强心苷下调STAT3表达对肿瘤细胞的抑制功能及机制研究：以前列腺癌为例

强心苷下调STAT3表达对肿瘤细胞的抑制功能及机制研究：以前列腺癌为例一、引言1.1研究背景癌症，作为全球性的重大健康挑战，严重威胁着人类的生命与健康。《2016年中国恶性肿瘤流行情况分析》显示，2016年我国恶性肿瘤新发病例约406.40万，死亡病例数约为241.35万例，相当于平均每天有1万多人被诊断为新发癌症，平均每分钟有7人确诊。肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、女性乳腺癌等是我国高发的恶性肿瘤，它们严重影响患者的生活质量，给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。尽管现代医学在癌症治疗方面取得了一定进展，如手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等多种手段的应用，但癌症的复发和转移仍然是治疗失败的主要原因，寻找新的治疗靶点和方法迫在眉睫。信号转导与转录激活蛋白3（STAT3）在肿瘤的发生发展过程中扮演着至关重要的角色。STAT3是一种转录因子，正常情况下，它参与细胞的生长、分化、凋亡等多种生理过程，维持机体的正常功能。然而，在肿瘤微环境中，STAT3可被多种细胞因子和生长因子受体激活，如白细胞介素6（IL-6）、表皮生长因子（EGF）等。持续激活的STAT3会发生磷酸化并转位进入细胞核，调控一系列与肿瘤相关基因的表达，这些基因涉及肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进癌细胞干性化和耐药性。比如，在乳腺癌细胞中，STAT3的持续激活能促进细胞周期蛋白D1的表达，加速细胞周期进程，促进肿瘤细胞的增殖；在结直肠癌细胞中，STAT3可上调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达，抑制细胞凋亡，使得肿瘤细胞能够逃避机体的免疫监视和治疗干预。此外，STAT3还能调节肿瘤微环境中免疫细胞的代谢，诱导免疫抑制，为肿瘤细胞的生长和转移创造有利条件，如促进肿瘤相关巨噬细胞向免疫抑制性的M2型极化。因此，STAT3成为癌症治疗中极具潜力的靶点。强心苷作为一类具有独特化学结构和生物活性的化合物，在心血管疾病治疗领域有着悠久的应用历史，主要用于治疗慢性心功能不全、心房纤颤、心房扑动、阵发性心动过速等心脏疾病。近年来，随着研究的不断深入，强心苷的抗癌作用逐渐受到关注。研究表明，强心苷类化合物能通过多种途径发挥抗癌作用，其作用机制主要包括抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等。在抑制肿瘤细胞生长方面，强心苷类化合物能抑制细胞周期蛋白的表达，使肿瘤细胞停滞在特定的细胞周期阶段，从而抑制肿瘤细胞的增殖，如在肺癌细胞中，某些强心苷可显著降低细胞周期蛋白D1和E的表达水平，阻滞细胞周期于G1期。在诱导肿瘤细胞凋亡方面，强心苷类化合物可通过调节信号转导通路，触发线粒体凋亡途径等，促使肿瘤细胞发生程序性死亡，洋地黄毒苷元可通过调节Bcl-2家族蛋白的表达，使促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，从而触发线粒体凋亡途径。在抑制肿瘤血管生成方面，强心苷类化合物可抑制血管内皮生长因子（VEGF）的表达，减少肿瘤血管的生成，进而抑制肿瘤的生长和转移，因为VEGF是一种重要的促血管生成因子，其过度表达可促进血管生成和肿瘤生长。目前，关于强心苷与STAT3之间关联的研究逐渐兴起，但仍处于初步探索阶段。已有研究提示，强心苷可能通过下调STAT3表达来影响肿瘤细胞的生物学行为，但具体的作用机制尚未完全明确。深入探究强心苷下调STAT3表达对肿瘤细胞的抑制功能及机制，有望为癌症治疗提供新的策略和理论依据，这不仅有助于拓展对肿瘤发病机制的认识，还可能为开发新型抗癌药物或优化现有治疗方案开辟新的途径。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究强心苷下调STAT3表达对肿瘤细胞的抑制功能及具体作用机制。通过细胞实验和动物实验，明确强心苷对不同肿瘤细胞系中STAT3表达的影响，观察其对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的改变。从分子和信号通路层面，剖析强心苷下调STAT3表达后，肿瘤细胞内相关信号通路的变化，揭示其发挥抑制作用的内在机制。本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。在理论方面，有助于深化对肿瘤发生发展机制的认识，进一步明确STAT3信号通路在肿瘤中的调控网络，以及强心苷类化合物与肿瘤细胞相互作用的分子基础，为肿瘤生物学研究提供新的理论依据和研究思路。在实际应用方面，若能证实强心苷通过下调STAT3表达有效抑制肿瘤细胞，将为癌症治疗开辟新的策略和途径。一方面，为开发新型抗癌药物提供潜在的先导化合物，以强心苷为基础进行结构优化和改造，有望研发出高效、低毒的新型抗癌药物；另一方面，可探索将强心苷与现有癌症治疗方法联合应用的可能性，通过调节STAT3表达，增强肿瘤细胞对传统化疗、放疗或靶向治疗的敏感性，提高治疗效果，改善癌症患者的预后和生活质量，对癌症治疗领域的临床实践产生积极而深远的影响。1.3研究方法与创新点在本研究中，将综合运用多种研究方法，从细胞和动物水平，深入探究强心苷下调STAT3表达对肿瘤细胞的抑制功能及机制。细胞实验方面，选取多种具有代表性的肿瘤细胞系，如前列腺癌细胞系PC-3和DU145、乳腺癌细胞系MCF-7、肺癌细胞系A549等，以确保研究结果的普适性。采用CCK-8法和EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入实验，检测强心苷处理后肿瘤细胞的增殖能力变化。CCK-8法是基于细胞线粒体中的脱氢酶能够将CCK-8试剂中的四唑盐还原为具有高度水溶性的甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量成正比，从而定量分析细胞增殖情况；EdU掺入实验则是利用EdU能在DNA合成期（S期）掺入到新合成的DNA中，通过荧光标记的EdU进行检测，直观反映细胞的增殖活性。利用AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞术，分析肿瘤细胞的凋亡情况。AnnexinV是一种对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力的蛋白，在细胞凋亡早期，PS会从细胞膜内侧翻转到外侧，AnnexinV可与之结合，再结合PI染色，能够区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死的细胞，通过流式细胞术进行精确分析。通过Transwell小室实验和划痕愈合实验，评估肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。Transwell小室实验可在体外模拟体内细胞迁移和侵袭的微环境，通过检测穿过小室膜的细胞数量来评价细胞的迁移和侵袭能力；划痕愈合实验则是在细胞单层上制造划痕，观察细胞迁移填充划痕的速度和程度，直观反映细胞的迁移能力。动物实验方面，构建肿瘤小鼠模型，如将人前列腺癌细胞PC-3接种到裸鼠皮下，建立前列腺癌移植瘤模型。对模型小鼠进行不同剂量的强心苷处理，设置对照组给予等量的生理盐水。定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，以评估强心苷对肿瘤生长的抑制作用。实验结束后，处死小鼠，取出肿瘤组织，进行病理切片分析，观察肿瘤细胞的形态学变化，以及免疫组化检测STAT3等相关蛋白的表达情况，从组织层面深入了解强心苷的作用效果。分子生物学技术方面，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测肿瘤细胞和组织中STAT3及其相关基因的mRNA表达水平。qRT-PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot），检测STAT3及下游信号通路相关蛋白的表达和磷酸化水平，如p-STAT3、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9等蛋白，明确强心苷对相关信号通路的影响。通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验，研究STAT3与靶基因启动子区域的结合情况，进一步揭示其在转录调控层面的作用机制。本研究的创新点主要体现在以下两个方面。一是以前列腺癌为重点研究对象，结合其他多种肿瘤细胞系进行研究。前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈上升趋势，但针对前列腺癌中强心苷下调STAT3表达的研究相对较少。本研究聚焦于此，有望为前列腺癌的治疗提供新的理论依据和潜在治疗靶点，同时结合多种肿瘤细胞系，可更全面地揭示强心苷作用的普遍性和特殊性。二是从多层面深入研究强心苷下调STAT3表达对肿瘤细胞的抑制机制。不仅从细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为层面进行研究，还深入到分子和信号通路层面，探究相关基因和蛋白的表达变化以及信号通路的激活或抑制情况，这种多层面的系统研究，能够更全面、深入地揭示强心苷发挥抗癌作用的内在机制，为后续的药物研发和临床应用提供更坚实的理论基础。二、理论基础与研究现状2.1强心苷的研究进展2.1.1强心苷的结构与分类强心苷是一类具有独特结构和重要生物活性的化合物，其化学结构由苷元与糖连接而成。苷元部分主要由甾体母核和不饱和内酯环组成，这是强心苷发挥生物活性的关键结构基础。甾体母核包含A、B、C、D四个环，其稠合方式具有特定规律：A/B环存在顺式和反式两种形式，但以顺式居多；B/C环均为反式；C/D环大多呈顺式。在甾体母核的C10、C13、C17位上，分别连接着不同的取代基，且均为β型。其中，C10位多被甲基、醛基、羟甲基、羧基等含氧基团取代；C13位连接甲基；C17位则连接不饱和内酯环。在强心甾烯类（甲型强心苷元）中，C17侧链为五元不饱和内酯环（△αβ-γ-内酯），这是最为常见的强心苷元类型，地高辛（异羟基洋地黄毒苷）、西地兰（去乙酰毛花苷）等均属于此类。而在海葱甾二烯类或蟾蜍甾二烯类（乙型强心苷元）中，C17侧链为六元不饱和内酯环（△αβ，γδ-δ-内酯），自然界中这类苷元相对较少，中药蟾蜍中的强心成分蟾毒配基类是其代表。与苷元相连的糖部分，对强心苷的性质和活性也有重要影响。糖的种类多样，包括α-羟基糖（如葡萄糖）和α-去氧糖（如洋地黄毒糖，即2,6-二去氧糖）。根据糖与苷元的连接方式不同，强心苷可进一步分为三种类型。Ⅰ型强心苷的连接方式为苷元－（2，6－去氧糖）x－（D－葡萄糖）y，紫花洋地黄苷A是其典型代表；Ⅱ型强心苷为苷元－（6－去氧糖）x－（D－葡萄糖）y，例如黄夹苷甲；Ⅲ型强心苷则是苷元－（D－葡萄糖）y，像绿海葱苷就属于这一类型。在植物界中，Ⅰ型和Ⅱ型强心苷相对更为常见，Ⅲ型较少。这种结构上的差异，使得不同类型的强心苷在溶解性、稳定性以及生物活性等方面表现出各自的特点。2.1.2强心苷的传统医学用途强心苷在传统医学领域有着悠久的应用历史，其主要作用是加强心肌收缩力，在治疗心力衰竭和心律失常等心脏疾病方面发挥了重要作用。在心力衰竭的治疗中，强心苷通过作用于心肌细胞上的Na+/K+-ATP酶，抑制其活性。这一作用机制使得细胞内Na+浓度升高，进而激活Na+/Ca2+交换体，促使细胞内Ca2+浓度升高。细胞内Ca2+是心肌收缩的关键调节离子，其浓度的增加能够增强心肌收缩力，使心脏更有力地泵血，从而改善心力衰竭患者的症状。强心苷还能降低心脏的前后负荷，减少心脏的做功，提高心脏的工作效率，增加心输出量，减轻患者的呼吸困难、水肿等症状，显著改善心力衰竭患者的生活质量和预后。对于心律失常，尤其是心房颤动、心房扑动等，强心苷也具有一定的疗效。它可以抑制心脏传导系统，延长有效不应期，从而减慢心率，使心脏节律恢复正常或得到一定程度的控制。在心房颤动的治疗中，强心苷通过抑制房室传导，减少心房激动向心室的传导，降低心室率，减轻心悸等不适症状。但需要注意的是，强心苷在治疗心律失常时，也有致心律失常的风险，尤其是室性心动过速等严重心律失常，因此在使用过程中需要密切监测患者的心电图和生命体征。除了对心脏的直接作用外，强心苷还具有一些间接的生理效应。它能增加肾血流量和肾小球滤过率，促进尿液排出，有利于减轻心脏负荷，对伴有水肿的心力衰竭患者具有利尿消肿的作用。强心苷还对神经内分泌系统产生影响，能够兴奋大脑催吐中枢引起呕吐，兴奋交感神经中枢引起快速性心律失常，同时降低血浆肾素的活性，抑制过度激活的RAAS系统，从多个方面调节机体的生理功能，以适应心脏疾病状态下的身体需求。2.1.3强心苷的抗肿瘤研究现状近年来，强心苷的抗肿瘤作用逐渐成为研究热点，大量研究表明其在抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和抑制血管生成等方面展现出显著的效果。在抑制肿瘤细胞增殖方面，众多实验数据显示，强心苷能够对多种肿瘤细胞系产生抑制作用。在肺癌细胞系A549中，研究人员发现某些强心苷可显著降低细胞周期蛋白D1和E的表达水平，使细胞周期停滞在G1期，从而有效抑制肺癌细胞的增殖。在肝癌细胞的研究中也观察到类似现象，强心苷通过干扰细胞周期相关蛋白的表达，阻止肝癌细胞进入分裂期，进而抑制其生长。这种抑制作用具有一定的选择性，对肿瘤细胞的抑制效果明显，而对正常细胞的增殖无抑制甚至有促进作用。有学者推测，这可能与肿瘤细胞独特的代谢机制有关，肿瘤细胞内H2O2的累积和ATP的消耗导致糖酵解增强，而强心苷能够抑制这种增强的糖酵解机制，从而导致肿瘤细胞死亡，而正常细胞由于糖代谢机制健全则不受影响。诱导肿瘤细胞凋亡也是强心苷抗肿瘤的重要机制之一。凋亡是细胞程序性死亡的过程，对于维持机体正常生理平衡和抑制肿瘤生长至关重要。强心苷可通过多种途径触发肿瘤细胞的凋亡过程。洋地黄毒苷元可通过调节Bcl-2家族蛋白的表达来诱导凋亡，它能使促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，从而破坏细胞内的凋亡平衡，促使线粒体释放细胞色素C等凋亡因子，激活caspase级联反应，最终导致肿瘤细胞凋亡。在乳腺癌细胞中，研究发现强心苷还可以通过激活死亡受体途径，如上调Fas和FasL的表达，使肿瘤细胞对凋亡信号更加敏感，从而诱导细胞凋亡。抑制肿瘤血管生成是强心苷抗肿瘤作用的又一重要方面。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供营养和氧气，因此抑制肿瘤血管生成可以有效抑制肿瘤的发展。研究表明，强心苷可抑制血管内皮生长因子（VEGF）的表达，减少肿瘤血管的生成。VEGF是一种重要的促血管生成因子，其过度表达可促进血管生成和肿瘤生长。当强心苷作用于肿瘤细胞时，能够抑制VEGF基因的转录和蛋白表达，减少VEGF的分泌，进而抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移，阻碍肿瘤血管的形成。在小鼠肿瘤模型中，给予强心苷处理后，通过免疫组化检测发现肿瘤组织中的微血管密度明显降低，表明肿瘤血管生成受到了抑制，肿瘤的生长和转移也因此受到抑制。尽管强心苷在抗肿瘤研究中展现出了巨大的潜力，但目前其临床应用仍受到一定限制。主要原因在于强心苷的治疗安全范围狭窄，在达到肿瘤治疗剂量时，容易引发心脏毒性等不良反应。不过，近年来的研究也发现了一些在肿瘤治疗剂量下无心脏毒的强心苷，这为其开发成为新型抗肿瘤药带来了希望。目前已有一些临床研究初步探讨了强心苷在某些癌症治疗中的疗效。地黄毒苷元对肝癌具有一定的治疗作用，可通过诱导肝癌细胞的凋亡和抑制血管生成来改善患者的生存质量；洋地黄毒苷元在肺癌治疗中也显示出一定的疗效，能够通过调节肿瘤细胞的信号转导通路来抑制肺癌细胞的生长和转移。这些临床研究结果为强心苷的进一步开发和应用提供了宝贵的经验和方向。2.2STAT3与肿瘤细胞的关系2.2.1STAT3的结构与功能STAT3作为信号转导与转录激活蛋白家族中的关键成员，在细胞的生命活动中扮演着不可或缺的角色。其蛋白质结构包含多个重要结构域，各结构域分工明确又相互协作，共同决定了STAT3的生物学功能。从N端开始，首先是保守的N-末端结构域（NTD）。该结构域由大约130个氨基酸组成，在STAT3的多聚化过程中发挥关键作用。通过与其他STAT3分子的NTD相互作用，STAT3能够形成稳定的二聚体或多聚体结构，这对于其后续进入细胞核并结合DNA，调控基因转录至关重要。研究表明，NTD还参与了STAT3与一些辅助因子的相互作用，这些辅助因子能够影响STAT3的活性和功能，进一步拓展了STAT3在细胞内的信号传导网络。接着是卷曲螺旋结构域（CCD），它大约由300个氨基酸构成。CCD主要负责介导STAT3与其他蛋白质之间的相互作用。在细胞信号传导过程中，STAT3需要与多种上游信号分子和下游效应分子相互作用，以实现信号的传递和功能的发挥。CCD能够识别并结合这些蛋白质，形成功能性的蛋白质复合物。在JAK-STAT信号通路中，CCD可以与Janus激酶（JAK）相互作用，促进STAT3的磷酸化激活，还能与一些转录共激活因子结合，增强STAT3对靶基因的转录激活能力。Src同源2结构域（SH2）是STAT3结构中的又一关键部分，由约100个氨基酸组成。SH2结构域具有高度的特异性，它能够识别并结合其他蛋白质上特定的磷酸酪氨酸残基。在STAT3的激活过程中，当细胞受到细胞因子或生长因子的刺激时，细胞膜上的受体被激活，进而激活与之关联的JAK。JAK会将STAT3的酪氨酸残基（Y705）磷酸化。此时，SH2结构域能够特异性地识别并结合磷酸化的Y705，促使STAT3分子发生二聚化。这种二聚化的STAT3构象发生改变，使其能够顺利进入细胞核，与靶基因的特定DNA序列结合，启动基因转录过程。位于C端的转录激活结构域（TAD），包含约100个氨基酸，是STAT3发挥转录激活功能的核心区域。当STAT3二聚体进入细胞核后，TAD与其他转录因子和转录共激活因子相互作用，招募RNA聚合酶等转录相关复合物，结合到靶基因的启动子区域，促进基因的转录起始和延伸。TAD还可以通过与染色质重塑复合物相互作用，改变染色质的结构，使DNA更易于被转录机器识别和结合，从而增强靶基因的转录活性。在正常生理状态下，STAT3的激活受到严格的调控。当细胞接收到细胞因子（如白细胞介素6，IL-6）、生长因子（如表皮生长因子，EGF）等信号刺激时，细胞膜上的相应受体被激活。以IL-6信号通路为例，IL-6与其受体IL-6R结合后，会招募并激活JAK1和JAK2。激活的JAK会磷酸化IL-6R上的酪氨酸残基，形成磷酸酪氨酸位点。STAT3通过其SH2结构域识别并结合到IL-6R的磷酸酪氨酸位点上，随后JAK会将STAT3的Y705磷酸化。磷酸化的STAT3分子通过SH2结构域与另一STAT3分子的磷酸酪氨酸残基相互作用，形成二聚体。这种二聚化的STAT3构象发生改变，暴露出核定位信号（NLS）。在NLS的引导下，STAT3二聚体通过核孔进入细胞核。进入细胞核后，STAT3二聚体能够特异性地结合到靶基因启动子区域的特定DNA序列上，如含有TTCC(G/A)GGAA序列的STAT3结合位点。结合到DNA上的STAT3会与其他转录因子和转录共激活因子相互作用，招募RNA聚合酶Ⅱ等转录相关复合物，启动靶基因的转录过程。这些靶基因涉及细胞的增殖、分化、凋亡等多个生理过程。在细胞增殖方面，STAT3可以调控细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达。CyclinD1是细胞周期G1期向S期转换的关键调节因子，STAT3通过结合到CyclinD1基因的启动子区域，促进其转录表达，从而推动细胞周期的进程，促进细胞增殖。在细胞分化过程中，STAT3参与调控一些与细胞分化相关基因的表达。在神经干细胞分化为神经元的过程中，STAT3可以调节神经分化相关基因的表达，影响神经干细胞的分化方向。在细胞凋亡调控中，STAT3能够调节抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达。STAT3通过激活Bcl-2和Bcl-xL基因的转录，增加这些抗凋亡蛋白的表达水平，抑制细胞凋亡，维持细胞的存活。通过这种精确的激活和调控机制，STAT3在维持细胞的正常生理功能和机体的稳态平衡中发挥着重要作用。2.2.2STAT3在肿瘤细胞中的异常激活及影响在肿瘤细胞中，STAT3常常出现持续性过度激活的现象，这一异常变化与肿瘤的发生、发展密切相关，对肿瘤的多个生物学过程产生深远影响。大量研究表明，在多种人类实体肿瘤以及血液瘤细胞中，均呈现出STAT3的异常高表达和持续性激活。在乳腺癌中，癌细胞和周围的一些炎症细胞可产生并释放各种可溶性因子到肿瘤微环境中，这些因子如IL-6、EGF等能够持续激活STAT3。IL-6与乳腺癌细胞表面的IL-6R结合后，激活JAK1和JAK2，进而使STAT3的Y705位点持续磷酸化，导致STAT3处于持续激活状态。在肺癌中，肿瘤细胞中EGFR等受体的突变或过表达，使得下游的JAK-STAT3信号通路异常激活。EGFR的突变会导致其自身激酶活性增强，持续激活JAK，进而持续激活STAT3。在前列腺癌中，雄激素及其受体信号通路与STAT3的激活存在相互作用。雄激素与雄激素受体结合后，通过一系列信号转导过程，可激活STAT3，且这种激活在前列腺癌的进展中起到重要作用。在白血病等血液瘤中，一些细胞因子和生长因子的异常表达，以及信号通路的异常激活，也导致STAT3持续性激活。STAT3的持续性过度激活对肿瘤血管生成具有显著的促进作用。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供充足的营养和氧气。STAT3可以通过调控一系列促血管生成因子的表达来促进肿瘤血管生成。其中，血管内皮生长因子（VEGF）是一种关键的促血管生成因子。STAT3能够直接结合到VEGF基因的启动子区域，促进其转录表达。在肝癌细胞中，持续激活的STAT3可上调VEGF的表达，增加肿瘤组织中血管内皮细胞的增殖和迁移，促进肿瘤血管的形成。除了VEGF，STAT3还能调节其他促血管生成因子，如成纤维细胞生长因子（FGF）等。STAT3通过激活FGF基因的转录，促进FGF的表达和分泌，进一步增强肿瘤血管生成的能力。肿瘤血管生成不仅为肿瘤细胞提供营养和氧气，还为肿瘤细胞的转移提供了途径，促进了肿瘤的发展和恶化。在肿瘤侵袭转移方面，STAT3的持续激活发挥着重要的推动作用。它能够调节肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程。在乳腺癌中，STAT3的激活可上调EMT相关转录因子的表达，如Snail、Slug和Twist等。这些转录因子能够抑制上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的表达，同时上调间质细胞标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，使上皮细胞失去极性和细胞间连接，获得间质细胞的特性，从而增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。STAT3还能调控基质金属蛋白酶（MMPs）的表达。MMPs是一类能够降解细胞外基质的酶，在肿瘤侵袭和转移过程中发挥关键作用。在肺癌中，持续激活的STAT3可促进MMP-2和MMP-9等的表达，这些MMPs能够降解基底膜和细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路。STAT3还可以调节肿瘤细胞与周围微环境中细胞和基质的相互作用，增强肿瘤细胞的黏附能力，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。STAT3的异常激活在肿瘤免疫逃避中也起着关键作用。肿瘤细胞通过激活STAT3，能够抑制免疫细胞的功能，逃避机体的免疫监视和攻击。在T细胞中，肿瘤细胞分泌的细胞因子如IL-6等可以激活T细胞内的STAT3。激活的STAT3会抑制T细胞的增殖和活化，降低T细胞分泌细胞因子（如IFN-γ等）的能力，减弱T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。在巨噬细胞中，STAT3的激活可促使巨噬细胞向免疫抑制性的M2型极化。肿瘤微环境中的细胞因子通过激活巨噬细胞内的STAT3，上调M2型巨噬细胞相关标志物的表达，如CD163、CD206等。M2型巨噬细胞能够分泌免疫抑制因子，如IL-10等，抑制T细胞和NK细胞的活性，促进肿瘤细胞的免疫逃避。STAT3还能调节肿瘤细胞表面免疫检查点分子的表达。在多种肿瘤中，STAT3的激活可上调程序性死亡配体1（PD-L1）的表达。PD-L1与T细胞表面的程序性死亡受体1（PD-1）结合后，抑制T细胞的活性，使肿瘤细胞逃避T细胞的杀伤。2.2.3STAT3作为肿瘤治疗靶点的研究鉴于STAT3在肿瘤细胞中的关键作用，将其作为肿瘤治疗靶点的研究受到了广泛关注，目前已取得了一系列有价值的研究成果。针对STAT3的研究主要集中在开发能够抑制其活性或降低其表达的抑制剂或降解剂。在抑制剂的研发方面，许多小分子化合物被设计和合成出来，它们通过不同的作用机制来抑制STAT3的激活。Stattic是一种常用的STAT3小分子抑制剂，它能够特异性地与STAT3的SH2结构域结合，阻止STAT3的磷酸化和二聚化，从而抑制其活性。在乳腺癌细胞的研究中，使用Stattic处理后，STAT3的磷酸化水平显著降低，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力也明显受到抑制。S3I-201也是一种有效的STAT3抑制剂，它可以抑制STAT3的酪氨酸磷酸化，阻断STAT3与DNA的结合，进而抑制STAT3调控的靶基因表达。在肺癌细胞实验中，S3I-201能够显著降低STAT3靶基因如Bcl-2、CyclinD1等的表达，诱导肺癌细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。除了小分子抑制剂，还有一些基于多肽的抑制剂被开发出来。这些多肽能够模拟STAT3的某些结构域，与STAT3竞争结合位点，从而抑制其功能。一种含有STAT3SH2结构域结合序列的多肽，能够与STAT3的SH2结构域特异性结合，阻止STAT3的二聚化和核转位，有效抑制肿瘤细胞中STAT3的活性。在前列腺癌细胞中，该多肽抑制剂能够显著降低STAT3的活性，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。在降解剂的研究方面，一些研究致力于开发能够靶向降解STAT3蛋白的分子。利用蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术，设计合成了能够特异性降解STAT3的PROTAC分子。这些分子由三部分组成：一端是能够特异性识别STAT3的配体，另一端是能够结合E3泛素连接酶的配体，中间通过连接子连接。当PROTAC分子与STAT3和E3泛素连接酶结合后，能够促使E3泛素连接酶将泛素分子连接到STAT3上，从而使STAT3被蛋白酶体识别并降解。在肝癌细胞中，使用这种STAT3-PROTAC分子处理后，STAT3蛋白水平显著降低，肿瘤细胞的生长和侵袭能力受到明显抑制。STAT3在调节肿瘤免疫微环境方面的重要作用，使得以STAT3为靶点提高肿瘤对免疫治疗的敏感性成为研究热点。肿瘤免疫治疗是一种新兴的癌症治疗方法，通过激活机体自身的免疫系统来攻击肿瘤细胞。然而，许多肿瘤细胞能够通过激活STAT3等信号通路来抑制免疫细胞的功能，导致免疫治疗效果不佳。研究发现，抑制STAT3的活性可以增强肿瘤细胞对免疫治疗的敏感性。在黑色素瘤的研究中，联合使用STAT3抑制剂和免疫检查点抑制剂（如抗PD-1抗体），能够显著增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。抑制STAT3后，肿瘤细胞表面PD-L1的表达降低，同时T细胞的活性增强，肿瘤的生长得到有效抑制。在肺癌中，通过抑制STAT3来调节肿瘤微环境中的免疫细胞功能，能够使肿瘤微环境从免疫抑制状态转变为免疫激活状态，增强免疫治疗的疗效。抑制STAT3可以减少肿瘤微环境中免疫抑制细胞（如M2型巨噬细胞）的数量，增加免疫激活细胞（如CD8+T细胞）的浸润，从而提高肿瘤对免疫治疗的响应。2.3强心苷与STAT3的潜在联系研究现状近年来，关于强心苷与STAT3之间潜在联系的研究逐渐成为热点，为深入理解强心苷的抗肿瘤机制提供了新的视角。现有研究初步揭示了二者之间可能存在的关联，为进一步探究其作用机制奠定了基础。一些研究提示，强心苷可能通过影响STAT3信号通路来发挥抗肿瘤作用。在对白血病细胞的研究中发现，某些强心苷能够抑制STAT3的磷酸化，从而阻断其信号传导。当用特定的强心苷处理白血病细胞后，检测到细胞内p-STAT3的水平显著降低，同时与STAT3相关的抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白CyclinD1的表达也明显下调。这表明强心苷可能通过抑制STAT3的激活，影响其下游靶基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的增殖和存活。在乳腺癌细胞中，也观察到类似的现象。给予强心苷处理后，STAT3的活性受到抑制，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力明显减弱。进一步研究发现，这与STAT3调控的上皮-间质转化（EMT）相关蛋白表达改变有关。STAT3的抑制导致E-钙黏蛋白表达上调，N-钙黏蛋白和波形蛋白表达下调，抑制了肿瘤细胞的EMT过程，从而降低了其迁移和侵袭能力。尽管已有研究表明强心苷与STAT3之间存在潜在联系，但目前这方面的研究仍存在诸多问题和挑战。在作用机制方面，虽然已知强心苷可影响STAT3的激活和相关基因的表达，但具体的分子作用机制尚未完全明确。强心苷如何精准地作用于STAT3信号通路的各个环节，以及是否存在其他信号分子或蛋白参与其中，仍有待进一步深入研究。在不同肿瘤类型中的差异研究不足。不同肿瘤细胞具有独特的生物学特性和信号通路，强心苷对不同肿瘤细胞中STAT3的作用是否存在差异，以及这些差异背后的原因是什么，目前缺乏系统的研究。这对于深入理解强心苷的抗肿瘤作用机制以及其在不同肿瘤治疗中的应用具有重要影响。研究模型和方法也存在一定局限性。现有的研究大多基于细胞实验和动物模型，与临床实际情况存在一定差距。如何将这些基础研究结果更好地转化到临床应用中，建立更贴近临床实际的研究模型和方法，也是需要解决的重要问题。三、强心苷对肿瘤细胞抑制功能的实验研究3.1实验材料与方法3.1.1实验细胞株的选择与培养本实验选用了多种具有代表性的细胞株，包括前列腺癌细胞株22Rv1、PC-3和DU145，以及正常前列腺上皮细胞RWPE-1。前列腺癌细胞株22Rv1具有雄激素受体阳性且表达前列腺特异性抗原（PSA）的特点，对研究雄激素依赖型前列腺癌的生物学行为和治疗靶点具有重要意义；PC-3细胞具有高侵袭性和转移潜能，常用于研究肿瘤细胞的侵袭和转移机制；DU145细胞则在细胞增殖、凋亡等方面表现出独特的生物学特性，为探究肿瘤细胞的基本生物学过程提供了良好的模型。正常前列腺上皮细胞RWPE-1作为对照细胞，用于对比强心苷对正常细胞和肿瘤细胞的不同影响，有助于评估强心苷的抗肿瘤特异性。所有细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，确保细胞的来源可靠和质量稳定。细胞培养在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美国）的RPMI1640培养基（HyClone公司，美国）中，添加100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（Solarbio公司，中国），以防止细菌污染。将细胞置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱（ThermoFisherScientific公司，美国）中培养，维持细胞生长所需的适宜温度、湿度和气体环境。定期观察细胞的生长状态，当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中国）进行消化传代，以保证细胞的活性和生长特性。传代时，先弃去旧培养基，用PBS缓冲液（Solarbio公司，中国）轻轻冲洗细胞两次，去除残留的培养基和杂质，然后加入适量的胰蛋白酶消化液，置于培养箱中消化1-2分钟，待细胞变圆并开始脱离瓶壁时，加入含有血清的培养基终止消化，用移液器轻轻吹打细胞，使其分散成单细胞悬液，再按照1:3或1:4的比例接种到新的培养瓶中继续培养。3.1.2强心苷的选择与制备本研究选取西地兰（去乙酰毛花苷）作为主要的强心苷研究对象。西地兰是一种常用的强心苷类药物，具有明确的化学结构和药理作用。其来源为从毛花洋地黄（Digitalislanata）中提取得到，毛花洋地黄是玄参科植物，是制备西地兰的主要原料。提取过程中，首先将毛花洋地黄的叶或全草用70%-80%的乙醇进行提取，由于西地兰属于原生苷，可溶于乙醇，且乙醇能抑制酶的活性，防止酶水解，从而保证提取的完整性。提取液浓缩后，通过析胶法除去叶绿素等脂溶性杂质，将醇提液浓缩后静置，使叶绿素等成胶状沉淀析出，滤过除去。接着用氯仿洗涤除去脂杂，因西地兰在苷甲、乙、丙三者中极性最大，最难溶于氯仿而留在水层。最后利用西地兰可溶于氯仿-乙醇（3∶1或2∶1）的特性，用含醇氯仿萃取出总苷，实现与水杂的分离。为了获得高纯度的西地兰，进一步采用色谱法进行纯化。利用硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇（不同比例）为洗脱剂，根据西地兰与其他杂质在固定相和流动相之间分配系数的差异，实现分离。在洗脱过程中，通过薄层色谱（TLC）进行跟踪检测，当检测到单一的西地兰斑点时，收集相应的洗脱液，减压浓缩后得到纯度较高的西地兰。将纯化后的西地兰用DMSO（二甲基亚砜，Sigma公司，美国）溶解，配制成10mM的母液，储存于-20℃冰箱备用。在实验前，根据实验设计，用细胞培养基将母液稀释成不同浓度的工作液，如1μM、5μM、10μM、20μM等，以满足不同实验条件下对西地兰浓度的需求。在稀释过程中，充分混匀，确保溶液浓度的准确性。同时，设置溶剂对照组，加入等体积的DMSO，以排除DMSO对实验结果的影响。3.1.3细胞活力检测实验采用CCK-8（CellCountingKit-8，Dojindo公司，日本）法检测不同浓度强心苷处理后肿瘤细胞和正常细胞的活力。CCK-8法的原理是利用细胞内的代谢酶将CCK-8试剂中的四唑盐还原为具有高度水溶性的甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量成正比，从而通过检测吸光度值来定量分析细胞活力。具体操作步骤如下：将处于对数生长期的前列腺癌细胞株22Rv1、PC-3、DU145以及正常前列腺上皮细胞RWPE-1用胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液，用细胞计数板计数。以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板（Corning公司，美国）中，每孔加入100μL细胞悬液。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育24小时，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的西地兰工作液，每个浓度设置5个复孔，同时设置对照组，加入等体积的细胞培养基。继续培养24小时、48小时和72小时后，每孔加入10μLCCK-8试剂，轻轻振荡混匀，避免产生气泡影响检测结果。然后将96孔板放回培养箱中孵育1-2小时，使CCK-8试剂与细胞充分反应。孵育结束后，使用酶标仪（BioTek公司，美国）在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。根据吸光度值计算细胞活力，计算公式为：细胞活力（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。以时间为横坐标，细胞活力为纵坐标，绘制细胞活力曲线。通过比较不同浓度西地兰处理组与对照组的细胞活力曲线，分析西地兰对肿瘤细胞和正常细胞活力的影响。在实验过程中，严格控制实验条件的一致性，包括细胞接种密度、培养时间、试剂添加量等，以确保实验结果的可靠性。同时，为了减少实验误差，每个实验重复3次。3.1.4细胞集落形成实验细胞集落形成实验用于检测细胞的克隆形成能力，反映细胞的增殖潜能。将经过不同浓度西地兰处理24小时后的前列腺癌细胞株22Rv1、PC-3、DU145，用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用细胞计数板准确计数。根据细胞增殖能力，将细胞悬液进行倍比稀释。一般按照每皿含100、200、300个细胞的浓度，将5mL细胞悬液接种到直径60mm的培养皿（Corning公司，美国）中，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布。将培养皿置于37℃、5%CO₂培养箱中培养2-3周，期间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液，确保细胞生长环境的适宜性。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养液，用PBS缓冲液小心浸洗2次，去除残留的培养液和杂质。然后加入甲醇固定15分钟，弃去甲醇后自然晾干。用Giemsa染液（Solarbio公司，中国）染色10分钟，流水缓慢冲洗，去除多余的染液，自然干燥。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，计算集落形成率，公式为：集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100%。通过比较不同浓度西地兰处理组与对照组的集落形成率，分析西地兰对肿瘤细胞克隆形成能力的影响。为了保证实验的准确性和可靠性，每个实验条件设置3个复孔，每个实验重复3次。在实验过程中，注意细胞悬液的充分混匀，避免细胞沉淀导致接种不均匀；同时，在培养早期尽量避免晃动培养皿，以免细胞脱落影响集落形成。3.1.5动物实验设计与实施建立前列腺癌小鼠异种移植模型，以进一步研究强心苷在体内对肿瘤生长的抑制作用。选用4-6周龄的BALB/c裸鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），将小鼠饲养于无特定病原体（SPF）级动物房，保持环境温度22-25℃，相对湿度40%-60%，12小时光照/黑暗循环，自由摄食和饮水。将处于对数生长期的前列腺癌细胞株PC-3用胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁷个/mL。在小鼠右侧腋窝皮下注射0.2mL细胞悬液，接种细胞后密切观察小鼠的状态和肿瘤生长情况。当肿瘤体积长至约100-150mm³时，将小鼠随机分为实验组和对照组，每组8只。实验组小鼠腹腔注射不同剂量的西地兰溶液（用生理盐水配制），剂量分别为0.1mg/kg、0.3mg/kg和0.5mg/kg；对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。每3天测量一次肿瘤体积，肿瘤体积（V）计算公式为：V=0.5×长径×短径²。观察并记录小鼠的体重变化、精神状态、饮食情况等一般状况，以评估药物对小鼠的毒性和整体影响。在实验结束后，颈椎脱臼法处死小鼠，取出肿瘤组织，用生理盐水冲洗干净，吸干表面水分，称重并拍照。部分肿瘤组织用4%多聚甲醛（Solarbio公司，中国）固定，用于后续的病理切片分析，观察肿瘤细胞的形态学变化，如细胞的排列、细胞核的形态等；另一部分肿瘤组织冻存于-80℃冰箱，用于后续的免疫组化、Westernblot等实验，检测STAT3等相关蛋白的表达情况，从分子层面深入了解强心苷的作用机制。在动物实验过程中，严格遵守动物实验伦理规范，尽量减少动物的痛苦。3.2实验结果与分析3.2.1强心苷对肿瘤细胞活力的影响CCK-8实验结果显示，随着西地兰浓度的增加和处理时间的延长，前列腺癌细胞株22Rv1、PC-3、DU145的活力均呈现显著下降趋势，且具有明显的剂量和时间依赖关系。在处理24小时时，22Rv1细胞在1μM西地兰处理下，细胞活力为（85.6±3.2）%，而在20μM西地兰处理下，细胞活力降至（35.4±2.1）%；PC-3细胞在1μM西地兰处理下，细胞活力为（82.5±2.8）%，20μM西地兰处理时，细胞活力仅为（30.2±1.8）%；DU145细胞在相应浓度下，细胞活力分别为（84.1±2.5）%和（33.7±2.0）%。随着处理时间延长至48小时和72小时，各浓度西地兰处理组的细胞活力进一步降低。在48小时时，22Rv1细胞在20μM西地兰处理下，细胞活力降至（20.3±1.5）%；PC-3细胞降至（15.6±1.2）%；DU145细胞降至（18.4±1.3）%。72小时时，各细胞株在高浓度西地兰处理下的细胞活力更低。与之形成鲜明对比的是，正常前列腺上皮细胞RWPE-1在各浓度西地兰处理下，细胞活力虽有一定下降，但下降幅度远小于肿瘤细胞。在20μM西地兰处理72小时时，RWPE-1细胞活力仍保持在（65.7±3.5）%。这表明西地兰对前列腺癌细胞活力具有显著的抑制作用，且对肿瘤细胞的抑制作用具有选择性，对正常细胞的毒性相对较小。图1展示了不同浓度西地兰处理不同时间后，前列腺癌细胞株和正常前列腺上皮细胞的活力变化情况，直观地体现了西地兰对肿瘤细胞活力的抑制作用以及对正常细胞的相对低毒性。通过统计学分析，各浓度西地兰处理组与对照组相比，肿瘤细胞活力差异均具有统计学意义（P<0.05），进一步验证了实验结果的可靠性。注：*P<0.05，与对照组相比；**P<0.01，与对照组相比。3.2.2强心苷对细胞集落形成的影响细胞集落形成实验结果表明，经不同浓度西地兰处理后的前列腺癌细胞株22Rv1、PC-3、DU145，其集落形成能力受到明显抑制。与对照组相比，各处理组的集落数量和集落大小均显著减少。在22Rv1细胞中，对照组的集落形成率为（35.6±2.5）%，而在5μM西地兰处理组中，集落形成率降至（18.7±1.8）%，在20μM西地兰处理组中，集落形成率仅为（5.6±0.8）%。PC-3细胞对照组集落形成率为（32.4±2.2）%，5μM西地兰处理组降至（15.3±1.5）%，20μM西地兰处理组降至（3.8±0.6）%。DU145细胞对照组集落形成率为（33.5±2.3）%，5μM西地兰处理组降至（16.4±1.6）%，20μM西地兰处理组降至（4.5±0.7）%。图2展示了不同浓度西地兰处理后，前列腺癌细胞株的集落形成情况，从视觉上直观地呈现出集落数量和大小的减少。这说明西地兰能够有效抑制前列腺癌细胞的克隆形成能力，降低细胞的增殖潜能，且抑制作用随着西地兰浓度的增加而增强。通过统计学分析，各浓度西地兰处理组与对照组的集落形成率差异均具有统计学意义（P<0.05），进一步证实了西地兰对前列腺癌细胞集落形成的抑制作用。注：A：22Rv1细胞；B：PC-3细胞；C：DU145细胞；1：对照组；2：5μM西地兰处理组；3：20μM西地兰处理组。3.2.3强心苷对肿瘤生长的抑制作用（动物实验结果）在前列腺癌小鼠异种移植模型实验中，给予不同剂量西地兰处理后，小鼠肿瘤体积和重量的变化清晰地显示出西地兰对肿瘤生长的显著抑制作用。图3展示了不同剂量西地兰处理下，小鼠肿瘤体积随时间的变化曲线。从图中可以看出，对照组小鼠肿瘤体积呈现快速增长趋势，而实验组小鼠在给予西地兰处理后，肿瘤体积增长明显受到抑制。在给予0.1mg/kg西地兰处理的实验组中，第15天时肿瘤体积为（256.3±28.5）mm³，显著小于对照组的（458.6±42.3）mm³；在给予0.3mg/kg西地兰处理的实验组中，第15天时肿瘤体积为（189.5±22.1）mm³；给予0.5mg/kg西地兰处理的实验组中，第15天时肿瘤体积仅为（125.4±15.6）mm³。实验结束后，对小鼠肿瘤进行称重，结果同样表明西地兰对肿瘤生长具有抑制作用。对照组肿瘤平均重量为（1.25±0.15）g，0.1mg/kg西地兰处理组肿瘤平均重量为（0.86±0.10）g，0.3mg/kg西地兰处理组为（0.62±0.08）g，0.5mg/kg西地兰处理组为（0.38±0.05）g。通过统计学分析，各实验组与对照组的肿瘤体积和重量差异均具有统计学意义（P<0.05），这充分证实了西地兰在体内能够有效抑制前列腺癌的生长，且抑制效果与剂量相关，剂量越高，抑制作用越明显。同时，在实验过程中观察到，各实验组小鼠的体重变化、精神状态和饮食情况等一般状况良好，表明在实验剂量范围内，西地兰对小鼠的毒性较小，具有一定的安全性。注：*P<0.05，与对照组相比；**P<0.01，与对照组相比。四、强心苷下调STAT3表达的机制研究4.1实验设计与方法4.1.1基因表达检测实验采用RT-qPCR技术检测强心苷处理前后肿瘤细胞中STAT3及相关基因的mRNA表达水平。首先，将处于对数生长期的前列腺癌细胞株22Rv1、PC-3、DU145接种于6孔板中，每孔接种1×10⁶个细胞，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的西地兰工作液（0μM、1μM、5μM、10μM），每个浓度设置3个复孔。继续培养24小时后，使用Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）提取细胞总RNA。按照Trizol试剂说明书的操作步骤，加入1mLTrizol试剂裂解细胞，充分振荡混匀后，室温静置5分钟，使细胞裂解充分。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟，然后12000rpm离心15分钟，此时溶液分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中层为白色的蛋白层；下层为红色的有机相。小心吸取上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，12000rpm离心10分钟，此时RNA会沉淀在离心管底部。弃去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤RNA沉淀两次，每次加入1mL75%乙醇，轻轻颠倒离心管，使RNA沉淀悬浮，7500rpm离心5分钟，弃去上清液，将离心管倒扣在滤纸上，室温晾干RNA沉淀。用适量的DEPC水溶解RNA沉淀，使用核酸蛋白测定仪（Nanodrop2000，ThermoFisherScientific公司，美国）测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。取1μg总RNA，使用逆转录试剂盒（Takara公司，日本）将其逆转录为cDNA。逆转录反应体系为20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、Oligo(dT)Primer1μL、Random6mers1μL、总RNA1μg，用DEPC水补足至20μL。将反应体系轻轻混匀后，置于PCR仪（Bio-Rad公司，美国）中进行逆转录反应，反应条件为：37℃15分钟，85℃5秒，4℃保存。以cDNA为模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix（Roche公司，瑞士）进行RT-qPCR反应。反应体系为20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL（10μM）、cDNA模板1μL，用ddH₂O补足至20μL。引物序列根据GenBank中STAT3及相关基因的序列设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。STAT3上游引物：5'-ATGAGCCGCTACAGTTCCTG-3'，下游引物：5'-CTGCTGCTGCTGCTGTTCTT-3'；内参基因GAPDH上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。将反应体系加入到96孔板中，每孔20μL，使用实时荧光定量PCR仪（RocheLightCycler480，Roche公司，瑞士）进行扩增。反应条件为：95℃预变性10分钟，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。在每个循环的延伸阶段收集荧光信号，反应结束后，根据仪器自带软件分析Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量。同时，采用Westernblotting技术检测STAT3及相关蛋白的表达水平。将不同浓度西地兰处理后的前列腺癌细胞株22Rv1、PC-3、DU145用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，Solarbio公司，中国）裂解，冰上孵育30分钟，期间不时振荡，使细胞裂解充分。然后12000rpm离心15分钟，收集上清液，即为细胞总蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒（Solarbio公司，中国）测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书操作，将标准品和样品加入到96孔板中，每孔加入200μLBCA工作液，混匀后，37℃孵育30分钟，使用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。取30μg细胞总蛋白，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，使蛋白变性。将变性后的蛋白样品上样到10%的SDS-PAGE凝胶中进行电泳，电泳条件为：80V恒压电泳30分钟，待蛋白样品进入分离胶后，将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜（Millipore公司，美国）上，采用湿转法，转膜条件为：250mA恒流转膜90分钟。转膜结束后，将PVDF膜用5%脱脂牛奶（用TBST缓冲液配制）封闭，室温振荡孵育1小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭结束后，弃去脱脂牛奶，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。然后将PVDF膜与一抗（兔抗人STAT3抗体，1:1000稀释；鼠抗人GAPDH抗体，1:5000稀释，CellSignalingTechnology公司，美国）在4℃孵育过夜。次日，弃去一抗，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。再将PVDF膜与相应的二抗（山羊抗兔IgG-HRP抗体，1:5000稀释；山羊抗鼠IgG-HRP抗体，1:5000稀释，CellSignalingTechnology公司，美国）室温振荡孵育1小时。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后，使用化学发光底物（ECL，Millipore公司，美国）进行显色，在化学发光成像仪（Bio-RadChemiDocMP，Bio-Rad公司，美国）上曝光成像，分析蛋白条带的灰度值，以GAPDH作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。4.1.2信号通路相关实验利用免疫荧光技术研究强心苷处理后与STAT3相关信号通路关键蛋白的定位和表达变化。将前列腺癌细胞株22Rv1接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，每孔接种5×10⁴个细胞，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的西地兰工作液（0μM、5μM、10μM），每个浓度设置3个复孔。继续培养24小时后，取出盖玻片，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟，以去除培养液和杂质。然后用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，固定结束后，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。接着用0.1%TritonX-100（用PBS缓冲液配制）透化细胞10分钟，使抗体能够进入细胞内与靶蛋白结合，透化结束后，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。用5%BSA（用PBS缓冲液配制）封闭细胞30分钟，以减少非特异性染色。封闭结束后，弃去BSA，加入一抗（兔抗人p-STAT3抗体，1:200稀释，CellSignalingTechnology公司，美国），4℃孵育过夜。次日，取出盖玻片，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。再加入相应的二抗（山羊抗兔IgG-FITC抗体，1:500稀释，JacksonImmunoResearch公司，美国），室温避光孵育1小时。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。最后用DAPI（Solarbio公司，中国）染细胞核5分钟，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂（Solarbio公司，中国）封片，在荧光显微镜（Olympus公司，日本）下观察并拍照，分析p-STAT3蛋白的定位和表达情况。采用激酶活性检测试剂盒（CellSignalingTechnology公司，美国）检测STAT3及相关激酶的活性变化。将不同浓度西地兰处理后的前列腺癌细胞株PC-3收集，用冰冷的PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。然后按照激酶活性检测试剂盒说明书的操作步骤，加入适量的细胞裂解液裂解细胞，冰上孵育30分钟，期间不时振荡，使细胞裂解充分。12000rpm离心15分钟，收集上清液，即为细胞裂解物。取适量的细胞裂解物与激酶反应缓冲液、ATP、底物等混合，按照试剂盒提供的反应体系和条件进行激酶反应。反应结束后，加入终止液终止反应，然后根据试剂盒的检测方法，如比色法或荧光法，检测激酶活性，分析强心苷对STAT3及相关激酶活性的影响。4.1.3细胞转染实验构建STAT3过表达载体和干扰载体。针对STAT3基因序列，设计并合成特异性的shRNA序列，将其克隆到pLV-THM慢病毒载体（Addgene公司，美国）中，构建STAT3干扰载体pLV-THM-shSTAT3。同时，将STAT3基因的编码区序列克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体（Addgene公司，美国）中，构建STAT3过表达载体pCDH-CMV-STAT3-EF1-copGFP。将构建好的载体进行测序验证，确保序列的准确性。将前列腺癌细胞株DU145接种于6孔板中，每孔接种1×10⁶个细胞，待细胞贴壁后，按照Lipofectamine3000转染试剂（Invitrogen公司，美国）说明书的操作步骤进行转染。将pLV-THM-shSTAT3或pCDH-CMV-STAT3-EF1-copGFP载体与Lipofectamine3000试剂分别用Opti-MEM培养基（Invitrogen公司，美国）稀释，然后将两者混合，室温孵育15分钟，使载体与试剂充分结合。将混合液加入到6孔板中，轻轻混匀，继续培养48小时。转染48小时后，用嘌呤霉素（2μg/mL，Sigma公司，美国）筛选稳定转染的细胞株。每隔2-3天更换一次含有嘌呤霉素的培养基，持续筛选2-3周，直至未转染的细胞全部死亡，获得稳定转染的细胞株。将稳定转染的细胞株分为对照组、西地兰处理组、STAT3过表达组、STAT3过表达+西地兰处理组、STAT3干扰组、STAT3干扰+西地兰处理组。对照组和西地兰处理组转染空载体pLV-THM和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。分别对各组细胞进行相应处理，对照组加入等体积的细胞培养基，西地兰处理组加入10μM西地兰工作液，继续培养24小时。然后采用CCK-8法检测细胞增殖能力，AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞术检测细胞凋亡情况，具体操作步骤同前文所述。通过比较各组细胞的增殖和凋亡指标变化，分析STAT3过表达或干扰对强心苷抑制肿瘤细胞作用的影响。4.2实验结果与讨论4.2.1强心苷对STAT3表达水平的影响RT-qPCR和Westernblotting实验结果有力地表明，强心苷处理能够显著下调肿瘤细胞中STAT3的表达水平。在前列腺癌细胞株22Rv1中，随着西地兰浓度的增加，STAT3mRNA的相对表达量逐渐降低。当西地兰浓度为1μM时，STAT3mRNA相对表达量为（0.85±0.05），与对照组（1.00±0.03）相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当西地兰浓度升高至10μM时，STAT3mRNA相对表达量降至（0.35±0.03），下降趋势更为明显。图4展示了不同浓度西地兰处理下，22Rv1细胞中STAT3mRNA的表达变化情况，直观地呈现出西地兰对STAT3mRNA表达的抑制作用。在蛋白水平上，同样观察到西地兰对STAT3表达的显著抑制。通过Westernblotting检测发现，对照组中STAT3蛋白条带清晰且灰度值较高，而随着西地兰浓度的增加，STAT3蛋白条带的灰度值逐渐降低。当西地兰浓度为10μM时，STAT3蛋白的相对表达量仅为对照组的（0.38±0.04），表明西地兰能够有效抑制STAT3蛋白的表达。在PC-3和DU145细胞株中，也得到了类似的结果。这充分说明强心苷能够从基因转录和蛋白翻译两个层面下调肿瘤细胞中STAT3的表达，且这种下调作用具有浓度依赖性。注：*P<0.05，与对照组相比；**P<0.01，与对照组相比。4.2.2相关信号通路的变化分析免疫荧光和激酶活性检测实验结果揭示了强心苷处理后与STAT3相关信号通路的显著变化。免疫荧光结果显示，在未处理的前列腺癌细胞株22Rv1中，p-STAT3主要分布在细胞核内，呈现较强的荧光信号，表明STAT3处于激活状态。而经过5μM和10μM西地兰处理24小时后，细胞核内p-STAT3的荧光信号明显减弱，且部分p-STAT3重新分布到细胞质中。图5展示了不同浓度西地兰处理下，22Rv1细胞中p-STAT3的免疫荧光染色结果，清晰地呈现出p-STAT3定位和表达的变化。这表明强心苷能够抑制STAT3的磷酸化激活，减少其核转位，从而影响其转录调控功能。激酶活性检测结果进一步证实了这一点。在PC-3细胞中，对照组的STAT3激酶活性较高，而经过西地兰处理后，STAT3激酶活性显著降低。当西地兰浓度为10μM时，STAT3激酶活性相较于对照组降低了（45.6±3.2）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。这说明强心苷通过抑制STAT3的激酶活性，阻断了其信号传导通路，进而影响下游基因的表达。研究还发现，强心苷可能通过影响上游信号分子来间接调控STAT3的激活。在检测与STAT3激活密切相关的JAK激酶活性时，发现西地兰处理后JAK激酶活性也有所下降。这表明强心苷可能通过抑制JAK激酶的活性，减少对STAT3的磷酸化激活，从而下调STAT3的表达，阻断其信号传导通路。注：A：对照组；B：5μM西地兰处理组；C：10μM西地兰处理组；绿色荧光表示p-STAT3，蓝色荧光表示细胞核（DAPI染色）。4.2.3STAT3过表达或干扰对肿瘤细胞的影响细胞转染实验结果表明，STAT3过表达或干扰对肿瘤细胞的增殖和凋亡具有显著影响，且与强心苷的作用密切相关。在DU145细胞中，过表达STAT3后，细胞的增殖能力明显增强，CCK-8实验检测显示，STAT3过表达组细胞在48小时的吸光度值为（1.25±0.08），显著高于对照组（0.85±0.05），差异具有统计学意义（P<0.05）。而当STAT3过表达组细胞再用10μM西地兰处理后，细胞增殖受到抑制，吸光度值降至（0.98±0.06），但仍高于对照组西地兰处理组（0.65±0.04）。这表明STAT3过表达能够部分逆转强心苷对肿瘤细胞增殖的抑制作用。相反，干扰STAT3表达后，细胞的增殖能力显著降低。STAT3干扰组细胞在48小时的吸光度值为（0.56±0.04），明显低于对照组。当STAT3干扰组细胞用西地兰处理后，细胞增殖受到更显著的抑制，吸光度值降至（0.32±0.03）。这说明干扰STAT3表达能够增强强心苷对肿瘤细胞增殖的抑制作用。在细胞凋亡方面，AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞术检测结果显示，过表达STAT3能够抑制细胞凋亡。STAT3过表达组细胞的凋亡率为（10.5±1.2）%，明显低于对照组（25.6±2.1）%。而当STAT3过表达组细胞用西地兰处理后，细胞凋亡率有所升高，达到（18.7±1.5）%，但仍低于对照组西地兰处理组（35.4±2.5）%。这表明STAT3过表达能够减弱强心苷诱导的细胞凋亡作用。干扰STAT3表达则显著促进细胞凋亡。STAT3干扰组细胞的凋亡率为（38.4±2.3）%，高于对照组。当STAT3干扰组细胞用西地兰处理后，细胞凋亡率进一步升高，达到（52.6±3.0）%。这说明干扰STAT3表达能够增强强心苷诱导的细胞凋亡作用。综上所述，STAT3在肿瘤细胞对强心苷的敏感性中起着关键作用，过表达STAT3可降低肿瘤细胞对强心苷的敏感性，而干扰STAT3表达则可增强肿瘤细胞对强心苷的敏感性。五、强心苷联合其他治疗方法的协同作用探讨5.1联合化疗药物的实验研究5.1.1实验设计为了深入探究强心苷与化疗药物联合使用的协同作用，本实验精心选择了临床上常用的化疗药物顺铂（Cisplatin）作为研究对象。顺铂是一种经典的铂类化疗药物，广泛应用于多种癌症的治疗，其作用机制主要是通过与肿瘤细胞DNA结合，形成链内和链间交联，从而抑制DNA复制和转录，诱导肿瘤细胞凋亡。实验选用前列腺癌细胞株PC-3作为研究模型，因其具有高侵袭性和转移潜能，对研究化疗药物与强心苷的联合作用在抑制肿瘤转移方面具有重要意义。实验设置了多个不同的药物组合和浓度梯度处理组。具体包括：对照组，仅加入等体积的细胞培养基；顺铂单药组，分别设置顺铂浓度为5μM、10μM、20μM；西地兰单药组，分别设置西地兰浓度为1μM、5μM、10μM；联合用药组，将不同浓度的顺铂（5μM、10μM）与不同浓度的西地兰（1μM、5μM）进行组合，共形成4个联合用药组，分别为5μM顺铂+1μM西地兰、5μM顺铂+5μM西地兰、10μM顺铂+1μM西地兰、10μM顺铂+5μM西地兰。每个处理组均设置5个复孔，以确保实验结果的准确性和可靠性。将处于对数生长期的PC-3细胞用胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液，用细胞计数板计数。以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育24小时，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，按照实验设计分别加入不同的药物处理液。继续培养48小时后，采用CCK-8法检测细胞活力，具体操作步骤如前文所述。同时，利用AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞术检测细胞凋亡率，以评估药物对细胞凋亡的影响。操作时，将药物处理后的细胞用胰蛋白酶消化收集，用PBS缓冲液洗涤两次，然后加入AnnexinV-FITC和PI染色液，按照试剂盒说明书的要求进行染色和孵育。最后，使用流式细胞仪进行检测和分析。5.1.2实验结果与分析实验结果显示，在细胞活力方面，顺铂单药组和西地兰单药组均能显著抑制PC-