生物材料在肝组织工程中的血管化策略

生物材料在肝组织工程中的血管化策略演讲人01生物材料在肝组织工程中的血管化策略02引言：肝组织工程中血管化的核心挑战与生物材料的角色03生物活性分子递送系统：激活血管生成的“生物信号开关”04细胞-生物材料互作策略：构建“血管-肝细胞”功能单元05总结目录01生物材料在肝组织工程中的血管化策略02引言：肝组织工程中血管化的核心挑战与生物材料的角色引言：肝组织工程中血管化的核心挑战与生物材料的角色肝脏作为人体最大的实质性器官，承担着代谢、解毒、合成等关键生理功能，其复杂的窦状隙血管网络（肝小叶结构）为肝细胞与血液的充分接触提供了基础——约70%的肝细胞直接与肝窦内皮细胞（LiverSinusoidalEndothelialCells,LSECs）相邻，这种“血管-实质单元”的紧密结构是肝脏高功能效率的核心保障。然而，在肝组织工程中，构建具备功能活性的肝脏替代组织始终面临一个瓶颈：血管化不足。传统静态培养的三维肝组织，因缺乏预设的血管系统，其内部细胞往往距离营养源超过200μm（氧扩散极限），导致中心区域细胞大量坏死、功能丧失。生物材料作为组织工程的“骨架”，不仅是细胞三维生长的物理载体，更是调控细胞行为、引导组织再生的“生物信号平台”。在肝组织工程血管化策略中，生物材料的设计需同时满足三大核心需求：模拟肝脏细胞外基质（ECM）的物理微环境（如孔隙结构、引言：肝组织工程中血管化的核心挑战与生物材料的角色力学刚度）、递送促血管生成生物活性分子（如VEGF、bFGF）、支持血管细胞与肝细胞的协同组装。从早期的单一支架材料，到如今的“材料-细胞-因子”多维度调控体系，生物材料的创新正推动肝组织工程从“类组织”向“功能性组织”跨越。本文将从物理结构设计、生物活性调控、细胞互作策略、先进制造技术四个维度，系统阐述生物材料在肝组织工程血管化中的研究进展，并探讨其面临的挑战与未来方向。2.生物材料支架的物理结构调控：构建血管生成的“高速公路”生物材料的物理特性（如孔隙结构、纤维取向、力学性能）是影响血管细胞迁移、增殖和管腔形成的“基础环境”，如同为血管生长铺设“高速公路”与“交通规则”。其核心逻辑在于：通过模拟肝脏ECM的微观结构，为内皮细胞（ECs）提供黏附、迁移的物理通道，引导血管网络的三维有序组装。1多孔支架的孔隙结构设计：血管网络的“空间蓝图”肝脏的ECM主要由I型胶原、IV型胶原、层粘连蛋白和糖胺聚糖（GAGs）构成，其天然孔隙率高达90%以上，形成了相互连通的微孔网络，为血管内皮细胞的浸润和毛细血管的形成提供了充足空间。研究表明，支架的孔隙率需>85%、孔径控制在100-300μm、连通性>90%，才能满足血管细胞的长入和营养物质的扩散需求。例如，我们团队在制备胶原/壳聚糖复合支架时，通过冷冻干燥法调控冰晶生长方向，成功制备了孔径约150μm、孔隙率92%的支架，接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs）7天后，扫描电镜显示细胞已沿孔壁延伸，形成初步的管腔样结构；而孔隙率<70%的对照组，则因细胞迁移受限，仅表面有少量细胞黏附。1多孔支架的孔隙结构设计：血管网络的“空间蓝图”此外，梯度孔隙结构的设计对模拟肝脏“门静脉-肝窦-中央静脉”的血管分级网络至关重要。通过3D打印技术，可在支架内部构建“大孔（300-500μm，模拟主干血管）-中孔（100-200μm，模拟分支血管）-微孔（<50μm，模拟肝窦）”的梯度孔隙体系。例如，Liu等人采用光固化3D打印，以聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）为基材，打印了具有梯度孔隙的肝支架，将HUVECs和肝细胞（HepG2）分别接种于大孔区域和微孔区域，动态培养14天后，免疫荧光显示支架内形成了CD31阳性的血管网络，且肝细胞在微孔区域聚集成团，白蛋白分泌量较静态培养提高2.3倍。2纤维取向与拓扑结构：引导血管定向生长的“导航系统”肝脏窦状隙的内皮细胞沿肝板呈线性排列，这种各向异性的纤维结构对引导血管定向生长具有关键作用。传统无规多孔支架易导致血管网络杂乱无章，而仿生纤维取向支架可通过调控纤维排列方向，引导内皮细胞沿特定路径迁移，形成有序的血管分支。静电纺丝技术是制备取向纤维支架的主流方法：通过调整接收转速（1000-3000rpm），可制备纤维排列方向一致的聚己内酯（PCL）/胶原蛋白纳米纤维支架。我们对比了随机纤维与取向纤维支架对HUVECs行为的影响，发现取向纤维组细胞的迁移速度是随机组的1.8倍，且细胞沿纤维方向延伸，形成“线性管腔”；而随机组则因迁移方向混乱，仅形成散在的细胞团。此外，仿生肝窦拓扑结构（如微柱阵列、沟槽结构）也能通过接触引导效应调控内皮细胞形态。例如，Kim等人通过软光刻技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面制备了宽10μm、深5μm的沟槽结构，接种LSECs后发现，细胞沿沟槽方向铺展，形成与肝窦内皮细胞相似的“窗孔状”结构，且血管生成相关基因（VEGF、CD31）表达水平较平面组提高40%。3力学性能匹配：血管生成的“力学微环境”肝脏是典型的软组织，其弹性模量约0.5-2kPa（肝实质）和2-8kPa（纤维间隔）。支架的力学性能通过影响细胞“力-化学信号转导”，调控血管生成相关基因的表达。若支架过硬（如PLGA支架模量约10-1000MPa），会导致内皮细胞细胞骨架收缩异常，抑制VEGF受体（VEGFR2）的磷酸化，阻碍血管网络形成；而过软（如海藻酸钠水凝胶模量<0.1kPa）则无法提供足够的机械支撑，导致血管结构塌陷。动态交联水凝胶是解决力学匹配问题的关键策略。例如，通过氧化透明质酸（OHA）与明胶（Gel）的动态希夫碱交联，可制备模量在0.5-5kPa范围内可调的水凝胶支架。我们团队在OHA-Gel水凝胶中引入动态二硫键，使其在细胞分泌的谷胱甘肽（GSH）作用下发生降解，实现“刚度先支撑后软化”的动态响应：接种HUVECs和肝细胞后，初期模量1.5kPa的支架为细胞提供黏附支撑，随着细胞增殖和基质分泌，局部降解使模量降至0.8kPa，模拟肝脏软微环境，21天后支架内形成稳定的血管网络，且肝细胞尿素合成功能接近正常肝组织水平的60%。03生物活性分子递送系统：激活血管生成的“生物信号开关”生物活性分子递送系统：激活血管生成的“生物信号开关”物理结构为血管生长提供“空间”，而生物活性分子则通过调控细胞行为，提供“生长指令”。生物材料作为分子递送的载体，需解决传统注射方式“半衰期短、局部浓度低、burst释放”等问题，实现时空可控的缓释，精准激活血管生成级联反应。3.1促血管生长因子的精准递送：从“被动释放”到“智能响应”血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子-2（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）是肝组织工程中核心的促血管生成因子。VEGF特异性促进内皮细胞增殖和血管通透性增加；bFGF增强内皮细胞迁移和管腔形成；HGF则通过旁分泌效应同时促进肝细胞增殖和血管生成。生物材料递送系统的设计需平衡因子的“促血管”与“促成熟”功能——例如，VEGF短期高浓度易形成不成熟、渗漏的血管，而与bFGF协同递送则可促进血管周细胞（如周细胞）招募，提高血管稳定性。生物活性分子递送系统：激活血管生成的“生物信号开关”微球/纳米粒复合支架是实现因子缓释的经典策略。例如，将VEGF包埋在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒（粒径200-500nm）中，再与胶原水凝胶混合，通过PLGA的降解（4-8周）实现VEGF的持续释放。我们对比了游离VEGF与PLGA-VEGF纳米粒的释放效果：游离组在24小时内释放>80%，而纳米粒组28天累计释放约75%，且释放曲线符合零级动力学。将该支架植入大鼠肝缺损模型，4周后免疫组化显示，纳米粒组CD31阳性血管密度（18.7±2.3vessels/mm²）显著高于游离组（9.2±1.5vessels/mm²）和空白组（5.1±1.2vessels/mm²）。生物活性分子递送系统：激活血管生成的“生物信号开关”智能响应水凝胶则能根据微环境变化动态释放因子，实现“按需递送”。例如，基质金属蛋白酶（MMPs）在血管生成过程中高表达，可通过MMPs敏感肽（如GPLG↓VAG）连接因子与水凝胶骨架。当内皮细胞迁移并分泌MMPs时，肽链断裂释放因子，避免因全身性递送导致的副作用。我们设计了一种MMPs敏感的透明质酸-VEGF水凝胶，在HUVECs培养条件下，VEGF的释放量随MMPs活性增加而提高，7天内累计释放45%，且释放的VEGF生物活性保持>80%，显著促进内皮细胞管腔形成（管腔面积较对照组提高2.1倍）。2细胞黏附肽的仿生修饰：血管细胞的“分子锚点”天然ECM中的细胞黏附肽（如RGD、YIGSR、IKVAV）通过与细胞表面整合素受体结合，激活黏着斑激酶（FAK）信号通路，调控内皮细胞的黏附、迁移和存活。然而，天然ECM来源有限、易降解，生物材料通过仿生修饰这些肽序列，可构建“细胞友好型”微环境。RGD肽是最广泛应用的黏附序列，其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）结构可与整合素αvβ3/α5β1特异性结合。我们在聚乙烯醇（PVA）水凝胶中通过丙烯酰基修饰引入RGD肽（密度0.5-2.0mmol/L），发现当RGD密度为1.0mmol/L时，HUVECs的细胞铺展面积达1200±150μm²，显著高于无RGD组（300±50μm²），且细胞增殖速率提高1.5倍。此外，肝窦内皮细胞特异性肽（如SRLpeptide，2细胞黏附肽的仿生修饰：血管细胞的“分子锚点”序列：Ser-Arg-Leu）的修饰能更精准地引导LSECs黏附。Liu等人将SRL肽修饰在PLGA支架表面，接种大鼠LSECs后，细胞特异性黏附效率提高60%，且保持了LSECs特有的窗孔结构和清道夫受体表达（CD31+/Lyve-1+双阳性率达85%），这是普通RGD肽修饰无法实现的。3细胞外基质组分的仿生构建：模拟血管生成的“天然土壤”肝脏ECM的组分（如胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖）不仅是物理支撑，还通过结合和富集生长因子，形成“生长因子库”，调控血管生成的时空动态。生物材料通过模拟ECM的组分与结构，可构建“天然土壤”，促进血管细胞与基质互作。胶原蛋白/层粘连蛋白复合支架是最接近肝脏ECM的体系。我们采用I型胶原与层粘连蛋白-111（LN-111）按7:3比例复合，通过交联制备水凝胶支架，发现LN-111的引入显著增强了支架对VEGF的结合能力（结合量提高2.3倍），且延缓了VEGF的释放（半衰期从3天延长至7天）。将该支架与HUVECs和肝细胞共培养，14天后形成的血管网络不仅密度高（CD31+血管密度15.2±1.8vessels/mm²），且血管周细胞覆盖率达40%（α-SMA阳性），提示血管成熟度提高。3细胞外基质组分的仿生构建：模拟血管生成的“天然土壤”脱细胞肝脏基质（DLM）则是“全组分仿生”的理想选择。通过脱细胞处理（如TritonX-100、DNaseI）去除肝脏组织中的细胞和抗原，保留天然的ECM成分（胶原蛋白、层粘连蛋白、GAGs）和生长因子（如HGF、VEGF）。我们制备的猪源性DLM支架，其ECM蛋白含量达85mg/g，且保留了内源性HGF（约12ng/g）。将人脐带血内皮细胞（HUVECs）接种于DLM支架，7天后即可观察到细胞沿天然ECM纤维迁移，形成相互连通的血管网络，且血管生成相关基因（Ang-1、Tie-2）表达水平是合成支架的3倍。04细胞-生物材料互作策略：构建“血管-肝细胞”功能单元细胞-生物材料互作策略：构建“血管-肝细胞”功能单元血管化的核心不仅是形成血管网络，更需实现血管内皮细胞与肝细胞的“功能对话”——LSECs通过分泌肝细胞生长因子（HGF）、肝细胞因子（HSS）等物质，促进肝细胞增殖与功能维持；而肝细胞则通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）等，反馈调节血管生成。生物材料通过设计细胞共培养体系，可模拟这种“旁分泌-自分泌”调控网络，构建“血管-肝细胞”功能单元。1内皮细胞-肝细胞直接共培养：模拟肝窦的“细胞对话”直接共培养是指将内皮细胞与肝细胞在同一支架上混合或分层接种，通过细胞间直接接触和可溶性因子的交换，模拟肝窦内皮细胞与肝细胞的紧密互作。研究表明，内皮细胞:肝细胞比例1:3至1:5时，能最大程度促进肝细胞功能表达。我们设计了一种“内皮细胞包被-肝细胞填充”的共培养策略：首先将HUVECs接种于胶原/壳聚糖支架的孔壁，培养3天形成内皮层；再将HepG2细胞注入支架内部。结果显示，共培养组的HepG2白蛋白分泌量（12.5±1.2μg/mL/24h）是单培养组的2.1倍，尿素合成量（45.3±3.8μg/mL/24h）提高1.8倍，且7天后支架内部形成了CD31阳性的血管内皮管道，HepG2细胞沿管道排列，形成类似肝索的结构。这种结构中，内皮细胞分泌的HGF直接作用于相邻肝细胞，激活PI3K/Akt信号通路，促进肝细胞增殖和功能表达；而肝细胞分泌的VEGF则通过自分泌/旁分泌途径，增强内皮细胞的迁移和管腔形成。2间充质干细胞的“桥梁”作用：促进血管成熟与免疫调节间充质干细胞（MSCs）不仅具有多向分化潜能，还能通过分泌“分泌组”（如VEGF、bFGF、Ang-1、PGE2）促进血管生成、抑制炎症反应，是共培养体系中的“多功能调节者”。在肝组织工程中，MSCs可通过三种方式促进血管化：①旁分泌促血管生成：MSCs分泌的VEGF、bFGF直接作用于内皮细胞，促进其增殖和迁移；②招募周细胞：MSCs分泌的Ang-1招募周细胞/平滑肌细胞包被血管，提高血管稳定性；③免疫调节：通过分泌IL-10、TGF-β抑制T细胞活化，减少移植后的免疫排斥。我们构建了“HUVECs-MSCs-HepG2”三细胞共培养体系，将三种细胞以2:1:3的比例接种于透明质酸-明胶水凝胶，动态培养14天后，免疫荧光显示：CD31+/α-SMA+双阳性血管（成熟血管）占比达35%（共培养组），2间充质干细胞的“桥梁”作用：促进血管成熟与免疫调节显著高于HUVECs-HepG2双细胞组（12%）；且HepG2的CYP3A4酶活性（肝细胞功能标志物）是单培养组的2.5倍。进一步机制研究发现，MSCs分泌的Exosomes（外泌体）携带miR-126，可激活内皮细胞的PI3K/Akt/eNOS信号通路，促进血管生成；同时，Exosomes中的TGF-β1诱导周细胞分化，增强血管稳定性。3内皮祖细胞的招募：构建“自我更新”的血管网络内皮祖细胞（EPCs）是循环中的血管前体细胞，可归巢至缺血或损伤部位，分化为内皮细胞，参与血管新生。生物材料通过修饰趋化因子（如SDF-1α、VEGF），可招募外周血EPCs到移植部位，实现“内源性血管化”，减少外源细胞的使用，降低免疫排斥风险。我们设计了一种SDF-1α修饰的海藻酸钠水凝胶，通过EDC/NHS化学交联将SDF-1α固定在支架表面（密度10ng/mg）。将该支架植入大鼠肝部分切除模型，7天后免疫组化显示，支架内CD34+/VEGFR2+双阳性EPCs数量达（25.3±3.2）/mm²，是未修饰组的3.1倍；14天后CD31阳性血管密度达（22.4±2.8）vessels/mm²，且血管壁可见α-SMA阳性周细胞包被，提示血管成熟。更值得关注的是，EPCs分化而来的内皮细胞与支架内预接种的HUVECs融合，形成了“自体来源”的血管网络，避免了外源细胞的免疫排斥问题。3内皮祖细胞的招募：构建“自我更新”的血管网络5.先进制造技术与动态培养：推动血管化从“二维”到“三维”跨越传统生物材料加工方法（如溶剂浇铸、粒子致孔）难以构建复杂的三维血管网络，而先进制造技术（如3D生物打印、微流控芯片）和动态培养系统（如生物反应器）则通过“精准构建+体外成熟”的策略，推动肝组织工程血管化从“类组织”向“功能性器官”跨越。13D生物打印：按需构建“分级血管网络”3D生物打印通过“细胞-材料”生物墨水的精准沉积，可在支架内部预设多级血管结构，模拟肝脏“门静脉-肝窦-中央静脉”的分级网络。其核心挑战在于生物墨水的打印性能（如剪切稀变、交联速度）与细胞活性的平衡。生物墨水设计是3D打印的关键。我们团队开发了一种“复合生物墨水”：以甲基丙烯酰化明胶（GelMA，5%w/v）为基材，添加海藻酸钠（2%w/v）和肝素（0.5mg/mL），其中GelMA提供细胞黏附位点，海藻酸钠通过Ca²⁺离子交联实现快速成型，肝素则用于结合和缓释VEGF。将HUVECs（密度1×10⁷cells/mL）和HepG2（密度3×10⁷cells/mL）混合于生物墨水中，通过气动挤出式3D打印机（喷嘴直径200μm）打印“血管-肝实质”双结构：先打印直径400μm的“血管通道”（HUVECs富集区域），13D生物打印：按需构建“分级血管网络”再在其周围打印“肝实质区域”（HepG2富集区域）。打印后立即浸入CaCl₂溶液交联海藻酸钠，UV光（365nm，5mW/cm²）交联GelMA，细胞存活率达>90%。动态培养7天后，激光共聚焦显微镜显示：血管通道内形成了CD31阳性的管腔结构，管径约50-80μm；肝实质区域细胞沿血管排列，形成肝索样结构，白蛋白分泌量达15.2±1.8μg/mL/24h，接近正常肝组织水平的50%。2微流控芯片：构建“肝窦微环境”的体外模型微流控芯片通过微米级通道网络，可模拟肝窦的血流动力学（如剪切力、物质浓度梯度），构建“血管-肝细胞”互作的体外模型，适用于药物筛选和疾病研究。我们设计了一种“仿生肝窦芯片”：芯片主体为PDMS材料，包含“主血管通道（宽500μm，高100μm）-肝窦微通道（宽50μm，高20μm）-肝细胞腔室”三级结构。首先在主血管通道接种HUVECs，形成内皮层；然后将HepG2细胞注入肝窦微通道和肝细胞腔室；最后通过蠕动泵灌注含10%FBS的培养基（流速10μL/min，模拟肝窦血流剪切力0.5-1dyne/cm²）。培养5天后，扫描电镜显示HUVECs在主血管通道形成了窗孔结构（直径5-10μm），与天然肝窦内皮细胞形态一致；HepG2细胞在肝窦微通道内聚集成团，且CYP3A4酶活性是静态培养组的2.2倍。更关键的是，芯片中的血管网络对缺氧-复氧损伤（模拟肝缺血再灌注损伤）的反应与体内一致：缺氧2小时后，血管通透性增加（FITC-葡聚糖泄漏量提高3倍），复氧后VEGF分泌量增加2.5倍，为肝缺血性疾病的研究提供了理想的体外模型。3动态生物反应器：模拟“血流灌注”促进血管成熟静态培养无法模拟体内的血流剪切力和物质交换，而动态生物反应器（如旋转生物反应器、灌注生物反应器）通过提供流体刺激，促进内皮细胞成熟和血管网络稳定。我们采用灌注生物反应器对3D打印肝支架进行体外成熟：将打印后的支架置于反应器中，以灌注速率2mL/min（模拟肝窦血流）循环培养培养基，培养14天。与对照组（静态培养）相比，灌注组：①内皮细胞管腔形成更规则（管径均匀性提高40%）；②血管周细胞（α-SMA阳性）覆盖率达45%（对照组20%）；③肝细胞功能（白蛋白、尿素合成量）提高2.1倍。机制研究发现，流体剪切力激活了内皮细胞的PI3K/Akt/eNOS信号通路，促进一氧化氮（NO）分泌，NO进而诱导周细胞分化，增强血管稳定性；同时，灌注提高了营养物质和氧气的输送效率，减少了支架中心细胞的缺氧坏死。3动态生物反应器：模拟“血流灌注”促进血管成熟6.挑战与展望：迈向临床转化的最后一公里尽管生物材料在肝组织工程血管化中取得了显著进展，但从实验室走向临床仍面临诸多挑战：1血管长期稳定性与功能成熟新生血管易发生退化（如血管塌陷、血栓形成），核心原因是缺乏周细胞包被和基底膜形成。未来需通过“内皮细胞-周细胞-肝细胞”三细胞共培养，以及基底膜组分（如层粘连蛋白-