义翘讲堂《选对系统高效表达：蛋白表达系统特性分析 × 高频问题一站式解答》

选对系统，高效表达：蛋白表达系统特性分析×高频问题一站式解答于璐璐博士重组蛋白高级研发经理北京义翘神州科技股份有限公司蛋白表达系统特性分析1各类蛋白表达平台技术路线2蛋白表达系统的选择策略3CONTENTS义翘神州重组蛋白表达优化案例4CRO服务现货供应生物试剂9,000+重组蛋白15,000+抗体50,000+基因ELISA试剂盒、无血清培养基、GMP级核酸酶...义翘神州坚持自主研发生产，打造生命科学研究和创新药物研发“一站式”试剂与服务支撑平台重组抗体生产免疫检测重组蛋白表达生物安全检测一站式技术服务ELISA试剂盒开发抗体制备高度定制化10天：从基因合成到抗体/蛋白交付每年：自主开发2000种以上重组蛋白和抗体自主研发并独立掌握：以蛋白、抗体为核心的生物试剂创新研发全套关键技术和平台TheGlobalLeaderinRecombinantTechnology北京总部上海、广州、杭州、成都、武汉分公司欧洲子公司德国法兰克福美国子公司宾夕法尼亚州费城区泰州子公司苏州子公司美国休斯顿办事处日本子公司川崎市SignalChemBiotech(义翘神州全资子公司)加拿大大温哥华地区生物工程中心（C4B）美国休斯顿立足中国，全球布局生产研发中心：客户分布>90国家/地区

TheGlobalLeaderinRecombinantTechnology全球人才队伍>1000人超2万平米研发中心5千平米洁净车间产品/服务引用文献~20000篇资质与荣誉ISO9001认证ISO13485认证CNAS认证GMP认证CMA认证资质荣誉CiteAb“2024年值得关注的细胞因子供应商”2021-2022年连续获得CiteAb“值得关注的重组蛋白供应商”助力新冠研究，获得多项奖项…北京市“单克隆抗体上游研发技术”重点实验室北京市科学技术进步奖一等奖高新技术企业北京民营企业中小百强北京市“专精特新”中小企业2007-202518年专注于重组蛋白生产和抗体开发TheGlobalLeaderinRecombinantTechnology蛋白表达系统特性分析01义翘神州酶调节蛋白蛋白质是生命活动的直接执行者Protein来源于希腊语Proteios，表示“第一重要”的含义；蛋白质是人体内细胞、组织、生物活性物质等的重要组成成分。运输蛋白运动蛋白防御蛋白贮存蛋白结构蛋白核糖核酸酶、胰蛋白酶...受体蛋白血红蛋白、葡萄糖转运蛋白...酪蛋白、铁蛋白...角蛋白、胶原蛋白...肌球蛋白、肌动蛋白...胰岛素、促生长素...抗体、凝血酶...胰岛素受体、EGFR...以及更多...按蛋白功能分类/10.1042/ebc20200108重组蛋白的优势与应用自然界中存在的，不经过人工的任何修饰或加工的蛋白天然蛋白VS动物源含量低重组技术无动物源可放大来源限制批间差异可控批间差异利用基因重组技术，将目标基因(外源基因)导入宿主细胞中，并通过宿主细胞的生物机制表达的蛋白蛋白药物抗体药物结构研究细胞培养工具酶免疫原蛋白功能研究工业酶以及更多...重组蛋白的应用重组蛋白1972~1973197719781982198619851990~首次报道DNA片段的连接与转化，这是实现重组表达的第一步。首次在大肠杆菌中成功表达出人生长激素释放抑制因子，证明了用基因重组技术生产蛋白的可行性。Genentech公司生产出世界首个重组人胰岛素，标志着基因重组技术的产业化时代开启。美国FDA批准首款重组蛋白药物——人胰岛素，这代表重组蛋白产业进入快速增长期。各大表达系统相继建立，重组蛋白的高效生产得以实现。美国FDA批准首款重组疫苗——乙肝疫苗，标志着基因重组技术在疫苗研发领域的成功应用。基因重组技术的广泛应用，推动了单抗、双抗和融合蛋白等新型生物制品的涌现及高速发展。重组蛋白的发展历程重组蛋白表达流程细胞转染蛋白表达蛋白纯化载体克隆基因合成培养条件:培养基转染方式、质粒的质量温度、时间、pH、盐粒子浓度表达宿主纯化方法:上清/胞内裂解方式纯化方式重组表达宿主的使用率/10.1007/s11033-022-07651-3科研领域生物制药领域常见蛋白表达系统的使用率大肠杆菌的使用率最高：>70%~70%重组蛋白药物由哺乳动物细胞表达常见蛋白表达系统的使用率：/10.3389/fmicb.2014.00085E.coliYeastInsectcellsMammaliancellsCell-free

(E.coli

)Cell-free

(wheatgerm)Averagetimeofcelldivision30min90min18hr24hrN/AN/ACostofexpressionLowLowHighHighHighHighExpressionlevelHighLow-HighLow-HighLow-ModerateLow-HighLow-HighSuccessrate(%soluble)40-6050-7050-7080-95VariableVariableAdvantagesSimpleandlowcostRapid,robust,andhighyieldEasylabelingforstructuralstudiesSimpleandlowcostPost-translationalmodificationsNaturalproteinconfigurationPost-translationalmodificationsHighyield,fast,andflexibleDisulfide-bondedandmembraneproteinsEasylabelingforstructuralstudiesFastandflexibleDisulfide‐bondedandmembraneproteinsPost‐translationalmodificationsDisadvantagesNopost-translationalmodificationsInsolubleproteinLesspost-translationalmodificationsSlowHighercostSlowHighcostLoweryieldHighcostLesspost-translationalmodificationsEfficientproductionrequireshighly-specializedsetupHighcostLoweryieldthan

E.coli

cell-freesystemEfficientproductionrequireshighlyspecializedsetup不同表达宿主的特点/10.1002/0471140864.ps0524s61各类蛋白表达平台技术路线02义翘神州多种表达体系规模化培养工艺生产规模逐级放大全面的纯化工艺高效率高通量高质量义翘神州重组蛋白表达平台酵母大肠杆菌HEK293/CHO细胞杆状病毒-昆虫细胞肿瘤标志物Fc受体药物靶点酶病毒抗原免疫检查点信号通路靶点CD分子细胞因子大肠杆菌表达平台技术路线：杆状病毒-昆虫表达平台技术路线：Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统将目标基因插入供体质粒，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，目标基因从供体质粒转座到Bacmid上即产生重组bacmid，通过蓝白斑筛选，挑选白色菌落进行培养，提取重组bacmid。将重组bacmid转染到昆虫细胞中，在昆虫细胞中完成病毒的生产和组装,收集转染后细胞的上清液，将上清液接种到新的昆虫细胞中进行病毒扩增,以获得足够滴度的病毒。杆状病毒侵染昆虫细胞，培养一段时间后收集上清或者细胞裂解液。经过一系列的纯化，可以得到目的重组蛋白。杆状病毒-昆虫表达关键因素杆状病毒质粒培养时间（天）活细胞密度(x106cells/mL)培养时间（天）活细胞密度(x106cells/mL)Sf9细胞在SIMSF无血清细胞培养基中的生长水平Hi-5细胞在SIMHF无血清细胞培养基中的生长水平辅助质粒宿主细胞细胞系应用Sf9重组杆状病毒生产胞内蛋白表达空斑分析Sf21胞内蛋白表达分泌蛋白表达Hi-5胞内蛋白表达分泌蛋白表达培养基SIMSF无血清培养基——专为Sf9和Sf21细胞设计货号：MSF1

最大细胞生长密度：1.2×107

cells/mLSIMHF无血清培养基——专为Hi-5细胞开发货号：MHF1最大细胞生长密度：1.23×107cells/mL哺乳动物瞬时表达平台自主研发优化的哺乳动物瞬时表达平台自主优化的高效表达载体、专有的转染试剂、自主产权培养基、加料液以及添加剂等>1000抗体或蛋白/项目通量摇瓶~1500L反应器的培养规模

μg~kg级的重组蛋白、抗体生产1500L反应器哺乳动物细胞作为现代生物技术的一个重要组成部分，具有复杂的蛋白折叠和翻译后修饰机制。利用该系统进行重组蛋白表达，能够实现接近天然蛋白的折叠和翻译后修饰技术路线：HEK293细胞悬浮培养基SMM293-TII培养基——无血清、无抗生素、无动物源性组分相同条件下，使用SMM293-TII培养基，HEK293F细胞密度和细胞活率更好相同条件下，使用SMM293-TII培养基的重组抗体的产量更高最大细胞生长密度：8~10×106cells/mL货号：M293TII蛋白表达系统的选择策略03义翘神州来源01真核、原核定位02分泌、胞内、跨膜理化性质03分子量、等电点、无序性、疏水性等功能04翻译后修饰等表达宿主的选择目标蛋白四个关键决策点表达宿主的选择原核表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统分泌蛋白、胞外段翻译后修饰水平高细胞质蛋白跨膜蛋白原核蛋白不需要翻译后修饰分子量二硫键需要翻译后修饰的蛋白分子量较大二硫键真核蛋白来源01真核蛋白定位02分泌蛋白理化性质03分子量、二硫键功能04较少的翻译后修饰细胞因子IL2表达宿主的选择——案例分析原核表达表达宿主的选择——案例分析流感病毒血凝素（Hemagglutinin,HA）InfluenzaAvirus(A/California/04/2009(H1N1))hemagglutinin

来源01病毒蛋白定位02跨膜蛋白理化性质03分子量、二硫键功能04大量的糖基化修饰昆虫表达HEK293表达表达宿主的选择——细胞质蛋白调节蛋白酶类转运蛋白核受体核因子转录因子葡萄糖转运蛋白氨基酸转运蛋白单羧酸转运蛋白氧化还原酶类连接酶水解酶转移酶：激酶激酶锚定蛋白炎症相关蛋白巨型支架蛋白AHNAK等支架蛋白结构蛋白角蛋白胶原蛋白弹性蛋白昆虫系统原核/昆虫系统原核/昆虫系统昆虫/HEK293系统困难蛋白Oligomer=34%BufferoptimizedOligomer=50%昆虫细胞表达更换宿主E.coliMW:~330kDaLot1,FTx3E.coli菌株2E.coli

菌株1表达宿主的选择——案例分析新冠N蛋白重组蛋白表达优化案例04义翘神州优化前优化后14.418.425.035.045.066.2116.0获得高质量重组蛋白——优化案例分析优化核酸序列宿主菌1宿主菌214.418.425.035.045.066.2116.014.418.425.035.045.066.2116.0更换宿主菌株共表达伴侣蛋白14.418.425.035.045.066.2116.0Marker纯化后复合物B伴侣蛋白A目标蛋白(His)胞内蛋白

大肠杆菌表达

蛋白产量低

优化核酸序列：调整GC含量蛋白表达量提升20倍胞内蛋白

大肠杆菌表达

蛋白产量低共表达伴侣蛋白表达量提升、获得高纯度的可溶蛋白胞内蛋白

大肠杆菌表达

蛋白产量低

更换大肠杆菌菌株蛋白表达量和可溶性显著提升获得高质量重组蛋白——优化案例分析优化构建设计方案单次跨膜蛋白胞外区分泌表达(MW=~90kDa)昆虫细胞表达截去N端高疏水区促进蛋白分泌表达蛋白成功分泌，并且纯化后蛋白纯度：>95%Construct1:FullECDCase1：HydrophobicityanalysisConstruct2:Hydrophobicregionremoval获得高质量重组蛋白——优化案例分析优化构建设计方案胞内蛋白，项目需求指定HEK293细胞表达原核表达，均一寡聚体；HEK293细胞表达，蛋白高聚文献调研目标蛋白：真核中N端区域的翻译后修饰可能诱导聚集

截去N端诱导蛋白寡聚的区段获得高纯度的蛋白Case2：14.418.425.035.045.066.2116.014.418.425.035.045.066.2116.0原核表达HEK293细胞表达HEK293细胞表达构建1构建2稳定性试验回收率-80℃冻融30min(3次）100%4℃放存3天85%获得高质量重组蛋白——优化案例分析缓冲液成分优化

全长单次跨膜蛋白(MW=~50