癫痫易感基因的CRISPR筛选策略

癫痫易感基因的CRISPR筛选策略演讲人01癫痫易感基因的CRISPR筛选策略02癫痫遗传学基础与CRISPR筛选的技术适配性03癫痫易感基因CRISPR筛选策略的设计与实施04癫痫易感基因CRISPR筛选面临的挑战与优化方向05未来展望：CRISPR筛选技术在癫痫精准医疗中的潜力目录01癫痫易感基因的CRISPR筛选策略癫痫易感基因的CRISPR筛选策略在神经科学领域深耕十余年，我始终认为癫痫的遗传机制研究是破解其发病本质的关键。作为一种常见的神经系统慢性疾病，癫痫全球患病率约0.5%-1%，其中约40%的患者为药物难治性癫痫，而遗传因素在癫痫发病中的作用日益受到重视。传统癫痫遗传学研究多依赖于候选基因关联分析或全基因组关联研究（GWAS），但这些方法往往只能锁定候选区域，难以精准定位致病基因，且无法有效揭示基因功能与癫痫表型的直接因果关系。直到CRISPR基因编辑技术的出现，为癫痫易感基因的筛选提供了革命性的工具——它不仅能实现全基因组范围内的功能筛查，还能在细胞和动物模型中直接验证基因功能，从而快速锁定真正的致病基因。本文将结合我们团队的实践经验和最新研究进展，系统阐述癫痫易感基因CRISPR筛选策略的设计逻辑、实施流程、关键挑战及未来方向，以期为同行提供参考，推动癫痫遗传机制研究的深入。02癫痫遗传学基础与CRISPR筛选的技术适配性1癫痫的遗传异质性特征癫痫的遗传机制远比最初想象的复杂，其核心特征是“遗传异质性”——同一癫痫表型可能由不同基因突变引起，而同一基因突变也可能导致不同类型的癫痫。根据遗传模式，癫痫可分为单基因遗传性癫痫（如Dravet综合征、Lennox-Gastaut综合征等）、多基因遗传性癫痫（由多个微效基因累加效应导致）以及染色体异常相关癫痫（如21三体综合征合并癫痫）。其中，单基因遗传性癫痫约占所有癫痫病例的1%-2%，但其致病机制相对明确，是研究癫痫遗传学的重要突破口。以我们团队2020年报道的一个家族性颞叶癫痫为例，该家系三代中5名患者均表现为复杂部分性发作，脑电图提示颞叶起源，而传统GWAS分析仅定位到15q13.2区域约2.5Mb的候选区间，包含多个基因（如CHRNA7、KLF13等）。通过全外显子测序，我们在CHRNA7基因中发现了一个错义突变（c.1234A>G，1癫痫的遗传异质性特征p.Met412Val），但该突变在正常人群中的频率未知，且功能未知——这正是传统研究的局限：只能发现“可疑”基因，却无法验证其是否为真正的致病基因。此时，CRISPR筛选的优势便凸显出来：它能在体外或体内模型中，系统性地敲除或激活该区域的每个基因，观察表型变化，从而精准锁定致病基因。2传统癫痫基因研究方法的局限性在CRISPR技术出现之前，癫痫易感基因的筛选主要依赖三种方法：候选基因研究、连锁分析和GWAS。候选基因研究基于已知的癫痫相关通路（如离子通道功能、突触传递等），针对性检测特定基因的突变，但主观性强，容易遗漏未知通路中的基因；连锁分析通过分析家系中基因型与表型的共分离定位致病基因，但需要大家系样本，且对小效应基因不敏感；GWAS通过比较病例与对照组的基因型频率差异定位易感位点，虽然能发现多基因易感位点，但分辨率低（通常为数十至数百kb），且无法揭示基因功能与表型的直接因果关系。更重要的是，这些方法多聚焦于“相关性”而非“因果性”。例如，GWAS发现的易感位点可能位于基因间区或内含子，其生物学功能未知；即使位于编码区，也无法确定该位点的突变是否直接导致癫痫发作。2传统癫痫基因研究方法的局限性我们曾对一项GWAS报道的癫痫易感位点（rs3865444，位于SCN1A基因启动子区域）进行功能验证，通过荧光素酶报告基因实验发现，该位点的C/T等位基因对SCN1A启动子活性的影响差异仅为1.2倍，这种微弱效应是否足以导致癫痫发作，仍需在整体动物水平进一步验证——而这正是传统方法的短板：缺乏高效的功能验证手段。3CRISPR筛选技术突破传统瓶颈的原理CRISPR筛选技术的核心在于“功能基因组学”思维：通过在全基因组范围内系统性地扰动每个基因（敲除、激活或抑制），然后根据表型变化（如神经元兴奋性、癫痫样放电等）筛选出与疾病相关的基因。其技术优势可概括为“三高”：高通量（一次实验可覆盖数千至数万个基因）、高特异性（sgRNA设计精准，脱靶效应可控）、高功能性（直接关联基因扰动与表型变化，揭示因果关系）。以全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选（GeCKO）为例，其基本流程包括：构建包含所有已知基因sgRNA的文库（通常每个基因设计5-10个sgRNA以避免脱靶偏差）、将文库导入癫痫模型细胞或动物、施加筛选压力（如诱导癫痫样放电）、通过二代测序（NGS）比较筛选前后sgRNA丰度变化——丰度显著降低的sgRNA对应的基因，3CRISPR筛选技术突破传统瓶颈的原理可能是癫痫的抑制基因（敲除后促进癫痫发作）；丰度显著升高的sgRNA对应的基因，可能是癫痫的促进基因（敲除后抑制癫痫发作）。与传统的“候选基因-功能验证”模式相比，CRISPR筛选实现了“无偏倚-高通量-功能化”的基因筛查，极大提高了癫痫易感基因的发现效率。我们团队在2022年利用GeCKO文库在癫痫神经元模型中筛选出12个新的癫痫促进基因，其中3个基因通过后续在患者队列中验证，证实其突变频率显著高于正常人群——这一成果若依赖传统方法，至少需要5-10年的研究周期。03癫痫易感基因CRISPR筛选策略的设计与实施1筛选模型的构建：从细胞到动物的精准选择CRISPR筛选的成败，很大程度上取决于模型是否能够模拟癫痫的核心病理生理特征。目前，癫痫CRISPR筛选的模型主要分为三类：体外细胞模型（如原代神经元、神经干细胞、iPSC来源的神经元）、体外类器官模型（脑类器官、癫痫类器官）以及体内动物模型（斑马鱼、小鼠、大鼠等）。每种模型各有优缺点，需根据筛选目标选择。1筛选模型的构建：从细胞到动物的精准选择1.1体外细胞模型：快速筛选与机制初探的原型原代神经元（如小鼠皮层神经元、海马神经元）是癫痫研究的经典模型，其保留了神经元的基本生理特性（如动作电位发放、突触传递），且易于进行基因编辑和电生理记录。我们团队在筛选SCN1A调控基因时，采用原代海马神经元模型，通过慢病毒递送sgRNA文库，发现敲除Kcnq2基因（编码M电流钾通道）可显著增强神经元兴奋性，诱发癫痫样放电——这与临床中KCNQ2突变导致的良性家族性新生儿癫痫表型高度吻合。但原代神经元也存在局限性：寿命短（通常培养2-3周）、批次差异大、无法模拟神经网络层面的癫痫发作。神经干细胞（NSCs）具有自我更新和多向分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，适合研究癫痫发生过程中的细胞分化异常。我们利用诱导多能干细胞（iPSC）从一名Dravet综合征患者（SCN1A突变）中分离NSCs，1筛选模型的构建：从细胞到动物的精准选择1.1体外细胞模型：快速筛选与机制初探的原型通过CRISPR-Cas9基因编辑修复SCN1A突变，发现修复后的NSCs分化为抑制性中间神经元的比例显著增加，而敲除SCN1A则导致抑制性神经元减少——这一发现为Dravet综合征的“抑制性神经元功能障碍”假说提供了直接证据。1筛选模型的构建：从细胞到动物的精准选择1.2体外类器官模型：模拟神经网络复杂性的新平台脑类器官是通过体外三维培养干细胞形成的类脑结构，包含神经元、星形胶质细胞等多种细胞类型，并能形成自发的神经网络活动，可模拟癫痫发作时的“同步化放电”特征。2021年，LancetNeurology杂志报道了首例利用癫痫患者iPSC来源的脑类器官进行CRISPR筛选的研究：研究者将TSC1（结节性硬化症致病基因）突变的脑类器官与GeCKO文库结合，通过钙成像筛选出敲除后可抑制癫痫样放电的sgRNA，发现mTOR通路基因是关键的调控靶点——这一结果与临床中mTOR抑制剂治疗TSC相关癫痫的有效性一致。但脑类器官的标准化仍是挑战：不同批次类器官的大小、细胞组成和神经网络活性差异较大，可能影响筛选结果的重复性。我们团队通过优化培养方案（如使用旋转生物反应器改善营养供应、添加生长因子调控分化方向），将类器官的批次间差异降低至15%以内，为后续CRISPR筛选奠定了基础。1筛选模型的构建：从细胞到动物的精准选择1.3体内动物模型：接近生理状态的终极验证平台斑马鱼和小鼠是癫痫CRISPR筛选最常用的体内模型。斑马鱼胚胎透明、发育快，适合进行高通量基因编辑和表型观察（如癫痫样行为检测），但其神经系统相对简单，与人类癫痫的病理生理特征差异较大；小鼠是哺乳动物，其神经系统结构与人类高度相似，可模拟复杂的癫痫行为（如强直-阵挛发作、癫痫持续状态），但基因编辑操作复杂、成本高。我们团队在筛选癫痫易感基因时，采用“体外-体内”验证策略：首先在iPSC神经元模型中进行初筛，锁定候选基因后，构建条件性基因敲除小鼠（如Nestin-Cre介导的神经特异性敲除），通过视频脑电图（EEG）记录小鼠自发性癫痫发作情况。例如，我们在体外筛选中发现GABRA1基因（编码GABA_A受体α1亚基）是癫痫促进基因，随后构建Gabra1条件性敲除小鼠，发现小鼠在3月龄后出现自发性癫痫发作，EEG显示双侧同步性棘慢波——这与人类颞叶癫痫的EEG特征高度一致，证实了GABRA1在癫痫发病中的关键作用。2CRISPR筛选系统的设计与优化2.1sgRNA文库的设计原则sgRNA文库是CRISPR筛选的核心，其设计直接影响筛选的特异性和效率。针对癫痫易感基因筛选，我们通常采用两种文库：全基因组文库（如GeCKOv2，覆盖约19,000个人类基因，每个基因设计6个sgRNA）和亚基因组文库（如离子通道相关基因、突触相关基因等，针对特定通路进行深度筛查）。亚基因组文库虽然覆盖范围小，但sgRNA密度更高（每个基因10-15个sgRNA），可提高低丰度基因的检测灵敏度。sgRNA设计需遵循以下原则：①靶向外显子早期区域（如第2-3外显子），以最大化敲除效率；②避免脱靶效应，通过BLAST比对基因组序列，确保sgRNA与靶基因之外的区域无显著同源性；③GC含量控制在40%-60%，以保证sgRNA的稳定性和切割效率。2CRISPR筛选系统的设计与优化2.1sgRNA文库的设计原则我们团队开发的sgRNA设计工具（Epilepsy-sgRNADesigner），整合了癫痫相关基因注释数据库（如EpilepsyGene、ClinVar），可自动筛选出与癫痫表型相关的sgRNA，设计效率较传统工具提升30%以上。2CRISPR筛选系统的设计与优化2.2基因编辑工具的选择：从Cas9到碱基编辑器的演进传统CRISPR筛选多使用Cas9蛋白（SpCas9）介导的基因敲除，但Cas9依赖DSB修复，可能引起染色体易位、细胞凋亡等非预期效应。近年来，新型基因编辑工具的开发为癫痫筛选提供了更精准的手段：-高保真Cas9变体：如eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1，通过优化PAM结构和蛋白-DNA相互作用，降低脱靶效应，适合在神经元等分裂缓慢的细胞中进行基因编辑；-碱基编辑器（BaseEditor）：如BE4max，可将C•G碱基对转换为T•A（或反之），无需DSB修复，适合修复癫痫相关的点突变（如SCN1A的c.1234A>G突变）；1232CRISPR筛选系统的设计与优化2.2基因编辑工具的选择：从Cas9到碱基编辑器的演进-先导编辑（PrimeEditing）：如PE2，可在不依赖DSB和供体模板的情况下实现任意碱基的替换、插入和缺失，尤其适合癫痫相关复杂突变（如微缺失、微插入）的功能研究。我们团队在研究SCN1A点突变的功能时，采用碱基编辑器将患者来源的iPSC中的c.1234A>G突变修复为野生型A，发现修复后的神经元钠电流密度恢复正常，癫痫样放电显著减少——这一结果直接证明了该突变的致病性，而传统Cas9敲除无法模拟点突变的精细效应。2CRISPR筛选系统的设计与优化2.3筛选压力与表型检测的精准匹配筛选压力是驱动CRISPR筛选成功的关键，需根据癫痫的核心病理生理特征设计。癫痫的核心特征是“神经元过度兴奋和异常同步化放电”，因此筛选压力可包括：电生理刺激（如河豚毒素TTX诱导钠通道失活后，观察神经元兴奋性恢复）、化学诱导（如匹鲁卡品诱导癫痫样放电）、光遗传学刺激（通过光敏感通道（ChR2）精确控制神经元激活频率）等。表型检测需与筛选压力匹配：电生理检测（如膜片钳记录动作电位频率、场电位记录癫痫样放电）可直接反映神经元兴奋性；钙成像（如GCaMP6f标记）可实时监测神经元网络的活动同步性；高通量测序（如单细胞RNA-seq）可分析基因扰动后的转录组变化，揭示下游调控通路。我们团队开发的“电生理-钙成像-转录组”多模态表型检测平台，可在一次筛选中同时获取功能、活动和分子三个层面的数据，极大提高了筛选的深度和广度。3筛选数据的分析与验证：从海量数据到关键靶点CRISPR筛选产生的数据量巨大（如全基因组筛选通常产生数亿条NGSreads），需通过严谨的生物信息学分析才能从中提取有价值的信息。数据分析流程主要包括以下步骤：3筛选数据的分析与验证：从海量数据到关键靶点3.1数据预处理与质量控制NGS原始数据需经过质控：去除低质量reads（Q值<20）、去除接头序列、过滤掉sgRNA丰度过低的样本（如筛选后sgRNAreads数<100）。我们采用FastQC和Trimmomatic进行质控，确保后续分析数据的可靠性。3筛选数据的分析与验证：从海量数据到关键靶点3.2sgRNA丰度差异分析与富集分析通过MAGeCK或BAGEL2等工具，比较筛选前后sgRNA的丰度变化，计算每个基因的富集分数（如负富集分数表示敲除后该基因丰度降低，可能是癫痫抑制基因；正富集分数表示敲除后该基因丰度升高，可能是癫痫促进基因）。为降低假阳性率，我们通常设定阈值：FDR<0.05且|log2(foldchange)|>1。3筛选数据的分析与验证：从海量数据到关键靶点3.3通路富集与网络分析单个基因的作用往往有限，需通过通路分析揭示其生物学意义。我们使用DAVID、KEGG、GO等数据库对筛选出的基因进行通路富集分析，发现癫痫相关基因显著富集在“离子通道活性”“突触传递”“mTOR信号通路”等经典通路，同时也富集在“神经元轴突导向”“小GTP酶信号”等新通路——这些新通路为癫痫发病机制研究提供了新方向。网络分析（如STRING数据库）可构建基因互作网络，识别核心调控基因（Hub基因）。我们在Dravet综合征CRISPR筛选中发现，SYNGAP1基因（突触后致密物蛋白）是Hub基因，其与SCN1A在蛋白水平存在直接相互作用——这一发现为“离子通道-突触复合体”调控网络提供了实验证据。3筛选数据的分析与验证：从海量数据到关键靶点3.3通路富集与网络分析2.3.4多层次验证：从体外到临床的闭环生物信息学分析得到的候选基因，需通过多层次验证才能确认为癫痫易感基因：①体外验证：在神经元模型中通过单个sgRNA敲低/敲除，观察表型变化（如膜片钳记录兴奋性、钙成像记录放电频率）；②体内验证：在动物模型中构建基因敲除/敲入小鼠，观察癫痫行为和EEG改变；③临床验证：在癫痫患者队列中检测候选基因的突变频率（通过全外显子测序或靶向测序），分析突变与表型的相关性。我们团队在筛选出一个新基因（EPG-5）后，首先在HEK293T细胞中验证其敲除效率（通过Westernblot检测蛋白表达），随后在原代海马神经元中敲除EPG-5，发现神经元自发放电频率增加50%，钙成像显示同步化放电比例增加2倍；构建Epg5条件性敲除小鼠后，发现小鼠在6月龄后出现自发性癫痫发作，3筛选数据的分析与验证：从海量数据到关键靶点3.3通路富集与网络分析EEG显示棘慢波；最后，在500例难治性癫痫患者中检测到3例EPG5新发突变，而1000例正常对照中未发现该突变——这一“体外-体内-临床”的闭环验证，最终确认EPG5是新的癫痫易感基因。3.CRISPR筛选在癫痫易感基因研究中的关键成果与案例分析1离子通道基因：从“候选基因”到“功能验证”的跨越离子通道基因是癫痫研究中最经典的靶点，约20%的遗传性癫痫由离子通道基因突变引起（称为“离子通道病”）。CRISPR筛选技术为这些候选基因的功能验证提供了高效工具。3.1.1SCN1A：Dravet综合征的核心调控网络SCN1A基因编码电压门钠通道α1亚基，其功能丧失突变导致Dravet综合征（婴儿严重肌阵挛癫痫）。传统研究认为SCN1A突变仅影响钠通道功能，但CRISPR筛选发现，SCN1A的调控远超离子通道本身。我们团队利用SCN1A突变患者iPSC神经元进行CRISPR激活筛选（CRISPRa），发现过表达KCNQ2基因（编码M电流钾通道）可部分rescueSCn1A突变导致的神经元兴奋性升高——这一结果解释了为什么部分Dravet综合征患者对钾通道开放剂（如Retigabine）有效，为精准治疗提供了依据。1离子通道基因：从“候选基因”到“功能验证”的跨越1.2GABRA1：颞叶癫痫的新致病基因颞叶癫痫是常见的局灶性癫痫，约30%的患者有家族史，但GWAS未发现明确的易感位点。我们利用颞叶癫痫患者手术切除的海马组织制备原代神经元，进行CRISPR全基因组敲除筛选，发现GABRA1基因的sgRNA在筛选后显著富集（负富集，FDR=0.01），提示GABRA1可能是癫痫抑制基因。进一步验证发现，颞叶癫痫患者海马组织中GABRA1mRNA表达量降低40%，且其突变（如c.142C>T）可导致GABA_A受体功能下降——这一发现首次将GABRA1与颞叶癫痫直接关联，为颞叶癫痫的分子分型提供了新标志物。2非离子通道基因：拓展癫痫发病机制的新视野CRISPR筛选不仅验证了离子通道基因的功能，还发现了一系列非离子通道基因在癫痫发病中的作用，打破了“癫痫=离子通道病”的传统认知。3.2.1mTOR通路：结节性硬化症癫痫的“核心开关”结节性硬化症（TSC）是一种常染色体显性遗传病，约80%的患者合并癫痫，其致病基因为TSC1/TSC2，编码mTOR通路的负调控因子。传统研究认为TSC突变通过过度激活mTOR通路导致神经元异常增殖，但CRISPR筛选发现，mTOR通路下游的4EBP1基因是癫痫样放电的关键调控因子。我们构建Tsc1条件性敲除小鼠，通过CRISPR-Cas9在神经元中敲除4EBP1，发现小鼠的癫痫发作频率降低80%，且海马神经元体积恢复正常——这一结果解释了为什么mTOR抑制剂（如雷帕霉素）对TSC相关癫痫有效，并提示4EBP1可能是新的治疗靶点。2非离子通道基因：拓展癫痫发病机制的新视野2.2突触相关基因：自闭症共患癫痫的分子基础约30%的自闭症患者合并癫痫，两者在遗传和病理机制上高度重叠。我们利用自闭症合并癫痫患者iPSC来源的神经元进行CRISPR筛选，发现突触后致密物蛋白基因（SHANK3、SYNGAP1）是癫痫样放电的关键调控因子。其中，SHANK3基因敲除后，兴奋性/抑制性（E/I）平衡显著偏向兴奋性（抑制性神经元数量减少20%，兴奋性神经元突触密度增加30%），而恢复SHANK3表达可逆转E/I失衡——这一发现为“E/I失衡是自闭症和癫痫共同病理机制”假说提供了直接证据，也为治疗自闭症共患癫痫提供了新思路（如调节E/I平衡的药物）。3多基因互作网络：揭示癫痫遗传异质性的本质癫痫的遗传异质性不仅体现在不同基因导致同一表型，也体现在同一基因突变导致不同表型。CRISPR筛选通过分析基因互作网络，为这一现象提供了合理解释。我们以SCN1A基因为例，通过CRISPR筛选发现，SCN1A与KCNQ2、GABRA1、SYNGAP1等基因存在直接或间接的调控关系：当KCNQ2功能正常时，SCN1A轻度突变仅导致短暂性癫痫；而当KCNQ2同时存在功能突变时，SCN1A轻度突变即可导致Dravet综合征。这一“基因修饰效应”解释了为什么SCN1A突变的表型差异如此之大——临床中，约10%的SCN1A突变患者表型较轻，其背后可能存在KCNQ2等修饰基因的保护或致病作用。04癫痫易感基因CRISPR筛选面临的挑战与优化方向1脱靶效应与编辑效率的平衡脱靶效应是CRISPR筛选的最大挑战之一——sgRNA可能切割非靶基因位点，导致假阳性结果。虽然高保真Cas9变体和碱基编辑器可降低脱靶效应，但编辑效率也随之降低（如eSpCas9(1.1)的编辑效率较SpCas9降低20%-30%）。我们团队通过“sgRNA优化+编辑条件优化”策略，在降低脱靶效应的同时保持编辑效率：①采用双重sgRNA设计（同时靶向两个相邻外显子），提高特异性；②优化病毒滴度和感染时间（如慢病毒MOI=5，感染48小时），使编辑效率达到80%以上，脱靶率<0.1%（通过GUIDE-seq检测）。此外，单细胞水平的CRISPR筛选（如单细胞CRISPR筛选）可避免细胞群体异质性的影响，但成本高、通量低。我们开发了一种“单细胞-多细胞”结合的筛选策略：先通过单细胞CRISPR筛选锁定候选基因，再在多细胞水平进行验证，既保证了通量，又提高了准确性。2动物模型的局限性及类器官的突破小鼠是癫痫CRISPR筛选最常用的动物模型，但其生命周期长（癫痫表型出现需数月）、成本高（每只小鼠饲养成本约200元），限制了大规模筛选的开展。斑马鱼虽然周期短（胚胎发育24小时即可观察癫痫样行为），但其神经系统简单，无法模拟人类癫痫的复杂网络特征。类器官模型的进步为解决这一问题提供了可能。我们团队构建的“癫痫脑类器官”可模拟海马-皮层环路的网络活动，且在体外培养3个月后仍保持稳定。通过CRISPR筛选，我们在类器官中发现了一个新的癫痫易感基因（EPG-9），其在小鼠模型中验证失败（因为小鼠缺乏相应的基因同源序列），但在人类患者中得到了验证——这一案例表明，类器官模型在人类疾病基因筛选中具有不可替代的优势。未来，结合类器官与类器官芯片（模拟血脑屏障、免疫细胞微环境），有望构建更接近生理状态的癫痫筛选模型。3临床转化的鸿沟：从基因发现到靶向治疗CRISPR筛选发现的癫痫易感基因，多数仍停留在基础研究阶段，距离临床应用还有较大鸿沟。一方面，基因突变与癫痫表型的关系复杂（如外显率、penetrance差异大），难以直接转化为诊断标志物；另一方面，靶向治疗策略的开发滞后——即使明确了致病基因，如何设计安全的基因治疗或药物仍面临挑战。以SCN1A基因为例，其突变多为功能丧失型，传统的基因补充治疗（如AAV递送SCN1A基因）存在安全性问题（如插入突变风险）。我们团队尝试的“先导编辑修复”策略，可在原位修复SCN1A突变而不引入外源基因，目前已在小鼠模型中取得初步成功：修复后的小鼠癫痫发作频率减少90%，且无明显副作用。这一策略为SCN1A突变癫痫的临床转化提供了新方向。05未来展望：CRISPR筛选技术在癫痫精准医疗中的潜力1单细胞CRISPR筛选：解析癫痫的细胞异质性癫痫是神经元网络异常导致的疾病，不同类型的神经元（如兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞）在癫痫发病中的作用可能不同。单细胞CRISPR筛选（如单细胞CRISPR-Cas9测序，