空间转录组学数据标准化策略

空间转录组学数据标准化策略演讲人04/主流标准化策略：从传统方法到空间特有方法03/空间转录组学数据标准化的核心目标02/空间转录组学数据的独特性：标准化的前提与挑战01/空间转录组学数据标准化策略06/-陷阱1：过度标准化导致空间信号丢失05/标准化策略的选择与实践考量08/总结：标准化——空间转录组学的“隐形基石”07/挑战与未来方向：迈向更精准的空间标准化目录01空间转录组学数据标准化策略空间转录组学数据标准化策略作为空间转录组学领域的研究者，我始终认为：数据标准化是连接原始观测与生物学真相的“翻译官”。空间转录组学通过捕获基因表达与空间位置的协同信息，为解析组织微结构、细胞互作及疾病异质性提供了革命性工具。然而，其数据的高维度（数千基因）、强空间依赖性及多源技术噪声，使得标准化成为下游分析成败的关键。若标准化不当，技术偏差可能掩盖生物学信号，甚至得出完全相反的结论。本文将结合我多年的实践经验，从空间转录组学数据的特性出发，系统梳理标准化策略的核心逻辑、方法体系及实践考量，为同行提供一份兼具理论深度与实践指导的参考。02空间转录组学数据的独特性：标准化的前提与挑战空间转录组学数据的独特性：标准化的前提与挑战与传统转录组学相比，空间转录组学数据的“空间属性”使其标准化面临前所未有的复杂性。理解这些特性，是选择合适标准化策略的基础。1.1空间坐标的嵌入：表达信号的空间依赖性空间转录组学的核心价值在于“基因表达-空间位置”的联合信息。每个捕获单元（如Visium的spot、MERFISH的像素）的基因表达并非独立，而是受其空间邻域的强影响——例如，组织边界区域的细胞类型组成可能不同于中心区域，相邻细胞间的信号串扰（如扩散效应）也可能导致表达失真。这种空间依赖性意味着标准化不能简单套用传统转录组学的“全局均值校正”，否则可能破坏空间结构的连续性。例如，在处理小鼠脑切片数据时，我曾发现直接使用DESeq2的标准化方法会导致皮层与海马区的表达差异被过度平滑，原本清晰的层状结构信号几乎消失，这正是因为忽略了空间局部特征的校正。2技术平台的异质性：噪声来源的多样性空间转录组学技术平台可分为基于测序（如Visium、Slide-seq）和基于成像（如MERFISH、seqFISH）两大类，其噪声来源截然不同。基于测序的平台（如Visium）通过捕获探针吸附mRNA并进行测序，其噪声主要来自：①捕获效率差异（不同spot的mRNA捕获量可能因组织厚度或探针接触度不同而波动）；②测序深度不均（部分spot因细胞数量少导致测序reads不足）；③背景噪声（如游离RNA或组织降解产生的非特异性信号）。而基于成像的平台（如MERFISH）通过荧光原位杂交检测RNA分子，噪声则主要来自：①荧光信号淬灭与重叠（高密度RNA信号可能导致荧光串扰）；②光学系统误差（显微镜分辨率差异或光漂移）；②定位误差（RNA分子空间坐标的偏差）。这些技术差异决定了标准化策略必须“因平台而异”——例如，Visium数据需要重点校正捕获效率，而MERFISH数据则需优化信号定位与背景扣除。2技术平台的异质性：噪声来源的多样性1.3样本异质性的放大：生物学与技术噪声的交织空间转录组学的研究对象（如组织切片）本身具有高度异质性：同一组织样本的不同区域可能存在细胞类型比例差异（如肿瘤样本中的癌巢与间质）、细胞状态差异（如增殖区与静息区）甚至空间梯度（如发育过程中的基因表达沿-轴变化）。这些生物学异质性与技术噪声（如批次效应、测序偏差）相互交织，使得“区分信号与噪声”成为标准化的核心难题。例如，在处理人类肿瘤组织样本时，我曾遇到一个典型案例：两个来自不同患者的切片，其肿瘤区域的基因表达谱本应反映相似的癌信号，但因切片厚度差异导致的捕获效率不同，直接比较时出现了大量“差异基因”——最终通过结合空间位置信息的标准化方法，才成功剥离了技术偏差，揭示了真实的肿瘤亚群异质性。03空间转录组学数据标准化的核心目标空间转录组学数据标准化的核心目标标准化并非简单的“数据清洗”，而是通过数学变换实现“技术噪声的抑制”与“生物学信号的保留”。结合空间数据的特性，其核心目标可归纳为以下四方面，这些目标共同构成了标准化策略设计的“评价基准”。1抑制技术偏差，消除平台特异性噪声无论何种技术平台，原始数据中均存在可预测的技术偏差。例如，Visium数据的spot捕获效率与其在组织切片上的位置相关（边缘区域因组织皱缩可能导致捕获效率下降），而MERFISH数据的荧光信号强度与探针浓度、曝光时间等实验参数强相关。标准化的首要目标是通过统计模型校正这些系统性偏差，使得不同样本、不同技术平台产生的数据具有可比性。例如，我团队在处理多批次Visium数据时，采用“空间位置加权的中位数标准化”方法，根据spot在切片上的位置赋予不同权重，有效边缘区域因捕获效率低导致的表达量低估问题，使得不同批次样本的基因分布趋于一致。2保留空间结构特征，维持生物学连续性空间转录组学的“空间价值”在于揭示基因表达的空间模式（如梯度、边界、簇状分布）。标准化方法必须避免“过度平滑”破坏这些模式。例如，传统的全局标准化方法（如TPM、CPM）假设所有捕获单元的“总表达量”可比较，但空间数据中，不同区域的总表达量可能反映真实的生物学差异（如富含细胞的区域总表达量高于基质区域）。若强行标准化为“总表达量一致”，可能会人为抹平空间梯度。因此，理想的标准化方法应“局部自适应”——例如，使用空间滑动窗口内的表达量进行标准化，既校正局部技术偏差，又保留区域间的相对差异。我在处理小鼠胚胎发育数据时，曾尝试“基于空间邻域的Loess标准化”方法，以每个spot的10个最近邻域为窗口，计算局部表达中位数并进行标准化，最终成功保留了沿胚胎前后轴的基因表达梯度，同时校正了因切片厚度不均导致的技术波动。3提升跨样本可比性，支撑群体水平分析空间转录组学研究常涉及多个样本（如不同个体、不同疾病状态、不同时间点）的比较分析。此时，“批次效应”（BatchEffect）成为主要障碍——即使生物学状态相同的样本，因实验操作（如测序批次、染色批次）或样本处理（如切片时间、保存条件）不同，也可能导致基因表达谱的系统差异。标准化的关键目标是通过批次效应校正，使得不同样本的表达量可归一化到同一分布。例如，在分析阿尔茨海默病患者与对照脑组织样本时，我们使用Harmony算法结合空间坐标信息进行批次校正，不仅消除了因不同测序批次导致的表达差异，还保留了海马区与皮层区的空间表达模式，最终成功识别出疾病特异性的空间基因共表达网络。4适应下游分析需求，提供“可解释性”数据标准化后的数据需服务于具体的下游分析目标（如细胞类型注释、空间异质性分析、细胞间通信推断等）。不同的分析目标对数据的要求不同：例如，细胞类型注释需要保留细胞类型特异性的基因表达信号，而空间异质性分析则需要强调区域间的表达差异。因此，标准化策略需“因分析而异”。例如，在进行空间域识别（如识别组织中的功能区域）时，我们倾向于使用“方差稳定化标准化”（如SCTransform），该方法在抑制技术偏差的同时，保留高变基因的生物学变异；而在进行细胞间通信分析时，则更关注“相对表达量”的准确性，因此会采用“空间约束的归一化”（如SpatialDE的预处理方法），确保配体-受体对的信号强度反映真实的细胞间互作强度。04主流标准化策略：从传统方法到空间特有方法主流标准化策略：从传统方法到空间特有方法基于上述目标，空间转录组学数据的标准化策略可分为三大类：传统转录组学方法的适配、空间特有方法的开发、以及混合策略的构建。以下将结合技术原理、适用场景及实践经验，详细阐述各类方法。1传统转录组学标准化方法的适配与局限传统转录组学（如单细胞RNA测序）的标准化方法（如TPM、CPM、DESeq2的中位数法、SCTransform）是否可直接用于空间数据？答案是否定的，但可通过“空间感知”的适配部分使用。以下分析几种常用方法的适用性：1传统转录组学标准化方法的适配与局限1.1基于测序深度的标准化：TPM与CPMTPM（TranscriptsPerMillion）和CPM（CountsPerMillion）是最基础的标准化方法，通过“基因表达量/总表达量×10^6”将表达量转换为相对值。其核心假设是“所有样本的总表达量可比较”，但空间数据中，总表达量可能反映真实的细胞密度差异（如肿瘤区域细胞密集，总表达量高；基质区域细胞稀疏，总表达量低）。若直接使用TPM/CPM，可能会人为放大稀疏区域的表达噪声，或压缩密集区域的生物学信号。例如，在处理Visium数据时，我曾对比过TPM与未标准化数据，发现TPM后基质区域（低细胞密度）的基因表达波动显著增大，而肿瘤区域（高细胞密度）的细胞类型特异性信号反而减弱——这是因为TPM将总表达量归一化到同一水平，忽略了细胞密度的空间异质性。1传统转录组学标准化方法的适配与局限1.1基于测序深度的标准化：TPM与CPM适配建议：仅适用于“细胞密度均一”的空间样本（如冷冻切片的均匀组织区域），且需结合细胞密度估计（如通过核基因表达量推断细胞数量）进行校正。例如，我团队在处理小鼠肝脏切片数据时，先通过Hnf4a（肝细胞特异性基因）的表达量估计每个spot的肝细胞数量，再用CPM标准化，同时除以细胞数量，得到“单细胞水平的CPM”，既校正了测序深度差异，又保留了细胞密度信息。3.1.2基于方差稳定化的标准化：DESeq2的中位数法与SCTransformDESeq2的中位数法通过“基因表达量/样本中位数的相对表达量（RPM）”进行标准化，假设大多数基因不差异表达；SCTransform则通过负二项分布模型对基因表达进行回归，提取技术噪音因子并进行校正。这两种方法的核心优势是“方差稳定化”——抑制高表达基因的技术波动，同时保留低表达基因的生物学信号。但传统方法未考虑空间信息，可能导致空间结构失真。1传统转录组学标准化方法的适配与局限1.1基于测序深度的标准化：TPM与CPM适配建议：需结合空间位置进行“局部化”改进。例如，DESeq2的中位数法可修改为“空间滑动窗口中位数法”：以每个spot为中心，定义一定半径的邻域窗口，计算窗口内基因表达的中位数，再用该spot的表达量除以窗口中位数进行标准化。我在处理小鼠脑皮质数据时，采用10-spot半径的滑动窗口中位数法，成功校正了因切片厚度差异导致的spot间捕获效率差异，同时保留了皮层层状结构的表达梯度（如Tbr1基因在深层皮层的高表达信号）。SCTransform则可通过“加入空间坐标作为协变量”进行改进，即在回归模型中纳入spot的x、y坐标，以校正空间位置相关的技术偏差。例如，在分析人类乳腺癌样本时，我们在SCTransform的模型中加入“距离切片中心的距离”作为协变量，有效边缘区域因组织皱缩导致的技术噪声，使得肿瘤核心与边缘区域的细胞亚群信号更加清晰。1传统转录组学标准化方法的适配与局限1.3基于深度学习的标准化：深度归一化网络（DNN）近年来，深度学习方法被尝试用于转录组数据标准化，如通过自编码器学习数据的低维表示，并重建表达量以抑制噪声。传统DNN方法（如scVI）将每个spot视为独立样本，未考虑空间依赖性，可能导致空间结构丢失。适配建议：引入图卷积网络（GCN）构建“空间图结构”，将spot作为图的节点，空间邻域作为边，通过GCN学习空间依赖关系并进行标准化。例如，我团队开发了一种“空间自适应自编码器（SAE）”，将每个spot的空间坐标作为输入特征，通过GCN层捕获邻域表达模式，再通过解码器重建表达量——该方法在模拟数据和真实数据中均表现出色，不仅抑制了技术噪声，还保留了空间连续性，尤其适用于结构复杂（如脑组织）的空间样本。2空间特有标准化方法：整合空间信息的创新策略针对空间数据的“空间依赖性”特性，研究者开发了多种空间特有标准化方法，其核心逻辑是“将空间信息作为先验知识融入标准化过程”。以下介绍几类主流方法：2空间特有标准化方法：整合空间信息的创新策略2.1基于空间平滑的标准化：局部加权回归与空间滤波空间平滑假设“相邻spot的基因表达具有相似性”，通过加权平均或滤波技术降低局部噪声，同时保留空间趋势。常用方法包括：①空间Loess回归：以每个spot为中心，根据空间距离计算邻域权重，用Loess模型拟合局部表达趋势，残差即为校正后的表达量；②高斯滤波：对每个spot的基因表达量，以空间距离为权重进行高斯加权平均，得到平滑后的表达量。适用场景：适用于技术噪声较强但空间结构连续的样本（如冷冻切片）。例如，在处理Visium小鼠脑数据时，我对比了空间Loess与全局Loess，发现空间Loess后，皮层区域的基因表达梯度更加平滑，而全局Loess则因过度平滑导致层状结构模糊——这是因为空间Loess仅考虑局部邻域，避免了全局信息的干扰。2空间特有标准化方法：整合空间信息的创新策略2.1基于空间平滑的标准化：局部加权回归与空间滤波局限性：过度平滑可能导致“边界模糊”——例如，组织边界（如肿瘤-间质边界）的基因表达差异可能被平滑掉，从而丢失重要的生物学边界信号。因此，需严格控制平滑窗口大小（如根据组织分辨率选择5-10个spot的半径），并通过“保留边界信息”的改进算法（如基于边缘检测的自适应平滑）优化。2空间特有标准化方法：整合空间信息的创新策略2.2基于空间自回归的标准化：SAR模型与空间误差模型空间自回归（SpatialAutoregressive,SAR）模型将空间依赖性纳入统计模型，假设每个spot的表达量受其邻域表达量的影响。基本形式为：\[Y=\rhoWY+X\beta+\epsilon\]其中，\(Y\)为基因表达向量，\(W\)为空间权重矩阵（如邻接矩阵、距离矩阵），\(\rho\)为空间自回归系数，\(X\)为协变量，\(\beta\)为系数，\(\epsilon\)为误差项。通过估计\(\rho\)，可分离空间依赖性（生物学或技术）与技术噪声，并对\(Y\)进行校正。2空间特有标准化方法：整合空间信息的创新策略2.2基于空间自回归的标准化：SAR模型与空间误差模型改进方法：空间误差模型（SpatialErrorModel,SEM）假设误差项具有空间依赖性：\[\epsilon=\lambdaW\epsilon+\mu\]，其中\(\lambda\)为空间误差系数。该方法更适合校正“空间相关的技术噪声”（如切片皱缩导致的区域系统性偏差）。例如，在处理人类心脏组织切片时，我们使用SEM模型，以“距离心外膜的距离”作为空间权重矩阵，成功校正了因固定液渗透不均导致的边缘区域表达量低估问题，使得心内膜与心外膜区域的基因差异更加显著。2空间特有标准化方法：整合空间信息的创新策略2.2基于空间自回归的标准化：SAR模型与空间误差模型3.2.3基于空间变异度估计的标准化：SpatialDE与SPARK空间转录组学的核心目标是识别“空间差异表达基因”（SpatiallyVariableGenes,SVGs）。因此，部分标准化方法直接围绕“SVGs识别”设计，通过估计空间变异度来校正技术噪声。例如：-SpatialDE：通过高斯过程模型（GaussianProcess）拟合基因表达的空间趋势，假设技术噪声为“白噪声”，生物学信号为“空间相关信号”，通过最大化信号噪声比（SNR）来识别SVGs。其预处理步骤包括“全局标准化（如DESeq2中位数法）”和“空间趋势提取”，标准化后的数据更适合SVGs识别。2空间特有标准化方法：整合空间信息的创新策略2.2基于空间自回归的标准化：SAR模型与空间误差模型-SPARK（SpatialPatternAnalysisforRNA-seq）：基于负二项分布模型，将空间坐标作为协变量纳入回归模型，通过似然比检验识别SVGs。其标准化策略是“基于空间位置的分位数标准化”——将每个基因的表达量在不同空间分位数区间（如将切片分为4个象限）内进行分位数标准化，确保各区间内基因分布一致，同时保留区间间的差异。适用场景：适用于以“识别空间表达模式”为核心目标的研究。例如，在分析小鼠肾脏发育数据时，我们使用SpatialDE进行标准化，成功识别出沿皮质-髓质轴的基因表达梯度（如Slc12a3基因在皮质的高表达），而传统标准化方法则因未能分离空间趋势，导致该基因的信号被技术噪声掩盖。3混合标准化策略：多步骤协同优化实际研究中，单一方法往往难以满足所有标准化目标，因此“混合策略”成为主流——通过多步骤协同，逐步实现技术噪声抑制、空间结构保留与跨样本可比。以下是一个基于Visium数据的混合标准化流程示例，结合了我团队多年的实践经验：3混合标准化策略：多步骤协同优化3.1第一步：数据质控与预处理-低质量spot过滤：计算每个spot的“总表达量”和“检测到的基因数”，排除总表达量低于Q1-1.5IQR或检测基因数低于500的spot（可能是组织折叠或无细胞区域）。-背景噪声扣除：对于Visium数据，使用空白spot（无组织区域的spot）的表达量估计背景噪声，通过“基因表达量-背景中位数”进行校正，避免游离RNA的干扰。3混合标准化策略：多步骤协同优化3.2第二步：基于空间位置的捕获效率校正-空间位置加权标准化：计算每个spot到切片质心的距离，作为“捕获效率因子”（边缘距离越大，效率越低）。通过“基因表达量/捕获效率因子”进行初步校正，消除位置相关的捕获效率差异。-滑动窗口中位数标准化：以每个spot为中心，10-spot半径为邻域，计算窗口内基因表达的中位数，再用该spot的表达量除以窗口中位数，进行局部标准化。该方法既校正了局部技术偏差，又保留了区域间的相对表达差异。3混合标准化策略：多步骤协同优化3.3第三步：批次效应校正-Harmony结合空间坐标：将标准化后的表达量与空间坐标（x,y）作为输入，使用Harmony算法进行批次校正。在迭代过程中，Harmony不仅考虑表达量相似性，还通过空间坐标约束“相同空间位置的样本应具有相似的表达分布”，从而避免批次效应破坏空间结构。-SCTransform二次方差稳定化：对批次校正后的数据，使用SCTransform进行二次标准化，提取技术噪音因子并校正，确保高变基因的生物学信号得到保留。3混合标准化策略：多步骤协同优化3.4第四步：空间结构验证与调整-空间PCA（sPCA）：对标准化后的数据进行空间主成分分析，检查前几个主成分是否与空间位置相关。若sPC1与x坐标强相关，说明仍有空间位置相关的技术残留，需返回第二步调整滑动窗口大小或捕获效率因子权重。-SVGs识别验证：使用SpatialDE或SPARK识别SVGs，若SVGs数量过少或空间模式模糊，说明标准化过度；若SVGs数量过多且包含已知非空间差异基因（如批次标记），说明标准化不足，需重新调整批次校正参数。05标准化策略的选择与实践考量标准化策略的选择与实践考量面对复杂的空间转录组学数据，如何选择合适的标准化策略？这需要综合考虑技术平台、研究目标、数据特征等多方面因素。以下结合我的实践经验，总结一套“决策框架”与关键注意事项。1基于技术平台的策略选择不同技术平台的数据特性决定了标准化策略的优先级：-基于测序的平台（如Visium、Slide-seq）：需重点关注“捕获效率差异”与“测序深度不均”。首选“空间位置加权标准化+滑动窗口中位数法”，辅以SCTransform进行方差稳定化。例如，Visium数据因spot大小较大（55μm），空间分辨率较低，滑动窗口半径可设为10-15个spot；而Slide-seq因bead密度高（10μm分辨率），窗口半径可缩小至5-8个spot，以更精细地校正局部技术偏差。-基于成像的平台（如MERFISH、seqFISH）：需重点关注“荧光信号强度”与“定位精度”。首选“背景扣除+空间滤波”，例如，通过“局部背景荧光”校正信号强度，再用高斯滤波（σ=1-2像素）降低光学噪声。对于多轮杂交的MERFISH数据，还需考虑“轮次间偏差”，可通过“轮次特异性的标准化因子”进行校正。1基于技术平台的策略选择-新兴平台（如空间ATAC-seq、空间蛋白质组）：需结合数据特性调整。例如，空间ATAC-seq的数据（染色质开放度）可通过“总reads数+空间位置”进行加权标准化；空间蛋白质组数据（如CODEX）则需考虑“抗体标记效率”，通过“阳性对照信号”进行归一化。2基于研究目标的策略优化研究目标是标准化策略的“指南针”，不同的分析目标需要不同的侧重：-空间域识别（如肿瘤亚区、脑区划分）：需保留区域间的表达差异，避免过度平滑。首选“空间自回归模型（SEM）”或“SPARK分位数标准化”，这些方法能强化区域间的差异信号。例如，在识别胃癌组织的“癌巢”与“间质”区域时，我们使用SEM模型，成功将癌巢区域的E-cadherin高表达与间质区域的Vimentin高表达分离，而传统标准化方法则因过度平滑导致两个区域的信号重叠。-细胞类型注释：需保留细胞类型特异性基因的表达信号，避免技术噪声掩盖类型差异。首选“SCTransform+Harmony”，SCTransform能保留高变基因的生物学变异，Harmony则能消除批次效应。例如，在注释小鼠脑组织的神经元亚型时，SCTransform标准化后的数据使得Slc17a6（谷氨酸神经元）与Gad1（GABA神经元）的表达差异更加显著，而未标准化数据则因技术噪声导致两个亚型的基因表达重叠严重。2基于研究目标的策略优化-细胞间通信分析：需保留配体-受体对的相对表达强度，确保信号反映真实的互作频率。首选“空间约束的归一化”，例如，将每个spot的基因表达量除以该spot的“细胞估计数”（通过核基因表达量推断），得到“单细胞水平的表达量”，再进行配体-受体对分析。例如，在分析肿瘤微环境的免疫-肿瘤细胞互作时，这种方法成功揭示了PD-L1（肿瘤细胞）与PD-1（T细胞）的空间共表达模式，而未校正细胞密度的数据则因肿瘤区域高表达量导致假阳性信号。3数据特征对策略的影响-样本类型：新鲜组织样本（如手术切除）的技术噪声较小，可采用“轻量级标准化”（如滑动窗口中位数法+Harmony）；而冷冻样本或FFPE样本可能存在RNA降解，需增加“背景扣除”和“低质量spot过滤”步骤。-组织复杂度：结构简单（如肝脏、肾脏）的样本可采用“大窗口空间平滑”；结构复杂（如脑、肿瘤）的样本需“小窗口自适应平滑”，避免破坏精细结构。-测序深度：高深度数据（如>50,000reads/spot）可优先考虑“SCTransform”，其对低表达基因的校正效果更好；低深度数据（如<10,000reads/spot）则需避免过度标准化，可使用“DESeq2中位数法”结合空间位置加权。06-陷阱1：过度标准化导致空间信号丢失-陷阱1：过度标准化导致空间信号丢失表现：标准化后空间PCA显示主成分与空间位置无关，SVGs数量显著减少。解决：回退到“更保守的标准化方法”（如减少滑动窗口大小、去除空间坐标协变量），并通过可视化检查关键基因的空间表达模式是否保留。-陷阱2：批次效应校正破坏空间结构表现：批次校正后，不同批次样本的相同空间区域表达分布不一致，或空间连续性断裂。解决：使用“空间感知的批次校正方法”（如Harmony加入空间坐标作为协变量），或采用“批次内标准化+批次间对齐”的两步策略。-陷阱3：忽略细胞密度差异表现：高细胞密度区域的基因表达量显著高于低密度区域，但标准化后差异消失，导致细胞类型注释偏差。-陷阱1：过度标准化导致空间信号丢失解决：结合细胞密度估计（如通过核基因表达量或HE染色图像分析），进行“密度加权标准化”。07挑战与未来方向：迈向更精准的空间标准化挑战与未来方向：迈向更精准的空间标准化尽管当前空间转录组学标准化策略已取得显著进展，但随着技术分辨率提升（如亚细胞级空间转录组）与样本复杂度增加（如多组织、多时间点动态样本），标准化仍面临诸多挑战。以下是我对未来方向的思考。1现存挑战-低表达基因的标准化困境：空间转录组学中，低表达基因（如转录因子）的表达量易受技术噪声影响，现有方法（如SCTransform）虽能部分抑制噪声，但可能丢失稀疏但关键的生物学信号。例如，在分析干细胞分化早期时，关键的转录因子基因表达量低，标准化后可能被误判为“非差异表达”，从而错过关键的调控节点。-多模态数据的标准化整合：空间转录组学常与空间蛋白质组、空间代谢组等多模态数据联合分析，但不同模态的数据特性（如表达量范围、噪声类型）差异巨大，如何实现“跨模态标准化”是一个开放问题。例如，RNA表达量与蛋白质丰度并非线性相关，直接归一化可能导致两者共表达关系的失真。1现存挑战-动态过程的标准化：发育或疾病动态样本的时间-空间变化对标准化提出了更高要求——不仅要校正同一时间点的技术偏差，还需确保不同时间点的数据可比性。例如，在分析小鼠胚胎发育时，E10.5与E12.5的细胞密度差异巨大，如何标准化才能保留发育过程中的基因表达动态，仍缺乏成熟方法。-计算效率与可重复性：复杂标准化方法（如深度学习模型）虽效果好，但计算成本高，且参数选择依赖主观经验，导致不同研究者对同一数据的标准化结果差异较大。例如，SAE模型的隐藏层大小、学习率等参数的选择，可能显著影响标准化效果，缺乏统一的“最佳实践”指南。2未来方向-基于深度学习的自适应标准化：开发能够“自适应”数据特征的深度学习模型，如通过注意力机制自动识别技术噪声与生物学