巨噬细胞作为炎症反应的重要参与者，在腹主动脉瘤病变部位大量聚集。它们通过吞噬作用清除病原体和受损细胞，但同时也会释放多种炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等。这些炎症因子会进一步激活其他免疫细胞，形成级联放大反应，导致炎症反应不断加剧。T淋巴细胞也在腹主动脉瘤的炎症过程中发挥重要作用，不同亚型的T淋巴细胞具有不同的功能，辅助性T细胞1（Th1）和Th17细胞可分泌促炎细胞因子，增强炎症反应；而调节性T细胞（Treg）则具有抑制炎症反应的作用。当Treg细胞功能受损或数量减少时，无法有效抑制炎症反应，从而促进腹主动脉瘤的发展。平滑肌细胞内源性CSE/H₂S体系对血管炎症反应具有重要的调控作用。研究表明，H₂S可以抑制炎症细胞的浸润和活化。在体外实验中，用H₂S供体处理巨噬细胞后，发现巨噬细胞的迁移能力受到抑制，其向炎症部位的浸润减少。进一步研究发现，H₂S可以通过调节巨噬细胞表面的趋化因子受体表达来实现这一作用。趋化因子受体如CC趋化因子受体2（CCR2）在巨噬细胞的迁移过程中起着关键作用，H₂S能够降低CCR2的表达，使巨噬细胞对趋化因子的趋化反应减弱，从而抑制其向炎症部位的迁移。在动物实验中，给予CSE基因敲除小鼠血管紧张素II刺激诱导腹主动脉瘤形成，发现与野生型小鼠相比，CSE基因敲除小鼠血管壁中巨噬细胞的浸润明显增加。而给予这些小鼠H₂S供体干预后，巨噬细胞的浸润显著减少，表明CSE/H₂S体系在体内也能够抑制炎症细胞的浸润。CSE/H₂S体系还能够抑制炎症因子的释放。在脂多糖（LPS）诱导的炎症模型中，用H₂S供体处理细胞后，发现细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的含量显著降低。其机制与H₂S对NF-κB信号通路的抑制作用密切相关。NF-κB是一种重要的转录因子，在炎症反应中起着核心调控作用。在正常情况下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中。当细胞受到炎症刺激时，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，从而释放出NF-κB。NF-κB进入细胞核后，与炎症因子基因的启动子区域结合，促进炎症因子的转录和表达。而H₂S可以抑制IKK的活性，使IκB不被磷酸化，从而阻止NF-κB的活化和核转位。研究发现，H₂S能够使IKKα和IKKβ的磷酸化水平降低，减少IκB的降解，进而抑制NF-κB信号通路的激活，最终减少炎症因子的释放。CSE/H₂S体系对血管炎症反应的调控作用还体现在对炎症相关信号通路的调节上。除了NF-κB信号通路外，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在炎症反应中也起着重要作用。MAPK信号通路包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多条途径。在炎症刺激下，MAPK信号通路被激活，可促进炎症因子的表达和细胞的增殖、迁移等。H₂S可以抑制MAPK信号通路的激活。在体外实验中，用H₂S供体处理细胞后，发现ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平明显降低。进一步研究表明，H₂S可以通过调节上游激酶的活性来抑制MAPK信号通路。例如，H₂S可以抑制Raf-1激酶的活性，Raf-1是ERK信号通路的上游激酶，其活性降低会导致ERK的磷酸化减少，从而抑制MAPK信号通路的激活。CSE/H₂S体系通过抑制炎症细胞的浸润和活化、抑制炎症因子的释放以及调节炎症相关信号通路，对血管炎症反应起到重要的调控作用。在腹主动脉瘤发病过程中，CSE/H₂S体系功能的异常可能会导致血管炎症反应失控，进而促进腹主动脉瘤的发展。因此，深入研究CSE/H₂S体系对血管炎症反应的调控机制，对于理解腹主动脉瘤的发病机制和寻找有效的治疗靶点具有重要意义。5.3对平滑肌细胞功能的调节平滑肌细胞的表型转换、增殖和凋亡在腹主动脉瘤发病过程中起着关键作用，而平滑肌细胞内源性CSE/H₂S体系对这些过程具有重要的调节作用。在平滑肌细胞表型转换方面，正常情况下，血管平滑肌细胞主要以收缩型表型存在，具有典型的形态和功能特征，能够维持血管的正常张力。然而，在腹主动脉瘤发病过程中，多种因素会刺激平滑肌细胞发生表型转换，从收缩型转变为合成型。合成型平滑肌细胞的收缩蛋白表达降低，而增殖和迁移相关蛋白的表达增加，导致血管壁结构和功能异常。研究表明，CSE/H₂S体系可以抑制平滑肌细胞的表型转换。在体外实验中，用H₂S供体处理血管平滑肌细胞后，发现细胞中收缩型表型标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达增加，而合成型表型标志物胚胎型肌球蛋白重链（SMemb）的表达降低。进一步的机制研究发现，H₂S可以通过调节相关信号通路来影响平滑肌细胞的表型转换。H₂S能够抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活。MAPK信号通路的激活会促进平滑肌细胞从收缩型向合成型转换，而H₂S可以抑制MAPK信号通路中关键激酶的磷酸化，使其活性降低，从而抑制平滑肌细胞的表型转换。H₂S还可以通过调节转录因子的活性来影响平滑肌细胞的表型。血清反应因子（SRF）和心肌素（Myocardin）是维持平滑肌细胞收缩型表型的重要转录因子。研究发现，H₂S可以促进SRF和Myocardin与平滑肌细胞特异性基因启动子区域的结合，增强这些基因的转录，从而维持平滑肌细胞的收缩型表型。平滑肌细胞的增殖在腹主动脉瘤发病过程中也经历了复杂的变化。在腹主动脉瘤形成的早期阶段，平滑肌细胞可能会出现短暂的增殖现象，这是机体对血管损伤的一种代偿性反应。然而，随着疾病的进展，平滑肌细胞的增殖逐渐失控，过度增殖的平滑肌细胞会导致血管壁结构紊乱。研究表明，CSE/H₂S体系对平滑肌细胞的增殖具有抑制作用。在体外细胞实验中，用H₂S供体处理血管平滑肌细胞后，发现细胞的增殖活性明显降低。通过检测细胞周期相关蛋白的表达，发现H₂S可以使细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达减少，细胞周期停滞在G1期，从而抑制平滑肌细胞的增殖。进一步的研究发现，H₂S可以通过调节细胞内的信号通路来实现对平滑肌细胞增殖的抑制。H₂S能够抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路的激活。PI3K/Akt信号通路的激活会促进细胞增殖，而H₂S可以抑制PI3K的活性，减少Akt的磷酸化，从而抑制平滑肌细胞的增殖。H₂S还可以通过调节细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路来影响平滑肌细胞的增殖。ERK信号通路的激活会促进细胞增殖，而H₂S可以抑制ERK的磷酸化，使其活性降低，进而抑制平滑肌细胞的增殖。在腹主动脉瘤发病过程中，平滑肌细胞的凋亡增加，这会导致血管壁中平滑肌细胞数量减少，破坏血管壁的正常结构和功能。研究表明，CSE/H₂S体系可以抑制平滑肌细胞的凋亡。在体外实验中，用H₂S供体处理血管平滑肌细胞后，发现细胞凋亡相关蛋白Bax的表达减少，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加，细胞凋亡率明显降低。进一步的机制研究发现，H₂S可以通过调节线粒体凋亡信号通路来抑制平滑肌细胞的凋亡。在细胞凋亡过程中，线粒体膜电位会下降，细胞色素C会从线粒体释放到细胞质中，激活下游的凋亡蛋白酶，导致细胞凋亡。H₂S可以通过抑制线粒体膜电位的下降，减少细胞色素C的释放，从而抑制线粒体凋亡信号通路的激活，减少平滑肌细胞的凋亡。H₂S还可以通过调节其他凋亡相关信号通路，如死亡受体信号通路，来抑制平滑肌细胞的凋亡。死亡受体信号通路的激活会导致细胞凋亡，而H₂S可以抑制死亡受体相关蛋白的表达和活性，从而抑制死亡受体信号通路的激活，减少平滑肌细胞的凋亡。5.4对血管内皮细胞功能的影响血管内皮细胞作为血管内壁的一层单层扁平上皮细胞，在维持血管稳态方面发挥着不可或缺的作用。它不仅是血液与血管壁之间的物理屏障，还参与了血管张力调节、抗血栓形成、炎症反应调控以及物质交换等多种生理过程。正常情况下，血管内皮细胞通过合成和释放一系列血管活性物质，如一氧化氮（NO）、前列环素（PGI₂）和内皮素-1（ET-1）等，来维持血管的正常功能。NO是一种重要的血管舒张因子，由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化L-精氨酸生成，它能够激活鸟苷酸环化酶，使细胞内cGMP水平升高，导致血管平滑肌舒张。PGI₂也具有强大的血管舒张和抗血小板聚集作用，可抑制血小板的黏附和聚集，防止血栓形成。而ET-1则是一种强效的血管收缩因子，它通过与血管平滑肌细胞上的受体结合，激活相关信号通路，导致血管平滑肌收缩。在生理状态下，这些血管活性物质之间保持着精细的平衡，共同维持着血管的正常张力和功能。平滑肌细胞内源性CSE/H₂S体系对血管内皮细胞功能有着重要的调节作用。研究表明，H₂S可以促进血管内皮细胞释放NO和PGI₂，增强血管的舒张功能。在体外实验中，用H₂S供体处理血管内皮细胞后，发现细胞内eNOS的活性增强，NO的释放量增加。进一步研究发现，H₂S可以通过激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，使eNOS的丝氨酸1177位点磷酸化，从而增强eNOS的活性，促进NO的合成和释放。H₂S还可以通过调节环氧化酶（COX）的活性，促进PGI₂的合成和释放。COX是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，H₂S可以通过抑制COX-2的降解，增加COX-2的表达，从而促进PGI₂的合成。在体内实验中，给予CSE基因敲除小鼠血管紧张素II刺激诱导腹主动脉瘤形成，发现与野生型小鼠相比，CSE基因敲除小鼠血管内皮细胞中NO和PGI₂的释放量明显减少，血管舒张功能受损。而给予这些小鼠H₂S供体干预后，NO和PGI₂的释放量增加，血管舒张功能得到改善。CSE/H₂S体系还能够抑制血管内皮细胞释放ET-1，减少血管的收缩反应。在体外实验中，用H₂S供体处理血管内皮细胞后，发现细胞内ET-1的mRNA和蛋白表达水平均降低。进一步研究发现，H₂S可以通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活，减少ET-1基因的转录，从而降低ET-1的表达和释放。在体内实验中，给予CSE基因敲除小鼠血管紧张素II刺激诱导腹主动脉瘤形成，发现与野生型小鼠相比，CSE基因敲除小鼠血管内皮细胞中ET-1的释放量明显增加，血管收缩功能增强。而给予这些小鼠H₂S供体干预后，ET-1的释放量减少，血管收缩功能得到抑制。血管内皮细胞功能异常与腹主动脉瘤的发生发展密切相关。当血管内皮细胞受到损伤或功能失调时，会导致血管活性物质的释放失衡，血管舒张功能减弱，收缩功能增强，从而促进腹主动脉瘤的发生和发展。血管内皮细胞损伤会导致NO和PGI₂的释放减少，ET-1的释放增加，使得血管壁处于收缩状态，血流动力学发生改变，对血管壁的压力增大。血管内皮细胞的损伤还会导致炎症细胞的黏附和浸润增加，炎症反应加剧，进一步破坏血管壁的结构和功能。在腹主动脉瘤患者的血管组织中，常常可以观察到血管内皮细胞的损伤和功能异常，表现为eNOS活性降低，NO释放减少，ET-1表达和释放增加等。因此，平滑肌细胞内源性CSE/H₂S体系通过调节血管内皮细胞功能，维持血管活性物质的平衡，对于预防和治疗腹主动脉瘤具有重要意义。六、研究方法与实验设计6.1细胞实验本研究选用大鼠主动脉平滑肌细胞（A7r5细胞），购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-链霉素双抗（Solarbio公司）的DMEM高糖培养基（HyClone公司）中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中常规培养。待细胞生长至对数期时，进行后续实验操作。将培养的A7r5细胞随机分为以下几组：正常对照组：正常培养A7r5细胞，不做任何处理，作为基础对照，用于观察细胞的正常生物学行为。模型组：采用脂多糖（LPS，Sigma公司）刺激A7r5细胞构建腹主动脉瘤细胞模型，LPS终浓度为10μg/mL，作用24小时，以模拟体内炎症环境下平滑肌细胞的病理变化。CSE过表达组：将携带CSE基因的过表达质粒（由本实验室构建并保存）转染至A7r5细胞中，通过脂质体转染试剂Lipofectamine3000（Invitrogen公司）按照说明书进行操作，转染48小时后，筛选出稳定过表达CSE的细胞株，然后用10μg/mLLPS刺激24小时，研究CSE过表达对腹主动脉瘤细胞模型的影响。CSE抑制组：使用CSE特异性抑制剂炔丙基甘氨酸（PAG，Sigma公司）处理A7r5细胞，PAG终浓度为100μM，预处理1小时后，再加入10μg/mLLPS刺激24小时，观察抑制CSE活性后对腹主动脉瘤细胞模型的作用。H₂S供体组：给予A7r5细胞H₂S供体硫氢化钠（NaHS，Sigma公司）处理，NaHS终浓度为100μM，作用24小时，然后加入10μg/mLLPS刺激24小时，探究外源性补充H₂S对腹主动脉瘤细胞模型的影响。针对各实验组，我们设定了多维度的检测指标和方法。在蛋白表达检测方面，运用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）来测定相关蛋白的表达水平。具体操作如下：收集各组细胞，用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液（Solarbio公司）裂解细胞，提取总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒（ThermoFisherScientific公司）测定蛋白浓度，将等量的蛋白样品进行SDS电泳分离，随后转至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脱脂奶粉封闭1小时后，加入一抗孵育过夜，一抗包括抗CSE抗体（Abcam公司）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（CellSignalingTechnology公司）、抗基质金属蛋白酶-2（MMP-2）抗体（Abcam公司）、抗基质金属蛋白酶-9（MMP-9）抗体（Abcam公司）、抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体（Proteintech公司）等，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分钟，再加入相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（Proteintech公司）室温孵育1小时。洗膜后，利用化学发光底物（ThermoFisherScientific公司）进行显影，通过ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin（Proteintech公司）作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。细胞增殖能力检测采用CCK-8法（Dojindo公司）。将各组细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔。分别在培养24小时、48小时、72小时时，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育1-4小时，用酶标仪（ThermoFisherScientific公司）在450nm波长处测定吸光度（OD）值，以OD值反映细胞增殖活性。运用Transwell小室实验（Corning公司）检测细胞迁移能力。在上室中加入无血清培养基重悬的细胞（2×10⁵个/孔），下室加入含10%FBS的培养基作为趋化因子。孵育24小时后，取出小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，用4%多聚甲醛固定迁移到下室的细胞15分钟，结晶紫染色10分钟，在显微镜下随机选取5个视野，计数迁移细胞数量，以此评估细胞迁移能力。采用AnnexinV-FITC/PI双染法（BDBiosciences公司）结合流式细胞术检测细胞凋亡情况。收集各组细胞，用PBS洗涤2次，按照试剂盒说明书加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15分钟，再加入适量结合缓冲液，通过流式细胞仪（BDFACSCalibur）检测细胞凋亡率，使用FlowJo软件分析数据。6.2动物实验选用6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠体重控制在20-25g。小鼠饲养于温度（23±2）℃、相对湿度（50±10）%的SPF级动物房，自由进食和饮水，适应环境1周后进行实验。构建腹主动脉瘤小鼠模型采用血管紧张素II（AngII）皮下渗透泵联合腹主动脉部分结扎的方法。具体操作如下：小鼠用1%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，将其仰卧固定于手术台上，常规消毒铺巾。在腹部正中做一长约1.5-2cm的切口，钝性分离暴露肾下腹主动脉。使用6-0丝线在肾下腹主动脉处进行部分结扎，使血管直径缩窄至原来的50%左右。随后，将含有AngII（1000ng/kg/min）的皮下渗透泵（Alzet2004型，DurectCorporation）植入小鼠背部皮下，缝合切口。术后给予小鼠青霉素（40万U/kg）肌肉注射，连续3天，预防感染。将小鼠随机分为以下4组，每组10只：正常对照组：小鼠仅进行假手术操作，即暴露腹主动脉但不进行结扎和AngII泵植入，术后给予正常饲养。模型组：按照上述方法构建腹主动脉瘤模型，术后给予正常饲养。CSE基因敲低组：在构建腹主动脉瘤模型前，通过尾静脉注射携带CSEshRNA的腺相关病毒（AAV-shCSE），以敲低小鼠体内CSE的表达。注射剂量为1×10¹²vg/kg，注射后1周进行腹主动脉瘤模型构建。H₂S供体干预组：在构建腹主动脉瘤模型后，每天给予小鼠腹腔注射H₂S供体GYY4137（50mg/kg），连续干预28天。正常对照组和模型组给予等量的生理盐水腹腔注射。在实验过程中，观察小鼠的一般状况，包括精神状态、饮食、活动等。每周测量小鼠的体重，记录体重变化情况。实验结束后，将小鼠用过量戊巴比妥钠（100mg/kg）腹腔注射处死，迅速取出腹主动脉，进行以下检测：腹主动脉直径测量：使用游标卡尺测量腹主动脉瘤部位的最大直径，并与正常对照组小鼠的腹主动脉直径进行比较，计算扩张倍数。同时，采用超声心动图（VisualSonicsVevo2100）在实验过程中动态监测腹主动脉直径的变化，评估动脉瘤的发展情况。组织病理学检测：将腹主动脉标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度为4μm。进行苏木精-伊红（HE）染色，观察血管壁的组织结构变化，包括内膜、中膜和外膜的厚度，平滑肌细胞的形态和数量等。采用Masson染色观察血管壁中胶原蛋白的分布和含量变化。通过免疫组织化学染色检测α-SMA、MMP-2、MMP-9等蛋白的表达定位，以评估平滑肌细胞的表型和细胞外基质的代谢情况。蛋白质免疫印迹法（Westernblot）：提取腹主动脉组织的总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将等量的蛋白样品进行SDS电泳分离，转膜后用5%脱脂奶粉封闭1小时。加入一抗孵育过夜，一抗包括抗CSE抗体、抗α-SMA抗体、抗MMP-2抗体、抗MMP-9抗体、抗TNF-α抗体等，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分钟，再加入相应的HRP标记的二抗室温孵育1小时。洗膜后，利用化学发光底物进行显影，通过ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：提取腹主动脉组织的总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采用SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR反应。引物序列根据GenBank中相应基因的序列设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件为：95℃预变性30秒，然后95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。通过2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量，以GAPDH作为内参基因。检测的目的基因包括CSE、α-SMA、MMP-2、MMP-9、TNF-α等。6.3临床样本分析本研究纳入20例腹主动脉瘤患者作为病例组，患者均来自[医院名称]血管外科住院部，入选标准为经CT血管造影（CTA）或磁共振血管造影（MRA）检查确诊为腹主动脉瘤，且符合国际通用的腹主动脉瘤诊断标准，即腹主动脉直径超过正常直径的1.5倍。同时，选取10例因其他腹部疾病行手术治疗且腹主动脉正常的患者作为对照组，这些患者在手术中经术中探查及术后影像学检查确认腹主动脉无病变。所有患者在术前均签署了知情同意书，本研究方案获得了[医院伦理委员会名称]的批准。在样本收集方面，于手术过程中获取腹主动脉瘤患者的瘤壁组织及正常对照组的腹主动脉组织。在获取瘤壁组织时，避开血栓及明显坏死区域，选取瘤体中部的血管壁组织，以确保样本的代表性。对于正常对照组的腹主动脉组织，选取肾动脉水平以下的腹主动脉段，同样避开周围脂肪及结缔组织。样本获取后，立即用预冷的生理盐水冲洗，去除血液及杂质。将部分组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后续的组织病理学检测，固定时间为24-48小时。另一部分组织迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于蛋白质免疫印迹法（Westernblot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。在组织病理学检测中，将固定好的组织进行石蜡包埋，制成厚度为4μm的切片。进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察血管壁的组织结构，包括内膜、中膜和外膜的厚度，平滑肌细胞的形态和数量，以及有无炎症细胞浸润等情况。采用Masson染色观察血管壁中胶原蛋白的分布和含量变化。通过免疫组织化学染色检测α-SMA、MMP-2、MMP-9等蛋白在血管组织中的表达定位，以评估平滑肌细胞的表型和细胞外基质的代谢情况。在免疫组织化学染色过程中，严格按照试剂盒说明书进行操作，使用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。运用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测CSE、α-SMA、MMP-2、MMP-9、TNF-α等蛋白的表达水平。从-80℃冰箱中取出冻存的组织样本，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，在冰上充分研磨裂解组织，然后进行超声破碎，使细胞充分裂解。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将等量的蛋白样品进行SDS电泳分离，随后转至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1小时后，加入一抗孵育过夜，一抗包括抗CSE抗体、抗α-SMA抗体、抗MMP-2抗体、抗MMP-9抗体、抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体等，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分钟，再加入相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育1小时。洗膜后，利用化学发光底物进行显影，通过ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CSE、α-SMA、MMP-2、MMP-9、TNF-α等基因的mRNA表达水平。从-80℃冰箱中取出冻存的组织样本，使用Trizol试剂提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采用SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR反应。引物序列根据GenBank中相应基因的序列设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件为：95℃预变