创新化学实验与研究基金资助项目答辩 D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电

创新化学实验与研究基金资助项目答辩D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究专业：化学工程与工艺导师：报告人：/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究实验及讨论研究方案研究背景选题意义结论/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究选题意义D-丝氨酸是哺乳动物脑内NMDA型谷氨酸受体(NR1/NR2型)的辅助激动剂，在动物的大脑中一生都维持着很高的浓度；脑内的神经元和胶质细胞都含有D-丝氨酸并且具有特异的生物合成、胞外释放、摄取和降解途径。D-丝氨酸作为一种重要的胶质细胞递质，在中枢神经系统参与调节突触可塑性、感觉信息传递、神经发育及神经兴奋性毒性等生理及病理过程,并逐渐成为阿尔采末病(AD)等神经系统疾病新的治疗靶点。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究研究背景如何分离检测D-丝氨酸？针对其外消旋体的拆分已开发了优先结晶法、形成非对映体立体异构体结晶法、酶促法、色谱法（包括：液相色谱、气相色谱、薄层色谱、配位色谱、离子交换色谱）毛细管电泳法和萃取法等。存在的问题：丝氨酸由于其结构简单，分离难度较大，且没有紫外或荧光吸收，常需衍生后才可得到检测。

如何建立D-Ser有效检测的快速方法，大大降低检测成本，仍是分析工作者面临的具有挑战性的课题。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究研究背景高效毛细管电泳（HPCE）是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，因具有低耗、快速、高效、环境友好等特点而成为新兴的手性分离分析中极具吸引力的分析方法。非接触电导检测是近年来出现的新的检测技术，对于缺乏紫外-可见吸收基团氨基酸则无须先作衍生化处理,可以进行直接检测。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究研究方案本课题提出采用高效毛细管电泳-非接触式电导法，以铜-L-精氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二元手性选择体系，建立快速、灵敏和低成本的D-丝氨酸的分离分析新方法。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究分离分析原理毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现高效，快速的新型液相分离分析技术；而非接触式电导检测器是近年发展起来的一种新型电导检测方法。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究实验部分仪器和试剂手性选择体系的选择最佳实验条件的确定线性范围、重现性、检出限测定/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究仪器CES2008型毛细管电泳仪/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究实验试剂氢氧化钠(NaOH，广州化学试剂厂，分析纯)、柠檬酸(Cit，广州化学试剂厂，分析纯)、乙酸铜(Cu(CH3COO)2·H2O，天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯)、羟丙基甲基纤维素(HPMC，山东赫达股份有限公司，分析纯)、D,L-丝氨酸、L-丝氨酸(D,L-Ser、L-Ser，国药集团化学试剂有限公司，层析纯)、L-精氨酸(L-Arg，上海伯奥生物科技有限公司，层析纯)。所用水为超纯水。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究手性选择体系的选择仅用Cu(Ⅱ)丝氨酸对映体未能达到分离Cu(Ⅱ)+L-Arg分离度Rs=1.6Cu(Ⅱ)-L-Arg+HPMC分离度Rs=2.1/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究手性选择体系的选择图1两种不同的手性选择体系对分离度的影响Fig.1Theeffectoftwodifferentchiralselectorsontheresolutiona.Cu(Ⅱ)-L-Argb.√Cu(Ⅱ)-L-Arg-HPMC/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究铜离子浓度对分离度的影响图2Cu(Ⅱ)浓度对分离度的影响Fig.2TheeffectofCu(Ⅱ)concentrationontheresolution本实验选择Cu(Ⅱ)的最佳浓度为2.5mmol/L。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究L-精氨酸浓度对分离度的影响图3L-精氨酸浓度对分离度的影响Fig.3TheeffectofL-Argconcentrationontheresolution本实验选择L-精氨酸的最佳浓度为5.0mmol/L。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究HPMC浓度对分离度的影响图4HPMC浓度对分离度的影响Fig.4TheeffectofHPMCconcentrationontheresolution因此，本实验选择HPMC最佳浓度为10mg/L。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响NaOH-Cit体系在非接触电导检测法中有良好的基线和灵敏的响应，但缓冲溶液浓度太高易引起基线漂移。通过实验发现，柠檬酸浓度对对映体分离的影响很大，浓度太低，丝氨酸不出峰；浓度太高，水峰提前，对映体也得不到分离，见下表。表1柠檬酸浓度对分离度的影响故实验选择Cit浓度为0.4mmol/L。CCit(mmol/L)0.20.40.60.81.0Resolution(Rs)--2.31.8----/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响固定柠檬酸浓度后，加入NaOH以调节运行液的pH。在2～4mmol/L浓度范围内考察NaOH浓度对分离度的影响，见表2。表2NaOH浓度对分离度的影响故实验选择NaOH浓度为3.0mmol/L。CNaOH(mmol/L)2.02.43.03.44.0Resolution(Rs)0.91.62.41.91.9/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响图5pH对分离度的影响Fig.5TheeffectofpHontheresolution/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究1电动进样对离子组分存在进样歧视2重力进样无进样歧视3扩散进样进样具双向性，有进样歧视进样方式的选择故本实验采用重力进样。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究进样方式的选择图6进样时间对分离度的影响Fig.6Theeffectofinjectiontimeontheresolution进样时间为60s时分离度最高，Rs=2.6。/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究进样方式的选择此外，进样时间还对峰高及峰面积有较大影响，见表3。表3进样时间的影响故实验选择Cit浓度为0.4mmol/L。进样时间（s）304050607080100120峰高L-Ser4955748410010513964D-Ser51689210912212917082峰面积L-Ser10611460211926832916296245701444D-Ser11021683268833843354346850651850/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究分离电压的选择本实验考察了分离电压从10kV至15kV对丝氨酸对映体分离的影响，见表4。表4分离电压对迁移时间和分离度的影响故实验选择Cit浓度为0.4mmol/L。workingvoltage(kV)101213√1415Resolution(Rs)2.62.32.01.81.6MigratingtimeofD-Ser(min)48.832.726.523.521.8/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究运行液体系：3.0mmol/LNaOH+0.4mmol/LCit+2.5mmol/LCu(Ac)2+5.0mmol/LL-Arg+10.0mg/LHPMC（pH=9.67）重力进样，进样时间为60s分离电压为13kV

最佳实验条件/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究线性范围与检出限图7D-丝氨酸线性校正曲线图表5线性范围与检出限

待测组分回归方程相关系数线性范围（mg/L）检出限（mg/L）D-丝氨酸y=-123.8+981.9xr=0.99991～1000.5/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究重现性测定在相同条件下，D-Ser以3mg/L的浓度重复进样4次，测其重现性，见表6。表6重现性测定结果表明：实验证明本方法具有较高的灵敏度和良好的重现性。序号1234RSD/%迁移时间（min）23.124.722.623.33.9峰面积24002473261626805.0/sundae_meng实际样品分析图8D-丝氨酸小鼠脊髓样品HPCE-C4D谱图Fig.8TheelectropherogramofD-SerinratspinalcordD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究拆分机理初步探讨在缓冲溶液中，铜离子与L-精氨酸以1∶2形成三元络合物：L-Arg+Cu(Ⅱ)⇋(L-Arg)CuL-Arg+(L-Arg)Cu(Ⅱ)⇋Cu(L-Arg)2当丝氨酸对映体进入缓冲系统时，D-Ser和L-Ser分别取代一分子的L-Arg,形成两种不同的三元络合物:L-Ser+Cu(L-Arg)2⇋(L-Arg)Cu(L-Ser)+L-ArgD-Ser+Cu(L-Arg)2⇋(L-Arg)Cu(D-Ser)+L-Arg/sundae_mengD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究拆分机理初步探讨根据(L-Arg)Cu(L-Ser)和(L-Arg)Cu(D-Ser)稳定性和光学结构的差异，引起二者电泳淌度的不同，D,L-Ser得到分离，本实验中L-Ser比D-Ser先流出。由于(L-Arg)Cu(L-Ser)和(L-Arg)Cu(D-Ser)的稳定性系数差异不够大，丝氨酸对映体分离度较小。缓冲溶液中加入HPMC后，HPMC与Cu(Ⅱ)-L-Arg形成二元手性选择体系，D,L-Ser分离度提高。/sundae_mengD-丝氨酸