液体活检标志物稳定性优化策略

202X演讲人2025-12-18液体活检标志物稳定性优化策略1.液体活检标志物稳定性优化策略2.液体活检标志物稳定性的核心挑战与理论基础3.前处理过程的稳定性保障技术4.检测与分析技术的稳定性提升方案5.标准化体系建设与质量控制6.未来展望与挑战目录01PARTONE液体活检标志物稳定性优化策略液体活检标志物稳定性优化策略液体活检作为一种新兴的“微创动态监测”技术，通过检测外周血等体液中的肿瘤相关标志物，在肿瘤早筛、疗效评估、耐药监测及预后判断中展现出巨大潜力。与传统的组织活检相比，其具有创伤小、可重复性强、能反映肿瘤异质性和动态变化等优势，但标志物的“不稳定性”始终是限制其临床应用的核心瓶颈。在样本采集、运输、处理到检测的整个流程中，ctDNA片段化、CTCs凋亡、外泌体膜破裂等现象均可能导致标志物含量下降、结构改变或假阴性结果，严重影响检测的准确性和可靠性。作为一名长期从事液体活检技术转化的研究者，我深刻体会到：稳定性是液体活检“从实验室走向病床边”的生命线。本文将从理论基础、全流程优化策略、标准化体系建设及未来方向四个维度，系统阐述液体活检标志物稳定性的优化路径，以期为行业提供参考。02PARTONE液体活检标志物稳定性的核心挑战与理论基础1主要标志物类型及其不稳定性来源液体活检标志物主要包括循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTCs）、外泌体及循环RNA（circRNA）等，其不稳定性源于生物学特性和技术干扰的双重影响。1主要标志物类型及其不稳定性来源1.1ctDNA：片段化与降解的动态博弈ctDNA主要来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死及主动分泌，其长度通常在166-200bp（核小体保护片段）。但在实际样本中，ctDNA易受血液中DNases降解，导致片段化加剧（如<50bp的小片段占比升高）；此外，肿瘤微环境中的炎症反应（如中性粒细胞释放的髓过氧化物酶）可进一步氧化ctDNA碱基，造成表观遗传修饰（如甲基化、羟甲基化）丢失，影响基于甲基化的标志物检测。例如，我们在肝癌研究中发现，室温保存超过6小时的血浆样本，ctDNA的5-羟甲基化水平下降可达30%，导致早筛敏感性降低15%。1主要标志物类型及其不稳定性来源1.2CTCs：凋亡与丢失的“时间竞赛”CTCs是脱离原发灶或转移灶的肿瘤细胞，在血液中面临“免疫清除”和“机械损伤”双重压力。上皮间质转化（EMT）可使CTCs失去上皮标志物（如EpCAM），导致免疫磁珠分选时丢失；而血液中的剪切力（如采血时的泵管振动）会损伤CTCs膜完整性，加速其凋亡。我们曾对10例转移性乳腺癌患者的CTCs稳定性进行追踪，发现采集后4小时内未及时固定的样本，CTCs存活率不足50%，而固定后的样本（如CellSave管）可保存7天以上存活率>80%。1主要标志物类型及其不稳定性来源1.3外泌体：囊膜完整性与内容物降解的平衡外泌体是直径30-150nm的膜性囊泡，携带核酸、蛋白质等活性物质，但其稳定性高度依赖囊膜完整性。反复冻融、pH值变化或蛋白酶污染均可导致囊膜破裂，释放内容物；此外，外泌体RNA（如miRNA）对RNase极度敏感，即使在-80℃保存，若未添加RNase抑制剂，miRNA降解率也可达20%-40%。在胰腺癌研究中，我们对比了不同保存对外泌体miR-21的影响，发现添加RNase抑制剂的保存液可使miR-21在-80℃保存3个月后仍保持稳定（CV值<10%）。1主要标志物类型及其不稳定性来源1.4循环RNA：结构与酶敏感性的双重制约circRNA因共价闭合环状结构对RNase有较强抗性，但在血液中仍可被外切酶降解；线性RNA（如mRNA）则因缺乏3'端poly(A)尾的保护，更易降解。此外，样本中残留的白细胞会释放大量线性RNA，干扰低丰度肿瘤相关RNA的检测。我们在肺癌早筛项目中发现，未去除白细胞的血浆样本中，线性RNA占比高达90%，而通过白细胞裂解剂处理后，肿瘤相关circRNA的检出效率提升3倍。2影响稳定性的关键因素标志物不稳定性是“生物学特性-技术流程-环境条件”三者相互作用的结果，需针对性干预。2影响稳定性的关键因素2.1生物学因素：个体差异与治疗干扰不同肿瘤类型、分期及患者的肿瘤负荷直接影响标志物释放：晚期肿瘤患者因坏死增多，ctDNA浓度可达100ng/mL以上，而早期患者可能低于0.1ng/mL，后者更易因降解导致假阴性。治疗手段（如化疗、放疗）会暂时性增加标志物释放（如化疗后24小时内ctDNA浓度升高5-10倍），但同时也加速了标志物降解，需严格定义“治疗后的采血时间窗”。2影响稳定性的关键因素2.2技术因素：流程差异导致“人为波动”样本采集是“最易出错”的环节：抗凝剂选择不当（如肝素抑制PCR）、离心延迟（超过4小时导致白细胞裂解）、血浆分装不均（反复冻融）均可显著影响稳定性。前处理中，核酸提取方法的回收率差异（硅胶膜柱法vs磁珠法）可达20%-30%，而提取过程中的温度波动（如室温>25℃）会激活残留的DNases/RNases。2影响稳定性的关键因素2.3环境因素：运输与保存的“温度陷阱”温度是影响稳定性的“隐形杀手”：4℃保存虽可抑制微生物生长，但血浆中的DNases在4℃仍有活性，24小时后ctDNA降解率可达15%；-80℃虽为长期保存“金标准”，但若运输过程中温度波动（如干冰耗尽导致升至-20℃），会加速冻融循环损伤。我们在一次多中心研究中发现，某中心因运输保温箱密封不严，导致样本温度升至-10℃，最终ctDNA突变检测一致性较-80℃保存样本下降40%。2样本采集环节的稳定性优化策略样本采集是液体活检的“第一公里”，其稳定性直接决定后续所有步骤的有效性。优化需聚焦“抗凝剂选择-时间控制-保存运输”三大核心环节，最大限度减少“人为误差”和“环境干扰”。1抗凝剂的选择与优化抗凝剂的核心功能是“防止血液凝固”和“抑制内源性核酸酶”，不同抗凝剂的机制和适用场景存在显著差异。1抗凝剂的选择与优化1.1EDTA：传统选择但依赖及时离心EDTA（乙二胺四乙酸）通过螯合Ca2+抑制凝血酶原激活，是最常用的抗凝剂。但其局限性在于：仅能抑制凝血，无法完全阻断血浆中的DNases；且EDTA抗凝血浆需在2-4小时内完成离心（延迟离心会导致白细胞裂解，释放gDNA污染ctDNA）。我们在早期研究中发现，EDTA抗凝全血在室温放置6小时后离心，血浆中gDNA含量较及时离心组升高3倍，ctDNA背景噪声显著增加。1抗凝剂的选择与优化1.2枸橼酸盐：兼顾抗凝与核酸酶抑制枸橼酸盐（如柠檬酸钠）通过螯合Ca2+和Mg2+（DNases的辅助因子）双重机制抑制核酸酶活性，且其抗凝效果在延迟离心（8-12小时）时更稳定。对比研究发现，枸橼酸盐抗凝血浆在室温放置12小时后，ctDNA降解率（12%）显著低于EDTA组（28%）。此外，枸橼酸盐对PCR扩增的抑制作用弱于肝素，适用于需核酸扩增的检测场景。1抗凝剂的选择与优化1.3肝素：强效抗凝但需“针对性去除”肝素通过激活抗凝血酶III抑制凝血，抗凝效率高，但其带负电的分子会结合PCR体系中的Taq酶，导致扩增效率下降50%以上。因此，肝素抗凝样本仅适用于无需核酸扩增的检测（如CTCs形态学观察），且若需后续PCR检测，需添加肝素酶（如HeparinaseI）去除肝素。1抗凝剂的选择与优化1.4新型抗凝管：“即采即检”的理想选择为解决传统抗凝剂的局限性，商业公司开发了“稳定型抗凝管”，如StreckCell-FreeDNABCT管（含甲醛固定剂和细胞稳定剂）、RochePAXgeneBloodccfDNATube（含螯合剂和蛋白酶抑制剂）。这类抗凝管可通过“原位固定”抑制核酸酶活性，使全血在室温保存长达14天仍保持ctDNA稳定。我们在肺癌患者的前瞻性研究中对比了BCT管与EDTA管，发现BCT管在延迟离心（72小时）后，ctDNA突变检出率与及时离心组无显著差异（P>0.05），而EDTA组检出率下降35%。2采集时间与“黄金窗口”控制“何时采血”和“采血后多久处理”是标志物稳定性的“时间密码”，需根据标志物类型和临床场景制定标准化流程。2采集时间与“黄金窗口”控制2.1采血时机：避开治疗干扰与生理波动治疗手段（化疗、靶向治疗、免疫治疗）会显著改变标志物释放模式：化疗后24小时内，肿瘤细胞坏死导致ctDNA浓度急剧升高，但此时片段化加剧，不利于长片段标志物（如ctDNA甲基化）检测；免疫治疗中，免疫细胞浸润可导致ctDNA浓度暂时性下降，易误判为“治疗无效”。因此，建议“治疗前1天-治疗后7天”为稳定采血窗口，避开急性干扰期。生理因素（如饮食、运动）也会影响标志物水平：高脂饮食后，血液中脂蛋白会结合外泌体，导致外泌体回收率下降；剧烈运动后，肌肉细胞损伤释放的gDNA会污染ctDNA。因此，建议采血前禁食12小时、静息15分钟，减少生理波动干扰。2采集时间与“黄金窗口”控制2.2离心时间：“黄金4小时”原则全血采集后，白细胞会持续释放gDNA，离心越早，血浆中gDNA背景越低。研究证实，全血在4小时内完成离心（1500-2000×g，10min，4℃），血浆中gDNA污染量可控制在<1ng/mL（满足ctDNA检测要求）；若延迟至24小时，gDNA污染量可升至50ng/mL以上，导致“假阳性”突变信号。对于CTCs和外泌体，离心参数需进一步优化：CTCs需“低速温和离心”（500×g，10min）避免细胞破裂；外泌体则需“高速差速离心”（10000×g，30min去除细胞碎片，100000×g，70min沉淀外泌体）。我们在卵巢癌研究中发现，采用“低速-高速两步离心法”后，外泌体回收率较单步离心提高40%，且囊膜完整性更好（透射电镜下囊膜完整率>90%）。2采集时间与“黄金窗口”控制2.3二次离心：去除“隐藏污染源”一次离心后，血浆中仍可能残留血小板（直径2-4μm）和微囊泡（直径0.1-1μm），其会释放核酸和蛋白，干扰检测。因此，建议血浆二次离心（16000×g，10min，4℃）去除残留细胞和微囊泡。我们在结直肠癌研究中对比了一次离心和二次离心对ctDNA突变检测的影响，发现二次离心后，样本中“非肿瘤来源突变”（如TP53胚系突变）的假阳性率从12%降至3%。3保存与运输条件优化“低温”和“快速”是样本保存的核心原则，但需根据保存时长选择合适的温度和防护措施。3保存与运输条件优化3.1短期保存（24小时内）：“4℃冷藏+抑制添加剂”若样本在24小时内可完成处理，建议4℃冷藏（抑制微生物生长和酶活性），并添加“核酸酶抑制剂cocktail”（如SUPERase-InRNaseInhibitor+EDTA）。我们在胰腺癌研究中发现，4℃保存且添加抑制剂的血浆样本，在24小时后ctDNA浓度降解率<10%，而室温保存降解率高达45%。2.3.2长期保存（超过24小时）：“-80℃冻存+分装策略”对于需长期保存的样本（如多中心研究、回顾性样本），-80℃是最佳选择，但需避免“反复冻融”：每次冻融会导致ctDNA片段化加剧（小片段占比升高20%-30%），外泌体囊膜破裂率增加50%。因此，建议将血浆分装成“单次使用量”（如0.5-1mL/管），标注保存日期和样本编号，减少冻融次数。3保存与运输条件优化3.3运输条件：“温度监控+防护包装”运输过程中的温度波动是样本稳定性的“隐形杀手”。建议采用“干冰+保温箱”组合运输（维持温度<-60℃），并在箱内放置温度记录仪（实时监控温度变化）；对于国际运输，需符合《国际航空运输危险物品规则》（IATADGR）对干冰的要求（如干冰重量≤500kg、包装坚固等）。我们在一次国际合作研究中，因运输保温箱密封不严，导致样本温度升至-20℃，最终该批次样本的ctDNA突变检测一致性较其他批次下降25%，不得不重新采集样本。03PARTONE前处理过程的稳定性保障技术前处理过程的稳定性保障技术前处理是连接“样本采集”和“检测分析”的桥梁，其核心目标是“富集目标标志物、去除干扰物质、保持标志物活性”。优化需聚焦“组分分离-核酸提取-外泌体保护”三大环节，最大限度提高标志物的“回收率”和“完整性”。1血浆分离与组分富集血浆分离是前处理的第一步，关键在于“去除非目标组分”（如红细胞、白细胞、血小板），同时保留目标标志物（如ctDNA、外泌体）。1血浆分离与组分富集1.1差速离心法：基于沉降速率的分离差速离心通过“低速-高速”组合分离不同大小组分：先500×g离心10min去除红细胞和白细胞，再16000×g离心10min去除血小板和细胞碎片，最后100000×g离心70min沉淀外泌体。该方法的优点是操作简单、成本低，但缺点是回收率较低（外泌体回收率约50%-60%），且高速离心可能导致外泌体聚集。我们在肝癌研究中优化了离心参数（将第二次离心时间延长至15min），使血小板去除率从85%提升至98%，外泌体回收率提高至65%。1血浆分离与组分富集1.2密度梯度离心：提高组分纯度密度梯度离心利用不同密度介质（如蔗糖、碘克沙醇）分离组分，使目标标志物在特定密度区带富集。例如，外泌体在碘克沙醇密度梯度（1.10-1.18g/mL）中形成单一区带，纯度较差速离心提高3倍以上。但该方法操作复杂、耗时长（需2-3小时），且可能因密度梯度扩散导致组分交叉。我们建议在“高纯度要求”的场景（如外泌体蛋白标志物检测）中使用密度梯度离心，而在“常规检测”中优先选择差速离心。1血浆分离与组分富集1.3免疫磁珠分选：基于抗原特异性的捕获免疫磁珠法通过包被特异性抗体（如抗EpCAM抗体、抗HER2抗体）捕获目标标志物，具有“高特异性”和“高回收率”优点。例如，抗EpCAM磁珠可捕获上皮来源CTCs（回收率>80%），抗CD63磁珠可捕获外泌体（回收率>70%）。但该方法存在“表位依赖性”：若CTCs发生EMT（EpCAM表达下调），会导致捕获率下降50%以上。因此，建议采用“多抗体组合”（如抗EpCAM+抗HER2+抗EGFR）捕获异质性CTCs，或在EMT富集后使用间质细胞标志物（如抗Vimentin抗体）进行补充捕获。2核酸提取与纯化优化核酸（ctDNA、RNA）是液体活检中最常用的标志物，其提取效率直接影响检测灵敏度。优化需聚焦“回收率-纯度-完整性”三大指标，根据标志物类型选择合适的方法。2核酸提取与纯化优化2.1ctDNA提取：磁珠法优于硅胶膜柱法ctDNA浓度低（ng/mL级）、片段短（<200bp），对提取方法的“回收率”要求极高。硅胶膜柱法（如QIAampCirculatingNucleicAcidKit）依赖高盐低pH结合核酸，但小片段ctDNA易流失；磁珠法（如MagMAXCell-FreeDNAIsolationKit）通过表面修饰的磁珠（如羧基修饰）结合核酸，可高效捕获小片段ctDNA（回收率>80%）。我们在肺癌早筛项目中对比了两种方法，发现磁珠法对<100bp的ctDNA片段回收率比硅胶膜柱法高25%，且重复性更好（CV值<10%vs15%）。2核酸提取与纯化优化2.2RNA提取：添加RNase抑制剂是关键循环RNA（如miRNA、circRNA）对RNase极度敏感，提取过程中需全程添加RNase抑制剂（如SUPERase-In™）。传统有机溶剂提取法（如Trizol）虽可高效提取RNA，但操作步骤多（需氯仿异丙醇沉淀），易导致RNA降解；硅胶膜柱法（如miRNeasyKit）通过优化裂解液（含胍盐和β-巯基乙醇）和洗涤步骤，可在简化操作的同时保持RNA完整性。我们在乳腺癌研究中发现，使用添加RNase抑制剂的裂解液后，miRNA提取量较未添加组提高40%，且降解率降低至5%以下。2核酸提取与纯化优化2.3提取过程稳定性控制：内标与质控样本为监控提取效率，建议添加“外源性内标”（如噬菌体λDNA、合成circRNA）或“内源性内标”（如ACTB基因、miR-16-5p）。外源性内标不受样本状态影响，可客观反映提取回收率（如添加100copies/μL的λDNA，若最终回收率为80%，则表明提取损失20%）；内源性内标则可监控样本质量（如miR-16-5p在降解样本中表达量显著下降）。此外，每批次提取需设置“阴性对照”（无样本提取液）和“阳性对照”（含已知量核酸的溶液），避免试剂污染导致的假阳性。3外泌体完整性保护外泌体的稳定性依赖于“囊膜完整性”和“内容物活性”，前处理需避免物理损伤和生化降解。3外泌体完整性保护3.1保存液添加：“囊膜保护剂+蛋白酶抑制剂”外泌体保存液需包含“囊膜保护剂”（如胆固醇、磷脂）维持囊膜流动性，“蛋白酶抑制剂”（如PMSF、AEBSF）防止蛋白降解，“EDTA”抑制核酸酶。我们在胶质瘤研究中开发了“外泌体专用保存液”（含1%胆固醇、0.1mMAEBSF、5mMEDTA），使外泌体在4℃保存7天后，囊膜完整率仍保持>85%（透射电镜观察），而PBS保存组完整率仅40%。3外泌体完整性保护3.2快速冻融程序：“慢冻快融”减少冰晶损伤冻融过程中形成的冰晶会刺破外泌体囊膜，导致内容物释放。建议采用“-80℃预冷-快速冷冻（液氮，1min内）-缓慢解冻（4℃，30min）”的程序：快速冷冻减少冰晶数量，缓慢解冻避免冰晶生长。我们在胰腺癌研究中对比了不同冻融程序，发现“慢冻快融”组外泌体回收率比“快速冻融”组高30%，且miRNA降解率降低15%。3外泌体完整性保护3.3纯化后即时检测：“避免长期保存”原则外泌体纯化后，其稳定性会显著下降（因失去血浆中保护因子的作用）。因此，建议纯化后24小时内完成检测（如外泌体RNA测序、蛋白Westernblot）；若需长期保存，可加入10%DMSO后-80℃冻存（DMSO可降低冰晶形成）。我们在结直肠癌研究中发现，纯化后加入DMSO的外泌体，在-80℃保存1个月后，PD-L1蛋白表达量较未添加组无显著差异（P>0.05）。04PARTONE检测与分析技术的稳定性提升方案检测与分析技术的稳定性提升方案前处理获得的高质量标志物，需依赖先进的检测技术和分析方法转化为“可解读的信号”。检测过程中的“扩增效率波动”“数据分析偏差”仍会导致结果不稳定，需通过“技术优化”和“算法校正”提升可靠性。1分子检测技术的优化分子检测是标志物“定性/定量”的核心环节，优化需聚焦“灵敏度”“特异性”和“重复性”三大指标。1分子检测技术的优化1.1PCR技术：数字PCR与热启动Taq酶的协同PCR技术（实时荧光PCR、数字PCR）是ctDNA突变检测的主流方法，但存在“扩增效率波动”问题。实时PCR依赖Ct值定量，易受抑制剂（如血红素）影响；数字PCR（dPCR）通过“微滴分区”实现绝对定量，不依赖扩增效率，可减少Ct值波动（变异系数CV值从15%降至5%）。此外，“热启动Taq酶”通过在低温下失活高温下激活，可抑制非特异性扩增（如引物二聚体），提高检测特异性。我们在肺癌EGFR突变检测中，采用dPCR+热启动Taq酶后，突变检测灵敏度从5%提升至0.1%，且重复性显著改善（批内CV<5%，批间CV<10%）。1分子检测技术的优化1.2NGS技术：UMI标记与文库制备优化NGS技术可同时检测多个基因突变，但存在“扩增偏好性”和“测序误差”问题。UMI（UniqueMolecularIdentifier）标记通过为每个原始分子添加随机序列标签，可在后续分析中区分“原始突变”和“扩增/测序误差”，提高低频突变检测准确性（如ctDNA低频突变检出限从5%降至0.1%）。文库制备方面，“转座酶标签技术”（如Tn5转座酶）可同时实现片段化和加接头，减少操作步骤（从5步简化至2步），降低样本损失和降解风险。我们在乳腺癌耐药监测研究中引入UMI技术，使PIK3CA突变检测的一致性从70%（未使用UMI）提升至95%（使用UMI）。1分子检测技术的优化1.3免疫检测技术：流式细胞术与免疫荧光的优化CTCs和外泌体蛋白标志物检测依赖免疫技术，优化需聚焦“抗体特异性”和“信号稳定性”。流式细胞术（FCM）通过多色抗体组合（如CD45-/EpCAM+/CK+）捕获CTCs，但需优化抗体浓度（避免非特异性结合）和固定剂（如4%多聚甲醛优于甲醇，可保持细胞形态）。免疫荧光（IF）则需优化封闭液（含5%BSA的PBS可减少背景信号）和显色时间（DAB显色时间控制在3-5分钟，避免过染）。我们在前列腺癌研究中，采用“CD45-/PSMA+/AR+”抗体组合，使CTCs检出率较传统“EpCAM+”组合提高40%，且假阳性率从15%降至5%。2数据分析的稳定性控制数据分析是“信号转化为结果”的最后一步，其稳定性直接影响临床决策。优化需聚焦“批次效应校正”“参考基因标准化”和“异常值识别”三大环节。2数据分析的稳定性控制2.1批次效应校正：ComBat与SVA算法的应用多中心研究或长时间检测中，不同批次样本因“试剂差异”“仪器漂移”会产生“批次效应”，导致结果不可比。ComBat算法通过“经验贝叶斯”方法调整批次间均值和方差，可有效消除批次效应；SVA（SurrogateVariableAnalysis）则通过识别“隐变量”校正技术偏差。我们在肝癌早筛的多中心研究中，对10个中心的NGS数据采用ComBat校正后，批次间突变频率一致性从60%（未校正）提升至85%（校正）。2数据分析的稳定性控制2.2参考基因标准化：管家基因与内参的选择定量分析（如ctDNA浓度、miRNA表达）需通过参考基因标准化，消除样本间“加样误差”“提取效率差异”。管家基因（如ACTB、GAPDH）因“在多数组织中稳定表达”被广泛使用，但需验证其在肿瘤患者中的稳定性（如晚期肿瘤患者因组织坏死，ACTB表达可能上调）。内参基因（如miR-16-5p、SNORD48）则需通过“稳定性软件”（如NormFinder、geNorm）筛选，确保在不同肿瘤类型和分期中表达稳定。我们在结直肠癌研究中，通过NormFinder筛选出miR-16-5p作为最佳内参，使miR-21的标准化表达量在不同样本间的CV值从20%降至8%。2数据分析的稳定性控制2.3机器学习辅助：异常值识别与数据清洗异常样本（如降解样本、污染样本）会导致数据偏差，需通过机器学习算法识别。随机森林算法可通过“片段化模式”（如ctDNA长度分布）、“内标回收率”等特征识别降解样本；支持向量机（SVM）则可通过“主成分分析（PCA）”识别批次异常样本。我们在肺癌研究中，构建了基于“ctDNA片段化模式+内标回收率”的随机森林模型，可准确识别90%的降解样本，剔除后使突变检测一致性提升25%。3质量控制体系的建立质量控制（QC）是检测稳定性的“最后一道防线”，需贯穿“样本-试剂-仪器-人员”全流程。3质量控制体系的建立3.1室内质控（IQC）：每批次样本的“健康监测”IQC需设置“阴性对照”（健康人血浆）、“阳性对照”（含已知突变序列的血浆）和“临界值对照”（接近检测限的样本）。阴性对照用于监控试剂污染（如无突变信号）；阳性对照用于监控检测灵敏度（如突变检出率>95%）；临界值对照用于监控检测下限（如0.1%突变频率的检出率>80%）。我们在日常检测中，每96个样本设置1个阳性对照和1个阴性对照，若阳性对照未检出或阴性对照出现阳性，需暂停检测并排查原因。3质量控制体系的建立3.2室间质评（EQA）：跨实验室结果比对EQA通过参与国际/国内能力验证（如CAP、EMQN、国家卫健委临检中心），与其他实验室比对结果，发现系统性误差。我们在2022年参加的ctDNA突变检测EQA中，与“金标准”结果的一致性为92%，主要误差来源于“低频突变漏检”（0.5%突变频率样本漏检1例），后通过优化UMI分析算法，将一致性提升至98%。3质量控制体系的建立3.3人员培训与操作规范：减少“人为误差”人员操作是QC的重要环节，需通过“标准化培训”和“操作规范（SOP）”减少误差。例如，采血人员需培训“采血量准确”（误差<5%）、“混匀方式规范”（颠倒采血管8次）；检测人员需培训“移液枪校准”“离心参数设置”等。我们建立了“操作人员资质认证”制度，只有通过理论和实操考核的人员才能独立操作，使因人为操作导致的QC不合格率从8%降至1%。05PARTONE标准化体系建设与质量控制标准化体系建设与质量控制技术的进步和流程的优化，最终需要通过标准化体系来落地，确保不同实验室、不同时间点的检测结果具有可比性。标准化体系是液体活检从“研究工具”向“临床产品”转化的“基石”。1参考物质与标准品的开发参考物质（RM）是标准化的“标尺”，用于校准检测系统、评估方法性能。1参考物质与标准品的开发1.1合成参考品：模拟真实样本的“人工标尺”合成参考品通过人工合成目标标志物（如ctDNA突变序列、外泌体模拟颗粒），具有“组分明确、浓度可控”优点。例如，人工合成的EGFRT790M突变ctDNA（浓度0.1%-10%）可用于校准dPCR检测下限；脂质体包裹的miRNA模拟外泌体可用于评估外泌体回收率。我们在肺癌研究中使用合成参考品校准dPCR系统，使不同仪器间的突变浓度差异从20%降至5%。1参考物质与标准品的开发1.2天然参考品：接近临床场景的“真实标尺”天然参考品来源于健康人或肿瘤患者的血浆（如混合健康人血浆、肿瘤患者阳性血浆），具有“基质复杂、接近真实”优点。但其局限性在于“组分不均一”（如不同健康人血浆中cfDNA背景差异大），需通过多中心混合和标准化处理（如过滤去除大分子蛋白）。我们联合5家中心制备了“肝癌ctDNA天然参考品”，经10家实验室验证，突变频率的CV值<15%。1参考物质与标准品的开发1.3国际标准品：推动全球结果可比性国际标准品（如WHO发布的ctDNA参考标准品NIBSCcode:20/136）可统一全球检测标准，减少“地域差异”。我们使用WHO标准品校准了本实验室的NGS检测流程，使与国际多中心研究的突变检出率一致性从80%提升至95%。2全流程质量控制流程全流程QC需覆盖“样本采集-前处理-检测分析-结果报告”各环节，建立“可追溯、可评估”的质量管理体系。2全流程质量控制流程2.1采集环节QC：记录“关键参数”采集环节需记录“采血时间、抗凝剂类型、离心时间/速度、保存温度”等关键参数，形成“样本档案”。我们开发了“液体活检样本采集电子记录系统”，自动采集采血秤、离心机、温度记录仪的数据，确保信息真实可追溯。2全流程质量控制流程2.2前处理环节QC：监控“回收率与纯度”前处理环节需通过“内标回收率”“核酸纯度（A260/A280比值）”等指标监控质量。例如，ctDNA提取的内标回收率需>70%，A260/A280比值需在1.8-2.0之间（表明无蛋白污染）；外泌体提取需通过“透射电镜观察囊膜形态”“NTA检测粒径分布”验证完整性。2全流程质量控制流程2.3检测环节QC：控制“仪器与试剂”检测环节需定期校准仪器（如移液器、PCR仪、测序仪），监控试剂批间差异（如同一试剂不同批次的扩增效率差异需<5%）。我们建立了“试剂性能验证”制度，新批号试剂使用前需与旧批号比对，确保检测结果一致。3标准化操作规范（SOP）制定SOP是标准化的“操作手册”，需明确各环节的“步骤、参数、注意事项”，确保不同人员操作的一致性。3标准化操作规范（SOP）制定3.1采集SOP：明确“每一步怎么做”采集SOP需规定：采血管类型（如EDTA管或BCT管）、采血量（10mL全血）、混匀方式（颠倒采血管8次）、离心参数（2000×g，10min，4℃）、二次离心参数（16000×g，10min，4℃）、分装体积（0.5mL/管）、保存温度（-80℃）。我们编制的《液体活检样本采集SOP》已在本院12个科室推广，使样本不合格率从12%降至3%。3标准化操作规范（SOP）制定3.2运输SOP：确保“全程温度可控”运输SOP需规定：运输温度（干冰维持<-60℃）、运输时间（不超过24小时）、包装要求（保温箱+干冰+温度记录仪）、紧急情况处理（如温度异常时立即联系实验室）。我们与专业冷链物流公司合作，建立了“样本运输实时监控系统”，可实时查看样本位置和温度，确保运输过程稳定。3标准化操作规范（SOP）制定3.3检测SOP：细化“仪器参数与数据分析”检测SOP需规定：仪器开机预热时间（如PCR仪需预热30分钟）、反应体系配置（如dPCR反应体系为20μL，含模板ctDNA5μL）、扩增程序（如95℃预变性10min，40个循环的95℃变性15s、60℃退火60s）、数据分析参数（如UMI去噪阈值、突变calling标准）。我们的《ctDNA突变检测NGSSOP》已通过ISO15189认证，成为行业参考。06PARTONE未来展望与挑战未来展望与挑战液体活检标志物稳定性优化是一个“持续迭代”的过程，随着新技术、新方法的出现，未来将在“稳定化材料”“多组学整合”“AI预测”等方面取得突破。