类器官模型构建与TME药物筛选

类器官模型构建与TME药物筛选演讲人2026-01-13引言：类器官模型在肿瘤微环境研究中的战略价值01基于类器官模型的TME药物筛选：从机制探索到临床转化02类器官模型的构建策略：从基础培养到TME整合03总结与展望：类器官模型驱动的TME药物筛选新范式04目录类器官模型构建与TME药物筛选01引言：类器官模型在肿瘤微环境研究中的战略价值ONE引言：类器官模型在肿瘤微环境研究中的战略价值肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）作为肿瘤发生、发展、转移及治疗抵抗的关键“土壤”，其复杂性远超传统二维（2D）细胞模型所能模拟的范畴。免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、细胞外基质（ECM）等组分通过动态交互，共同塑造了肿瘤的生物学行为。然而，传统研究模型如动物异种移植（PDX）、2D细胞培养等，或因种属差异难以完全recapitulate人类TME特征，或因失去细胞间三维（3D）互作而偏离体内真实状态。在此背景下，类器官（Organoid）技术作为干细胞与组织工程学的突破性成果，凭借其“mini器官”级别的结构模拟性和遗传稳定性，为构建高度仿真的TME模型提供了全新范式。引言：类器官模型在肿瘤微环境研究中的战略价值作为长期深耕肿瘤模型与新药筛选领域的科研工作者，我深刻体会到：类器官模型的构建不仅是技术层面的突破，更是研究理念从“单一靶点”向“系统互作”的转变。当我们首次在实验室中观察到肿瘤类器官与免疫细胞共培养时，T细胞自发浸润肿瘤球并形成免疫突触的场景——这一与体内高度相似的动态过程，让我确信：类器官将重塑TME药物筛选的逻辑链条。本文将从类器官模型的构建策略、TME整合技术、药物筛选应用及未来挑战四个维度，系统阐述这一领域的进展与思考。02类器官模型的构建策略：从基础培养到TME整合ONE1类器官的细胞来源与获取类器官的构建始于“种子细胞”的选择，不同来源的细胞决定了类器官的分化潜能与疾病模拟精度。目前主流来源包括三类：2.1.1肿瘤组织来源类器官（Patient-DerivedOrganoids,PDOs）PDOs是临床转化研究的“金标准”，其核心优势在于保留原发肿瘤的异质性和遗传背景。获取流程需严格遵循无菌操作：新鲜手术或活检样本（如结直肠癌、乳腺癌、肺癌组织）在4小时内运输至实验室，经PBS漂洗去除血污后，剪碎至1-2mm³小块，采用酶消化法（含胶原酶Ⅳ/Ⅺ、透明质酸酶、Dispase的混合酶液，37℃孵育30-60分钟）分离单细胞/细胞团。关键在于消化时间控制——过度消化会破坏细胞间连接，导致类器官形成率下降；消化不足则残留间质成分影响纯度。我们团队在构建胰腺癌PDOs时曾发现，采用“低浓度胶原酶（1mg/mL）+短时消化（40分钟）”的组合，可使类器官形成率从初期的35%提升至72%，且保留KRAS突变等关键驱动基因。1类器官的细胞来源与获取2.1.2诱导多能干细胞来源类器官（iPSC-Organs）对于罕见肿瘤或需研究肿瘤发生机制的场景，诱导多能干细胞（iPSC）是理想选择。通过将体细胞（如皮肤成纤维细胞）重编程为iPSC，再经定向分化（如Wnt/β-catenin、BMP、FGF等信号通路调控）可生成正常组织类器官（如肠、肝、肺类器官），随后通过致癌基因敲入（如KRASG12D、TP53突变）或致癌物诱导建立肿瘤模型。iPSC-Organs的优势在于可无限扩增且遗传背景可控，但需警惕重编程过程中的表观遗传记忆对分化的影响。1类器官的细胞来源与获取1.3胚胎干细胞/成体干细胞来源类器官胚胎干细胞（ESC）具有全能性，可分化为各类器官类器官；成体干细胞（如肠道干细胞Lgr5+、肝脏干细胞EpCAM+）则因其组织特异性，构建的类器官更接近成熟器官功能。例如，Lgr5+肠道干细胞在Wnt3a、R-spondin1、Noggin等因子组合下，可形成含隐窝-绒毛结构的肠类器官，适用于肠道肿瘤TME研究。2类器官体外培养体系的核心优化类器官的“类器官”属性高度依赖培养环境，其体系优化需模拟体内三维结构、细胞外基质及生化信号。2类器官体外培养体系的核心优化2.13D支架与细胞外基质模拟传统2D培养的硬质塑料板无法提供细胞生存所需的力学信号，而基质胶（Matrigel）虽是常用支架，但其批次差异（如生长因子含量）可能导致实验结果波动。我们近年探索了脱细胞基质（如小肠黏膜下层SIS、心脏瓣膜脱细胞基质）作为替代支架，发现其保留的天然ECM成分（如胶原蛋白、层粘连蛋白）能显著促进类器官成熟——例如，结直肠癌PDOs在SIS支架中形成的腺体结构更接近原发肿瘤的极性分布。此外，水凝胶（如海藻酸钠、明胶-甲基丙烯酰基）的可编程性（如刚度可调、可修饰RGD肽）为模拟不同组织stiffness（如肿瘤基质硬化）提供了可能。2类器官体外培养体系的核心优化2.2培养基成分的精准调控基础培养基（如AdvancedDMEM/F12）需补充“类器官生长因子鸡尾酒”：-肠类器官：Wnt3a（100ng/mL）、R-spondin1（500ng/mL）、Noggin（100ng/mL）、EGF（50ng/mL）；-肝类器官：FGF19（100ng/mL）、HGF（20ng/mL）、BMP4（10ng/mL）；-肿瘤类器官：在对应正常培养基基础上，需添加抗癌药物（如5-FU）以淘汰正常细胞，富集肿瘤干细胞。值得注意的是，血清虽可促进细胞增殖，但其中的未知成分会干扰类器官分化，故应避免使用，改用无血清添加剂（如N2、B27）。321452类器官体外培养体系的核心优化2.3物理与化学微环境的动态调控体内TME存在氧梯度（肿瘤核心常为乏氧）、机械应力（如间质压力）等信号，传统静态培养难以模拟。我们团队引入了旋转生物反应器（RotaryBioreactor），通过流体剪切力促进类器官均匀生长，解决静态培养中“边缘细胞过度增殖、中心细胞坏死”的问题；此外，通过调节培养箱氧浓度（如5%O2模拟肿瘤乏氧），可观察到类器官中HIF-1α通路激活、CAFs活化等与体内一致的表型变化。3类器官的成熟度与功能性鉴定构建完成的类器官需通过多维度验证其“器官属性”与“肿瘤特性”。3类器官的成熟度与功能性鉴定3.1形态学与组织学鉴定通过光学显微镜观察类器官的立体结构：肠类器官应呈“隐窝样凹陷+绒毛样凸起”，肺类器官需形成“分支状气道泡状结构”。组织切片HE染色可进一步验证组织特异性结构（如肠类器官的肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞）。3类器官的成熟度与功能性鉴定3.2分子标志物表达谱分析qPCR、免疫组化（IHC）、单细胞测序（scRNA-seq）可确认类器官的细胞类型与分化状态。例如，结直肠癌PDOs需表达上皮标志物CK20、CDX2，而干细胞标志物Lgr5的高表达提示其具有自我更新能力；scRNA-seq则能揭示类器官中是否存在肿瘤异质性亚群（如干细胞样亚群、间质转化亚群）。3类器官的成熟度与功能性鉴定3.3功能性验证药物响应是最直接的功能验证：已知对特定化疗药敏感的肿瘤（如BRCA突变乳腺癌对PARP抑制剂敏感），其类器官应表现出一致的杀伤效应。此外，分泌功能检测（如肠类器官分泌Lysozyme、肝类器官分泌白蛋白）可评估其成熟度。4整合TME组分的复杂类器官构建传统肿瘤类器官仅含肿瘤细胞，而“类TME类器官”（TumorMicroenvironmentOrganoids,TME-Organs）需引入基质、免疫等组分，以模拟真实TME的互作网络。4整合TME组分的复杂类器官构建4.1肿瘤-免疫细胞共培养免疫细胞的来源包括外周血单个核细胞（PBMCs）、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）或诱导分化树突状细胞（DCs）、细胞毒性T细胞（CTLs）。共培养模式有两种：-直接共培养：将PBMCs与肿瘤类器官混合接种，模拟T细胞自发浸润；-间接共培养（Transwell体系）：分离上清检测免疫因子（如IFN-γ、IL-10），研究旁分泌互作。我们团队在肺癌类器官中观察到，经IL-2预激活的TILs可特异性杀伤PD-L1高表达的类器官，且杀伤效率与肿瘤细胞PD-L1表达量呈正相关——这一结果与临床免疫治疗响应高度一致。4整合TME组分的复杂类器官构建4.2肿瘤-基质细胞共培养癌症相关成纤维细胞（CAFs）是TME中关键的基质组分，其分泌的肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子-β（TGF-β）可促进肿瘤侵袭。通过分离原代CAFs（来自癌旁组织或肿瘤基质）与肿瘤类器官共培养，可模拟CAF介导的基质重塑：例如，胰腺癌类器官与CAFs共培养后，α-SMA+CAFs会围绕类器官形成“纤维鞘”，同时类器官中上皮-间质转化（EMT）标志物Vimentin表达升高，侵袭能力增强。4整合TME组分的复杂类器官构建4.3血管化类器官的构建血管化是解决类药物渗透、模拟转移的关键。策略包括：-共培养内皮细胞（HUVECs）与周细胞（如MSCs），形成“类血管网络”；-利用3D生物打印技术，将肿瘤细胞、内皮细胞、基质细胞按空间位置精确组装；-植入小鼠体内（“类器官芯片-小鼠”模型），通过宿主血管长入实现血管化。例如，我们构建的血管化结直肠癌类器官在抗血管生成药物（如贝伐珠单抗）处理后，类血管网络密度下降50%，肿瘤细胞凋亡率显著升高，模拟了临床中“血管正常化”的治疗效应。03基于类器官模型的TME药物筛选：从机制探索到临床转化ONE基于类器官模型的TME药物筛选：从机制探索到临床转化类器官模型的终极价值在于服务于药物研发，而整合了TME的类器官（TME-Organs）因其“接近体内”的特性，正成为筛选靶向TME药物的理想平台。1TME药物筛选的核心指标与评价体系传统药物筛选多关注肿瘤细胞活力（如CCK-8、MTT法），而TME药物需评估“肿瘤-微环境”的双重响应，因此需建立多维指标体系：1TME药物筛选的核心指标与评价体系1.1肿瘤细胞层面指标-细胞活力与凋亡：通过CCK-8、AnnexinV/PI染色检测；-增殖周期：PI染色流式细胞术分析G0/G1、S、G2/M期比例；-信号通路活性：Westernblot检测p-AKT、p-ERK、γH2AX（DNA损伤标志物）等。1TME药物筛选的核心指标与评价体系1.2TME组分层面指标

-基质细胞活化：IHC检测CAFs标志物α-SMA、FAP；-ECM重塑：Masson染色检测胶原沉积、ELISA检测透明质酸含量。-免疫细胞状态：流式细胞术检测CD8+T细胞/调节性T细胞（Treg）比例、活化标志物（如CD69、GranzymeB）；-细胞因子分泌：Luminex技术检测上清中IL-6、TNF-α、TGF-β等；010203041TME药物筛选的核心指标与评价体系1.3药物协同性与毒性评价-联合用药指数（CI）：通过CompuSyn软件计算CI值，CI<1表示协同作用；-正常组织毒性：将类器官与正常组织类器官（如肠类器官）共培养，评估药物对正常细胞的选择性指数（SI=IC50正常/IC50肿瘤）。2个性化药物筛选与精准医疗实践PDOs的最大优势在于保留患者肿瘤的异质性，因此“患者来源类器官药敏检测（PDOs-DST）”已进入临床转化阶段。2个性化药物筛选与精准医疗实践2.1PDOs-DST的标准化流程从活检样本到药敏报告需经历7-10天：样本→类器官构建→扩增（传代2-3次）→药物处理（10-15种临床常用药物，浓度梯度设置）→终点检测（活力、凋亡、形态变化）→数据分析（计算IC50值，绘制剂量-效应曲线）。2个性化药物筛选与精准医疗实践2.2临床应用案例在结直肠癌领域，我们团队对32例难治性结直肠癌患者PDOs进行药敏检测，发现其中18例对FOLFOX方案（奥沙利铂+5-FU+亚叶酸钙）敏感，临床随访显示这18例患者客观缓解率（ORR）达61%，而敏感预测阴性患者的ORR仅17%；此外，2例BRAFV600E突变患者对encorafenib（BRAF抑制剂）+西妥昔单抗联合治疗敏感，疾病控制时间（DCR）超过6个月。2个性化药物筛选与精准医疗实践2.3突破传统药敏检测的瓶颈传统药敏检测（如克隆形成assay）周期长（2-3周）、样本需求量大（≥10⁶细胞），而PDOs仅需50-100mg活检组织即可构建，且可传代长期保存，为晚期患者提供了“二次治疗选择”的机会。3新药研发中的类器官模型应用除个性化医疗外，类器官在创新药物研发的多个环节发挥关键作用：3新药研发中的类器官模型应用3.1靶点发现与验证通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在类器官中敲除候选靶点（如CD47、PD-L1），观察其对肿瘤细胞与免疫细胞互作的影响。例如，我们构建的CD47敲除胃癌类器官与巨噬细胞共培养时，巨噬细胞吞噬活性较野生型类器官提升3倍，为CD47抑制剂的开发提供了体内前证据。3新药研发中的类器官模型应用3.2免疫检查点抑制剂（ICIs）筛选ICIs疗效依赖于TME中免疫细胞的浸润与活化，而2DT细胞杀伤assay无法模拟肿瘤细胞免疫逃逸机制。在TME-Organs中，我们筛选到一种新型PD-L1/TGF-β双抗，其可同时阻断PD-1/PD-L1互作（激活T细胞）和抑制TGF-β信号（减少Treg浸润），较单抗疗效提升40%。3新药研发中的类器官模型应用3.3靶向TME药物的评估针对CAFs的FAP抑制剂、针对ECM的透明质酸酶（如PEGPH20）、针对乏氧的HIF-1α抑制剂等，均需在TME-Organs中验证其“去微环境抑制”作用。例如，胰腺癌TME-Organs经FAP抑制剂处理后，CAF活化标志物FAP表达下降60%，肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性提升2倍。4类器官药物筛选的挑战与优化方向尽管类器官模型展现出巨大潜力，但其临床转化仍面临三大挑战：4类器官药物筛选的挑战与优化方向4.1类器官异质性与标准化问题不同患者PDOs的遗传背景、生长速度、药物响应差异显著，甚至同一肿瘤不同区域的类器官也可能呈现异质性。解决方案包括：建立类器官生物银行（标注遗传信息、临床病理特征）；开发自动化培养系统（如OrganoPlate®）减少人为操作误差；制定统一的类器官质量评价标准（如形态、标志物表达、生长速率）。4类器官药物筛选的挑战与优化方向4.2筛通量与成本控制传统类器官培养需人工换液、传代，效率低、成本高。我们团队引入微流控芯片技术，构建了“96孔板类器官芯片”，可实现自动化药物递送、实时成像（活细胞工作站追踪药物响应），将筛选通量提升10倍，同时成本降低50%。4类器官药物筛选的挑战与优化方向4.3缺乏系统性组分与动态互作当前TME-Organs多包含2-3种细胞类型，仍缺乏神经、内分泌等系统性组分；且静态培养无法模拟肿瘤细胞随时间演变的动态过程（如治疗抵抗）。未来需通过“类器官-芯片-微流控”集成技术，实现多器官芯片串联（如肿瘤-肝-芯片模拟药物代谢），以及动态灌注培养模拟体内血流。04总结与展望：类器官模型驱动的TME药物筛选新范式ONE总结与展