南方红豆杉离体胚培养过程中的转录组分析

引言南方红豆杉又名美丽红豆杉，属红豆杉科红豆杉属，常绿乔木，我国独有树种之一，零散分布于华南、华中、华东和西南地区，多数生长在海拔1200米以下地方[1]，是第四纪冰川运动残留下来的古老植物，被称为“植物界活化石”[2]。在经济、园林和药用方面均有较高的价值，其木材结实耐用，晒干后很少开裂，可用作于建筑、家具、耕具、文具等方面[3]。在其树皮提取的紫杉醇具有独特的抗癌机理，使得南方红豆杉具有更高的开发价值[4]。因其种子的生物学特性：种子产量少、自然萌发率低及种群的遗传特性，南方红豆杉自然繁殖率很低[5]。随着癌症发病率增高，对紫杉醇的需求量日益剧增，我国野生红豆杉资源遭受到了严重的破坏，部分区域野生红豆杉已经濒临灭绝，南方红豆杉现已被列入“国家级濒危保护植物”[6]。近年来，国内外众多学者致力于南方红豆杉的生态学、分子学等研究。目前有关南方红豆杉的研究主要集中在南方红豆杉的人工繁殖、紫杉醇的化学提取合成、微生物、基因工程和种子休眠机制等方面[7-10]。而转录组分析方面主要集中在已公布的南方红豆杉根茎叶的转录组数据[11]，南方红豆杉种子解除休眠和萌发过程中的基因差异相关报道甚少。因此利用植物生物信息学技术研究南方红豆杉的种胚萌发时的基因差异具有极为重要的意义和经济价值。文章利用第二代测序技术对南方红豆杉种胚进行测序，分析讨论南方红豆杉种胚解除休眠和萌发过程中基因表达差异。1.1离体胚培养研究综述离体胚培养是一种广泛应用于植物育种的技术。该项技术可克服杂种胚败育、远缘杂交不亲和性的问题[12]。尚富德[13]通过对野生棉和栽培棉种间杂交胚珠离体培养研究结果表明，杂交胚在发育后期因为胚和胚乳、胚和母体组织发育的不协调会导致形成畸形胚或者死胚，在球形胚时期进行离体培养，改变了这种不协调关系，因此会产生较多的杂种胚。张智英[14]对核桃进行杂交胚的离体培养也得到相同结论。离体胚培养技术也能有效克服种子休眠问题，达到快速育苗的目的。赵沛基[15]对云南红豆杉进行离体胚培养，不仅改善了云南红豆杉种子需经两年休眠期才能萌发的问题，还有效的缩短了成苗时间。1.2转录组研究综述转录组分析是研究植物表型的最通常的方法，可以在较短的时间里了解细胞中基因的转录情况及转录调控规律，现已得到广泛应用。董昂等[16]对山核桃种子生长发育过程进行了转录组的初步分析，在山核桃种子的生长发育过程中发现了21个参与脂类合成的途径，571个相关基因。林萍等[17]对普通油茶种子的4个发育时期进行了转录组分析，确定了21789条有编码蛋白功能的unigene。李雨霖等[18]对亚麻芥处于不同发育时期的种子进行转录组的测序及分析，并应用生物信息学的原理及方法对亚麻荠种子发育过程中基因表达差异和功能注释进行分析。张琳[19]对拟南芥种子发育过程中转录组深度测序数据结果的分析成功构建拟南芥种子成熟的关键基因调控网络。张彦[20]对江南卷柏抱子发育进行转录组分析，并将其与拟南芥种子成熟发育中的转录组特征进行比较，筛选得到在种子成熟发育时期有654个特异上调表达的基因和850个下调表达的基因。陶涛[21]对萌发期澳洲棉与亚洲棉种子进行转录组测序及其差异表达分析。而对于南方红豆杉，相应的研究较少，Hao等[22]首次采用IlluminaHiseq2000(Illumina,SanDiego,CA,USA)测序和生物信息学方法，对红豆杉已知和新的小RNA进行了鉴定、鉴定和描述，确定了一些高度保守和已知的非保守微RNA的预测靶点。李炎林[11,23]以现有的转录组数据进行拼接组装和分析，并以此为基础对红豆杉的进行大规模的SSR分子标记挖掘，成功构建红豆杉属植物的Unigenes数据库。1.3南方红豆杉研究进展自然条件下，南方红豆杉种子需要经过两冬一夏才能萌发[7]。近年来，诸多学者致力于研究南方红豆杉种子萌发时的一些生理变化以寻求提高种子萌发率的方法。史忠礼等[24]通过对南方红豆杉种子体眠机理的研究，得出结论：南方红豆杉的种皮坚硬透性差，以及胚发育过程需要生理后熟，属于综合型体眠。而谭一凡[25]通过对南方红豆衫种子后熟生理的研究结果表明，在南方红豆杉种子发育到形态成熟时，最初不能萌发的根本原因是种胚发育不够完全。而种皮透性的不良以及存在种内抑制物，是种胚在后熟过程中发育缓慢的主要因素，而经过层积处理后，可以明显提高种子的发芽率和成苗率。朱念德[26]通过对南方红豆杉种胚的发育现象、外种皮的结构以及种子各部分抑制物质相对活性的研究认为，种子形态成熟时，种胚处于基本成熟阶段，离体培养可以快速生长成苗。在胚乳存在的抑制物质和外种皮的相对不透气性可能是抑制南方红豆杉种子萌发的因素，但ABA的存在不是萌发的抑制因素。黄儒珠等[27]通过实验表明，脱除外被蜡质层的南方红豆杉种子，经低-暖-低变温层积和经过植物生长调节剂及微量元素处理，120d后休眠解除。而且变温层积处理后，种子胚的发育逐渐完善，种子内的蛋白质、氨基酸和可溶性糖含量都明显有所提高，因此认为脂肪等贮藏物质的分解、转化和利用可能是解除南方红豆杉种子休眠的关键所在。这与吉前华等[28]所做结论类似。张艳杰等[4]对南方红豆杉种子的各部分甲醇浸提液进行了生物检测，并通过GC-MS联用仪鉴定。得出结论：南方红豆杉的种子中种皮、内种皮和胚乳的浸提液对白菜种子的发芽率及幼苗的高生长、根生长均有抑制作用，并且抑制作用的程度随浸提液浓度的增大而增强。同时，从南方红豆杉种子的胚乳和中种皮、内种皮中鉴定得出多种有机化合物，并明确了它们的种类和相对含量，其中包括已经报道的正庚酸、壬酸、乙酸等发芽抑制物质。表明南方红豆杉种子的中种皮、内种皮和胚乳中都含有种子萌发抑制物和抑制幼苗生长的物质。年慧慧[29]将所提取种子浸提液作用于油菜种子，得到同样的趋势规律。李晓琳等[10]根据前人所做研究得出南方红豆杉种子生理休眠的主要原因是萌发抑制物的存在，而种子成熟时种胚是否发育完全以及种皮透性对种子的萌发是否有影响仍存在很大争议，有待进一步研究。1.3.1南方红豆杉种胚离体培养研究现状为了满足紫杉醇大量需求，对红豆杉属植物的大规模快速繁殖进行了大量的探索，包括扦插、胚培养、愈伤组织培养、悬浮培养等。而越来越多的实验证明，离体胚培养有潜力成为快速、大量繁殖南方红豆杉的最有效的方法之一。梅兴国[30]对红豆杉离体胚培养快速育苗的实验研究表明，离体胚培养技术打破南方红豆杉种子休眠机制，使休眠期较长的红豆杉种子在短期内迅速成苗，且萌发率较高。目前，学者通过研究培养基和条件来进一步提高种子萌发率。曾余力[31]的实验表明南方红豆杉最优灭菌处理为2.5%的NaClO真空灭菌l0min，其污染率仅为6%，而出苗率可高达86%。基本培养基对南方红豆杉离体胚生长影响较大，WPM培养基是南方红豆杉胚培养的最佳基本培养基。其中在南方红豆杉离体种胚培养中，不加细胞分裂素时试管苗生长最好，添加细胞分裂素可分化产生不定芽，在同样培养基中，南方红豆杉萌动种胚较未萌动的种胚更易诱导不定芽的分化。臧新等[32]将南方红豆杉种子低温处理一个月，再用流水冲洗之后，利用B5培养基对南方红豆杉离体胚进行25℃散光培养，南方红豆杉种胚的萌发率和成苗率分别可达66.7%和50%。Tafreshi等[33]对红豆杉也进行了胚培养试验，采用1/2培养基+0.8g/LPVP或5g/L活性炭+3%蔗糖+5.8g/L琼脂，pH为5.7±0.05，在种子用流水冲洗7d后进行胚培养，14d后可获得100%萌发率；而没有经过流水冲洗的种子，胚培养的萌发率为85%；将萌发后的幼苗移至液体培养基中进行光照培养，可获得90%的成苗率。1.3.2南方红豆杉分子研究进展红豆杉的研究主要集中于快速繁殖、紫杉醇提取等方面，其分子学的研究却相对滞后[34]。分子标记方面，武星彤[35]利用RFLP-PCR技术，从植物叶绿体的通用引物数据库中筛选得到了48个适合用于南方红豆杉的标记位点，发现有两个具有特殊用途的位点，线粒体SSR位点(Taxus-mtB01)可用于检测不同地域(群体)南方红豆杉种子的来源和扩散路径；核基因组插入一缺失位点(Taxus-indel)可用于作为DNA条形码，可以对大部分红豆杉属的物种有效地进行鉴别。郑超[36]采用RAPD标记研究了4种红豆杉属植物的68个单株的遗传多样性，并采用UPGMA方法对68个单株的遗传关系分析，结果表明南方红豆杉和须弥红豆杉遗传距离最近。Hao[37]使用数字基因表达系统研究了三种红豆杉组织的转录组差异并鉴定了大量与组织特异性功能和紫杉烷生物合成途径相关的基因。其中紫杉烷生物合成基因在根中的表达明显高于在叶和茎中的表达，而代谢组学分析同样也揭示了紫杉烷生产途径在根中具有高活性。Lun等[38]从南方红豆杉中新提取了一种命名为taxiwallinine的紫杉烷二萜类化合物并筛选用于对人乳腺癌细胞系MCF-7的细胞毒性作用，他们认为这种新的紫杉烷二萜类化合物可能是一个潜在的抗肿瘤产品。1.3研究目的及意义本实验通过对南方红豆杉离体胚培养后进行转录组学分析，找到南方红豆杉种胚解除休眠和萌发过程中基因表达差异，此研究结果拓宽了南方红豆杉的分子遗传学研究领域，为更深层次地研究南方红豆杉种子萌发的信号转导和代谢调控奠定基础。2材料与方法2.1离体胚的获取将南方红豆杉种子置于蒸馏水中浸泡，使种仁吸胀，种子浸泡48h后去除种壳。种仁以75%酒精消毒2min，2.5%NaClO溶液消毒10min之后用无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上剥离种胚接种于B5培养基（蔗糖20g/L，琼脂8g/L，活性炭3g/L，PH=5.8）上，以上操作于超净工作台进行。将种胚置于25℃恒温培养箱分别培养7d（B）、14d（C）、21d（D），没有进行培养的胚作为对照，0d（A）。测量不同时期的离体胚的长度与重量，并对胚超显微结构进行观察。2.2RNA提取与质量检测每个时期样品做3个重复，从组织样品中提取总RNA，四个时期共12个RNA样品。对提取的RNA样品用Nanodrop2000进行浓度和纯度检测，RNA完整性用琼脂糖凝胶电泳检测，RIN值利用Agilent2100进行测定。2.3测序数据分析（1）原始数据的处理先将Illumina测序得到的原始图像数据通过BaseCalling转化为序列数据，得到最原始的测序数据。将原始数据中的测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列进行过滤，得到高质量的测序数据(cleandata)以保证后续分析的顺利进行。（2）序列的组装获得RNA-seq高质量测序数据后用Trinity软件对所有cleandata进行从头组装，需要将所有测序读段通过从头组装生成重叠群(contig)和单一序列(singleton)。（3）Unigene的功能注释、Go分类和Pathway富集性分析将拼接所得所有核苷酸序列，使用BlastX分别与NR、String、Swissprot、KEGG、Pfam数据库进行比对获得相应的注释信息。3结果与分析3.1RNA质量检测每个时期3个样品共12个样品，对12个样品提取的RNA进行质量检测。12个样品RNA条带清晰，无色素、蛋白、糖类等杂质污染，28/23S亮度大于18/16S。样品RNA的OD260/280均大于1.8，OD260/230均大于1.5，RIN值均大于8.0，RNA浓度及总量满足两次建库需求，可以进行后续实验。3.2转录组组装结果4个采样时间点12个样品测序共得到原始读长667915734个，清洁读长（Cleanreads）653544514个，后者占97.85%。对测序结果进行分析，数据错误率低，质量可信，可用于后续分析。组装后共获得转录本213274条，Unigene为每个基因中最长的转录本；从所有转录本中共获得78154个不同长度的Unigene，占总转录本数的36.64%，N50为1894bp（表1）。表1组装结果统计表Table1Statisticaltableofassemblyresults3.3基因功能注释结果将所得的Unigenes对比到5大功能数据库中，分别注释到各数据库的个数及占总Unigenes比例为：NR:29650（37.94%）、Swissprot:20853（26.68%）、String：8495（10.87%）、KEGG:9794（12.53%）、Pfam:17550（22.46%）最终有3327个Unigenes同时标注到5大数据库中，占Unigenes总数的4.26%（图1）。图1Unigene注释信息Venn图Fig.1VennAnnotationinformationofunigenes3.3.1GO功能注释结果利用GO(GeneOntology)数据库对基因按照其参与的生物过程BP(BiologicalProcess)、分子功能MF(MolecularFunction)及细胞组分CC(CellularComponent)三个方面进行分类注释。14201个unigenes注释到56个GO通路中，其中Unigenes注释数目最多的是生物过程（图2）。由图可见，注释到生物过程的基因中，最多的是代谢过程(metabolicprocess)8539条、细胞途径(cellularprocess)7244条、单一的生物过程(single-organismprocess)5588条、对刺激的反应(responsetostimulus)1830条、生物过程调节(biologicalregulation)1583条，代谢过程中关于有机物代谢过程、初级代谢过程与细胞代谢过程的基因最多；注释到细胞组分的基因中，最多的是细胞(cell)4881条、细胞原件(cellpart)4881条和细胞器(organelle)3638条；注释分子功能的基因中，最多的是催化活性(catalyticactivity)7508条、结合(binding)7252条和转运子活性(transporteractivity)2954条。图2GO功能注释结果Fig.2GOFunctionalAnnotationResult3.3.2KEGGPathway功能注释结果将基因根据参与的KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)代谢通路分为5个分支：代谢(A，Metabolism)，遗传信息处理(B，GeneticInformationProcessing)，环境信息处理(C，EnvironmentalInformationProcessing)，细胞过程(D，CellularProcesses)，有机系统(E，OrganismalSystems)。从图3中可以看出Unigenes分到最多的是代谢，占总基因数的66.92%；其次是与遗传信息处理有关的通路，占基因总数的20.25%，在南方红豆杉种胚萌发过程中基因转录、翻译和能量消耗及其重要。图3KEGGPathway功能注释结果Fig.3KEGGPathwayFunctionalAnnotationResults3.4差异表达基因分析3.4.1差异表达基因数量变化南方红豆杉种胚在萌发各阶段基因调控有很大的差别，对不同阶段的基因表达情况进行比较，上调和下调的Unigenes数目变化较大，萌发期间，B期与A期比较(AvsB)上调基因9358个，下调基因11411，C期与B期比较(BvsC)上调基因4282图4差异表达基因比较图Fig.4Mapofdifferentiallyexpressedunigenes个，下调基因1774个，D期与C期比较(CvsD)上调基因1333个，下调基因287（图4），种胚萌发前期基因表达变化较大，而反观萌发后期，A期与C期(AvsC)、A期与D期比较(AvsD)基因表达变化都较小。3.4.2差异表达基因GO分析将差异基因进行GO功能注释分析，差异基因集中最多的前18个通路，属于生物过程的最多，分子功能的最少。其中生物过程集中的较多的依次是代谢过程、细胞过程、单一有机体过程、对刺激的反应、细胞成分组织或生物发生、生物调剂、定位、生物调节、定位的建立以及生物过程调控；细胞组分中基因差异较大的是细胞与细胞器；分子功能中催化活性差异和结合通路基因差异较大（图5）。在南方红豆杉种子萌发过程中，基因表达差异较大的18个通路中的上调基因高于下调基因，比较不同时期的差异基因可知，南方红豆杉种胚萌发时前期的差异基因多于后期的差异基因，萌发前期代谢过程活跃。图5差异表达基因GO分类统计Fig.5GOclassificationstatisticsofDEGs4结论利用第二代测序技术对培养0d、7d、14d、21d的南方红豆杉种胚进行测序，分析讨论南方红豆杉种胚解除休眠和萌发过程中基因表达差异。通过测序，共得到78154个Unigenes，N50为1894bp。NR注释结果显示，与南方红豆杉基因最相似的是北美云杉(Piceasitchensis)。GO、COG、KEGGPathway功能注释结果显示，注释到最多Unigenes的是代谢过程。5讨论种子在萌发过程中不同阶段基因表达存在较大差异，这些基因主要与DNA合成、激素代谢等过程相关，种胚在种子萌发过程中主要是发生细胞分裂过程，而且萌发前期比后期活跃。种子休眠解除后萌发前，必须完成一系列生理过程，包括种子内营养物质（包括淀粉、蛋白和脂类等）的供给，它们在酶的作用下可被种胚利用[39]。在种子萌发前期，与细胞壁代谢有关的基因表达较高，在种子萌发中期，参与氨基酸合成、蛋白质合成、转运和酸合成的基因显著增加，并在此基础上诱导出与光合代谢相关的基因，萌发后期光合作用光合作用相关基因的表达变化显著，总之，种子萌发的信号转导和代谢调控涉及到不同代谢组织水平上的多种反应和复杂的调控[40]。随着对南方红豆杉的深入研究，目前关于种子休眠机制的研究己进入分子水平阶段，种子休眠状态的解除与种子基因差异表达变化紧密关联。此次试验初步分析了种胚萌发过程中的基因表达差异，为后续更深层次研究南方红豆杉种子解除休眠和萌发的分子机理研究奠定基础。参考文献贺善安.中国珍稀植物[M].上海:上海科学技术出版社,2001.梁瑞龙,熊晓庆.从远古走来的红豆杉[J].广西林业,2019(01):38-39.中国科学院植物研究所编辑委员会.中国植物志第七卷[M].北京:科学出版社，1978.张艳杰,高捍东,鲁顺保.南方红豆杉种子中发芽抑制物的研究[J].南京林业大学学报(自然科学版),2007,(04):51-56.茹文明.濒危植物南方红豆杉生态学研究[D].山西大学,2006.陈易展,刘蔚漪,张玉薇,等.南方红豆杉濒危现状分析与保护对策[J].林业勘察设计,2018,38(03):66-69.王爱明.南方红豆杉育苗及大苗繁育管理技术[J].中国园艺文摘,2018,34(04):175-176.陈雪英,梁敬钰.人工栽培的南方红豆杉化学成分(Ⅰ)[J].中国天然药物,2006(01):52-57.王启业,王义强,凡利.南方红豆杉生物技术研究进展[J].中国农学通报,2012,28(04):8-12.李晓琳,展晓日.红豆杉种子休眠机制的研究进展[J].现代中药研究与实践,2018,32(04):78-81.李炎林,杨星星,张家银,等.南方红豆杉转录组SSR挖掘及分子标记的研究[J].园艺学报,2014,41(04):735-745.范玉清,任国华.国内植物组织培养进展概况[J].晋东南师范专科学校学报,2002(02):23-24+91.尚富德,胡绍安,李扬汉,等.野生棉与栽培棉种间杂交胚珠离体培养的胚胎发育研究[J].实验生物学报,1991(03):269-275.张智英,张旺林.核桃杂交胚的离体培养研究[J].农业科技通讯,2015(08):153-154.赵沛基,沈月毛,彭丽萍,等.云南红豆杉离体胚的培养[J].植物生理学通讯,2003(04):327-329.董昂,赵国淼,胡欢欢,等.山核桃(Caryacathayensis)种子生长发育过程转录组的初步分析[J].分子植物育种,2018,16(12):3844-3854.林萍,曹永庆,姚小华,等.普通油茶种子4个发育时期的转录组分析[J].分子植物育种,2011,9(04):498-505.李雨霖.亚麻芥不同发育时期种子转录组测序及分析[D].吉林农业大学,2013.张琳.拟南芥种子发育过程转录组深度测序数据的分析[D].福建农林大学,2011.张彦.江南卷柏孢子发育转录组分析及其与拟南芥种子成熟发育转录组特征的比较[D].复旦大学,2012.陶涛.澳洲棉与亚洲棉种子萌发期转录组测序及其差异表达分析[D].南京农业大学,2013.Da‐ChengHao,LingYang,Pei‐GenXiao,etal.IdentificationofTaxusmicroRNAsandtheirtargetswithhigh‐throughputsequencinganddegradomeanalysis[J].PhysiologiaPlantarum,2012,146(4).李炎林.红豆杉紫杉烷代谢突变体筛选和连锁图谱构建[D].湖南农业大学,2014.史忠礼,周菊华,王子卿.南方红豆杉种子休眠的研究[J].浙江林业科技,1991(05):1-6.谭一凡.南方红豆杉种子后熟生理的研究[J].中南林学院学报,1991(02):200-206+213.朱念德,刘蔚秋,伍建军,等.影响南方红豆杉种子萌发因素的研究[J].中山大学学报(自然科学版),1999(02):76-80.黄儒珠,郭祥泉,方兴添,等.变温层积处理对南方红豆杉种子生理生化特性的影响[J].福建师范大学学报(自然科学版),2006(02):95-98.吉前华,郭雁君,李少琼,等.不同处理对南方红豆杉种子萌发的影响[J].安徽农业科学,2007(31):9858-9860.年慧慧,张春椿,李效贤,等.不同处理方法南方红豆杉种子浸提液内源抑制物活性研究初探[J].浙江中医药大学学报,2012,36(09):1021-1024+1028.梅兴国,温川蓉,刘凌,等.红豆杉离体胚培养快速育苗研究[J].华中理工大学学报,1998(05):6-8.曾余力.南方红豆杉试管繁殖体系建立及老树复幼研究[D].浙江农林大学,2010.臧新,吕晓辉,杨冬之,等.2种红豆杉的离体胚培养[J].郑州大学学报(理学版),2006(02):107-109+112.TafreshiSAH,ShariatiM,MofidMR,etal.RapidgerminationanddevelopmentofTaxusbaccataL.byinvitroembryocultureandhydroponicsgrowthofseedlings.InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant,2011,47(5):561-568王启业,王义强,凡利.南方红豆杉生物技术研究进展[J].中国农学通报,2012,28(04):8-12.武星彤,文亚峰.南方红豆杉分子遗传学研究进展[J].经济林研究,2017,35(02):228-232.郑超,别庆铃,夏冰,等.4种红豆杉属植物遗传多样性和遗传关系的RAPD分析[J].植物资源与环境学报,2013,22(03):58-62.HaoDaCheng,