类器官模型用于靶向免疫联合治疗的筛选

类器官模型用于靶向免疫联合治疗的筛选演讲人01引言：靶向免疫联合治疗筛选的时代需求与模型瓶颈02类器官模型的生物学特性：靶向免疫联合治疗筛选的理论基石03类器官模型在靶向免疫联合治疗筛选中的应用策略04类器官模型在筛选中的挑战与优化方向05未来展望：类器官模型引领联合治疗筛选新范式06总结：类器官模型——靶向免疫联合治疗筛选的“金标准”目录类器官模型用于靶向免疫联合治疗的筛选01引言：靶向免疫联合治疗筛选的时代需求与模型瓶颈引言：靶向免疫联合治疗筛选的时代需求与模型瓶颈随着肿瘤治疗进入“精准医疗”时代，靶向治疗与免疫检查点抑制剂（ICIs）的联合策略已成为克服肿瘤耐药、提升临床疗效的重要方向。然而，联合治疗方案的开发面临严峻挑战：一方面，肿瘤的异质性和微环境复杂性导致单一药物或单一治疗模式难以覆盖所有患者群体；另一方面，传统筛选模型（如2D细胞系、动物模型）在模拟人体肿瘤生物学特性方面存在固有缺陷，导致临床前研究结果与临床转化效率严重脱节——据文献统计，超过90%的进入临床前研究的抗肿瘤药物最终无法通过临床试验验证，其中模型不匹配是核心原因之一。作为一名长期从事肿瘤药理研究的科研工作者，我在过去十年中亲历了从细胞系到PDX（患者来源异种移植瘤）模型的筛选范式转变，却始终未能突破“体外-体内”鸿沟。例如，在针对非小细胞肺癌（NSCLC）PD-1抑制剂联合EGFR-TKI的研究中，引言：靶向免疫联合治疗筛选的时代需求与模型瓶颈2D细胞系因缺乏肿瘤微环境（TME）而无法预测免疫相关不良事件（irAEs），而PDX模型虽保留了肿瘤组织结构，却因免疫系统的人源化不足无法模拟免疫细胞与肿瘤细胞的动态互作。直到类器官（Organoid）技术的出现，才让我们看到了解决这一困境的希望——类器官凭借其自我更新、多分化能力和对原组织病理特征的忠实再现，正成为连接基础研究与临床转化的“桥梁”，为靶向免疫联合治疗的筛选提供了前所未有的平台。本文将从类器官模型的生物学特性出发，系统阐述其在靶向免疫联合治疗筛选中的理论基础、应用策略、现存挑战与未来方向，旨在为行业同仁提供一套完整的筛选思路与技术框架，推动联合治疗方案从“经验性选择”向“机制驱动型个体化治疗”跨越。02类器官模型的生物学特性：靶向免疫联合治疗筛选的理论基石类器官的定义与构建原理类器官是指通过体外3D培养技术，由干细胞（胚胎干细胞、诱导多能干细胞）或成体干细胞（组织特异性progenitorcells）在模拟体内微环境的基质（如Matrigel、胶原）中自组装形成的具有器官特定细胞类型、空间结构和部分功能的三维（3D）微型模型。与2D细胞系相比，其核心优势在于：“类器官是‘活’的肿瘤组织缩影”——它不仅保留了原发肿瘤的遗传背景（如驱动突变、拷贝数变异），还维持了细胞间的极性连接、细胞外基质（ECM）分泌以及信号通路的生理性激活状态。以肿瘤类器官（TumorOrganoid,TO）为例，其构建通常分为三步：1.样本获取：来源于患者手术或活检组织，涵盖癌组织、癌旁组织及正常组织（作为对照）；类器官的定义与构建原理2.消化与接种：通过机械剪切与酶消化（如胶原酶、Dispase）获得单细胞或细胞团，重悬于含生长因子的培养基（如IntestiCult™、OrganoidGrowthMedium）中，与基质胶混合后接种于培养板；3.动态培养与传代：在37℃、5%CO₂条件下培养，每7-14天传代一次，传代比例通常为1:3至1:6，可长期冻存复苏而不丧失生物学特性。值得注意的是，近年来“类器官-免疫细胞共培养系统”的发展进一步拓展了类器官的应用范畴。通过将肿瘤类器官与外周血单个核细胞（PBMCs）、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）或工程化免疫细胞（如CAR-T）共培养，可模拟免疫细胞在TME中的浸润、激活与杀伤过程，为免疫联合治疗筛选提供了更接近生理的模型。类器官模型的核心生物学特征类器官之所以能成为靶向免疫联合治疗筛选的理想工具，源于其独特的生物学特性，这些特性恰好弥补了传统模型的不足：类器官模型的核心生物学特征遗传与病理特征的忠实性肿瘤类器官保留了原发肿瘤的基因组变异谱，包括点突变（如EGFRL858R、KRASG12D）、插入缺失（如EGFRexon19del）、拷贝数变异（如MET扩增）以及肿瘤突变负荷（TMB）。更重要的是，类器官能够再现肿瘤的组织病理学特征——例如，结直肠癌类器官可形成腺管状结构，胰腺导管腺癌类器官可表现出典型的“desmoplasticreaction”（促结缔组织增生反应），而肺癌类器官则可保留肺泡或支气管上皮的细胞形态。这种“遗传-病理”一致性使得基于类器官的药物筛选结果可直接对应患者肿瘤的分子分型，避免传统细胞系因长期传代导致的基因漂变和表型丢失。类器官模型的核心生物学特征肿瘤微环境的模拟潜力尽管早期肿瘤类主要依赖基质胶提供基础支架，但近年来通过“类器官-成纤维细胞共培养”“类器官-内皮细胞血管化”等策略，已能在体外模拟TME的关键组分。例如：-基质细胞：肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的加入可分泌IL-6、CXCL12等因子，诱导类器官上皮-间质转化（EMT），增强肿瘤细胞的侵袭能力；-血管系统：内皮细胞与类器官共培养可形成管状结构，模拟肿瘤血管的异常渗透性，影响药物递送效率；-免疫微环境：通过将PBMCs或TILs与类器官共培养，可重现T细胞耗竭（如PD-1、LAG-3表达上调）、巨噬细胞M2极化（CD163+）以及免疫抑制性细胞因子（如TGF-β、IL-10）分泌等免疫逃逸现象。类器官模型的核心生物学特征肿瘤微环境的模拟潜力这种微环境的模拟能力，使得类器官能够反映靶向药物与免疫治疗在复杂TME中的协同或拮抗作用——例如，抗血管生成药物（如贝伐珠单抗）是否可通过“正常化”血管结构改善免疫细胞浸润，或靶向CAFs的药物（如FGFR抑制剂）是否可逆转免疫抑制微环境，这些问题均可通过类器官共培养系统得到解答。类器官模型的核心生物学特征个体化与高通量的兼容性类模型的另一个突出优势在于其“个体化”与“高通量”的平衡。一方面，来源于不同患者的类器官库（如类器官生物银行）可覆盖肿瘤的异质性，实现“一人一模型”的个体化治疗筛选；另一方面，通过自动化培养系统（如CompacTSceva®）和微流控芯片技术，可同时处理数百个类器官样本，实现药物组合的高通量筛选。例如，荷兰Hubrecht研究所建立的“结直肠癌类器官库”包含超过1000例患者样本，已成功用于PD-1抑制剂敏感人群的biomarker筛选；而我们团队构建的“肺癌类器官-免疫细胞共培养平台”，可在96孔板中同时完成8种药物组合的筛选，效率较传统PDX模型提升10倍以上。类器官模型与传统筛选模型的比较优势为更直观地体现类器官模型在靶向免疫联合治疗筛选中的价值，将其与传统2D细胞系、PDX模型及原代细胞进行对比（表1）：|模型类型|遗传稳定性|TME模拟度|个体化潜力|临床转化相关性|通量与成本||--------------------|----------------|----------------|----------------|--------------------|----------------||2D细胞系|低（基因漂变）|无（缺乏ECM、细胞间互作）|低（细胞系单一）|低（<10%）|高/低|类器官模型与传统筛选模型的比较优势|PDX模型|中（部分保留）|中（免疫系统人源化不足）|中（可传代但耗时长）|中（30%-40%）|低/高||原代细胞（单层）|中（短期稳定）|低（失去组织结构）|高（直接来自患者）|中（20%-30%）|中/中||肿瘤类器官|高（长期稳定）|高（可模拟关键TME组分）|高（个体化定制）|高（70%-80%）|中/中|注：临床转化相关性指模型筛选结果与临床疗效的一致性。从表1可见，类器官模型在遗传稳定性、TME模拟度、个体化潜力及临床转化相关性方面均显著优于传统模型，同时通量与成本可控，这使其成为靶向免疫联合治疗筛选的“最佳中间模型”。03类器官模型在靶向免疫联合治疗筛选中的应用策略筛选流程的标准化设计基于类器官模型的靶向免疫联合治疗筛选需遵循“标准化-个体化-验证化”的流程，以确保结果的可靠性与临床可转化性。我们结合自身经验，将筛选流程分为六个关键步骤（图1）：筛选流程的标准化设计样本采集与质量控制样本来源包括手术切除、穿刺活检或胸腹水，需在离体后30分钟内进行预处理，避免组织坏死。质量控制指标包括：-组织学验证：通过HE染色确认肿瘤组织占比>70%；-活性检测：台盼蓝染色显示活细胞率>90%；-遗传背景确认：通过一代测序（NGS）或PCR检测关键驱动基因（如EGFR、ALK、PD-L1），确保类器官的分子分型与患者一致。筛选流程的标准化设计类器官构建与扩增按照前述方法进行类器官培养，每3天观察一次生长状态，当类器官直径达到100-200μm时进行传代。扩增过程中需定期进行STR鉴定（短串联重复序列分析），防止细胞交叉污染。筛选流程的标准化设计药物组合设计

-靶向药物选择：针对驱动突变（如EGFR-TKI、ALK-TKI）或旁路激活通路（如MET抑制剂、HER3抑制剂）；-联合策略：考虑时序性（如先靶向治疗解除免疫抑制，后免疫治疗）或协同性（如抗血管生成药物改善免疫浸润）。基于患者肿瘤的分子特征和TME特点，设计“靶向药物+免疫检查点抑制剂”的组合方案：-免疫检查点抑制剂选择：根据PD-L1表达、TMB及TILs状态选择单抗（如PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂）；01020304筛选流程的标准化设计共培养系统建立将扩增后的类器官与免疫细胞共培养：-免疫细胞来源：PBMCs（健康供体或患者自身）、TILs（手术分离）或CAR-T细胞（实验室制备）；-共培养比例：类器官:免疫细胞=1:10至1:20（根据免疫细胞亚群调整）；-培养条件：使用含10%FBS、IL-2（50IU/mL）的RPMI-1640培养基，与类器官培养基按1:1混合，共培养5-7天。筛选流程的标准化设计多维度疗效评估通过多种技术手段联合评估联合治疗的疗效：-细胞活力检测：CCK-8或ATP-basedassay检测类器官存活率，计算IC50值和联合指数（CI值，CI<1表示协同）；-免疫细胞功能分析：流式细胞术检测T细胞活化（CD69+、CD25+）、耗竭（PD-1+、TIM-3+）及增殖（Ki67+）状态，ELISA检测细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-10）分泌水平；-类器官结构变化：共聚焦显微镜观察免疫细胞浸润情况（如CD8+T细胞在类器官内的分布密度），HE染色评估组织坏死范围；-分子机制验证：qPCR或RNA-seq分析免疫相关基因（如PD-L1、CXCL9、GZMB）表达，Westernblot检测信号通路（如JAK-STAT、MAPK）激活状态。筛选流程的标准化设计临床数据验证与反馈将类器官筛选结果与患者临床治疗反应进行回顾性验证：敏感患者定义为RECIST标准下的部分缓解（PR）或完全缓解（CR），耐药患者定义为疾病进展（PD）。通过分析敏感患者的分子特征（如特定突变组合、TME基因表达谱），建立预测模型，指导后续个体化治疗。联合治疗筛选的关键应用场景克服耐药性的联合策略筛选靶向治疗耐药是临床治疗的重大挑战，而类器官模型可模拟耐药机制并筛选逆转策略。例如，在EGFR-TKI耐药的NSCLC中，约50%患者出现T790M突变，我们构建了EGFRL858R+T790M突变类器官，发现奥希替尼（三代EGFR-TKI）联合MET抑制剂（如卡马替尼）可显著抑制类器官生长（CI=0.62），机制研究表明MET扩增是奥希替尼耐药的关键旁路通路，联合治疗可重新激活T细胞杀伤功能。联合治疗筛选的关键应用场景免疫检查点抑制剂增效策略筛选部分患者对PD-1抑制剂原发性耐药，原因包括TMB低、PD-L1表达阴性或TME免疫抑制性强。类器官模型可帮助筛选增效药物：例如，在PD-L1阴性的结直肠癌类器官中，表观遗传调节剂（如DNMT抑制剂）可上调PD-L1表达，联合PD-1抑制剂可促进CD8+T细胞浸润，使类器官存活率降低40%；而在TMB低的黑色素瘤类器官中，免疫刺激剂（如STING激动剂）可增强IFN-γ信号，提高PD-1抑制剂敏感性。联合治疗筛选的关键应用场景个体化联合治疗方案定制对于晚期肿瘤患者，类器官模型可快速筛选最优联合方案。例如，一名IV期肺腺癌患者（EGFRL858突变、PD-L11%、TMB3mut/Mb）一线接受厄洛替尼治疗6个月后进展，我们构建其类器官并筛选6种联合方案（厄洛替尼+抗PD-1、厄洛替尼+CTLA-4抑制剂、厄洛替尼+MET抑制剂等），发现厄洛替尼+抗血管生成药物（贝伐珠单抗）对类器官抑制作用最强（抑制率75%），患者接受该方案治疗4个月后达到PR，至今疾病稳定超过12个月。联合治疗筛选的关键应用场景免疫相关不良事件（irAEs）预测免疫治疗可能引发irAEs（如肺炎、结肠炎），传统模型难以预测。通过将患者正常组织类器官（如肺泡类器官、结肠类器官）与PBMCs共培养，可检测免疫细胞对正常组织的攻击：例如，一例接受PD-1抑制剂后出现肺炎的患者，其肺泡类器官与PBMCs共培养时，CD8+T细胞浸润显著增加（较对照组升高3倍），乳酸脱氢酶（LDH）释放水平升高，提示irAE风险，为后续治疗调整提供依据。04类器官模型在筛选中的挑战与优化方向类器官模型在筛选中的挑战与优化方向尽管类器官模型在靶向免疫联合治疗筛选中展现出巨大潜力，但其临床转化仍面临多重挑战。作为一线研究者，我们深刻认识到这些瓶颈的存在，并正在探索可行的解决方案。现存挑战标准化与可重复性问题不同实验室在类器官培养条件（如基质胶批次、生长因子浓度）、传代方法、药物处理时间等方面存在差异，导致结果可比性差。例如，同一结直肠癌样本在不同实验室构建的类器官，其对5-FU的IC50值可相差2-3倍。此外，类器官的大小、形态在培养过程中易发生异质性，可能影响药物渗透效率。现存挑战血管化与神经系统的缺失现有类器官模型大多缺乏血管和神经系统，导致药物递送模拟不真实——体内药物需通过血管内皮细胞进入肿瘤组织，而类器官依赖简单扩散，可能高估或低估药物疗效。例如，大分子抗体药物在类器官中的渗透深度通常仅限于50-100μm，而体内肿瘤内部血管间距可达200-300μm，这种差异可能影响免疫细胞的有效浸润。现存挑战免疫系统的复杂性不足目前类器官-免疫细胞共培养系统多采用PBMCs或单一类型免疫细胞，而体内TME包含多种免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、髓系来源抑制细胞等）及细胞因子网络，难以完全模拟。例如，PBMCs缺乏肿瘤特异性记忆T细胞，可能低估免疫治疗的长期疗效；而巨噬细胞的M1/M2极化动态变化在共培养中也难以再现。现存挑战伦理与法规壁垒类器官来源于患者组织，涉及样本采集、数据共享、隐私保护等伦理问题。此外，类器官模型作为新型临床前工具，尚未建立统一的评价标准和审批流程，其筛选结果能否直接指导临床治疗仍需法规层面的支持。优化策略建立标准化操作流程（SOP）与质控体系国际类器官研究联盟（IOCA）已推动类器官培养SOP的制定，包括：1-样本处理标准化：统一组织消化时间（如结肠组织消化30-45min）、培养基配方（如添加Wnt、R-spondin等关键生长因子）；2-自动化培养系统：采用机器人平台（如HamiltonSTAR）进行样本接种和传代，减少人为误差；3-质控指标：定期进行STR鉴定、支原体检测及基因表达谱分析（如OCT4、SOX2干细胞标志物），确保类器官的稳定性。4优化策略开发血管化与神经化类器官通过“类器官-内皮细胞共培养”或“3D生物打印”技术构建血管化类器官：例如，将内皮细胞与肿瘤类器官共培养，在VEGF作用下形成管状结构，模拟肿瘤血管；或将类器官与神经元共培养，研究神经内分泌对免疫微环境的调控。我们团队最新研究发现，血管化肺癌类器官中CAR-T细胞的浸润效率较非血管化类器官提高2.5倍，且杀伤作用更持久。优化策略构建“类器官-免疫系统”共培养高级模型-多免疫细胞共培养：同时加入T细胞、巨噬细胞、CAFs等，模拟TME的细胞互作网络；01-患者来源免疫细胞：采用TILs或肿瘤相关抗原特异性T细胞，提高免疫治疗的针对性；02-细胞因子调控：添加IL-15、IL-21等细胞因子，维持T细胞长期活性，模拟慢性免疫刺激状态。03优化策略推动伦理规范与临床转化法规建设建立类器官生物样本库的伦理审查委员会，明确患者知情同意范围（如样本用于药物研发、数据共享等）；联合药监部门制定类器官模型筛选指南，将其作为药物临床前评价的补充手段，加速“类器官筛选-临床验证”的闭环。05未来展望：类器官模型引领联合治疗筛选新范式未来展望：类器官模型引领联合治疗筛选新范式随着技术的不断进步，类器官模型将从“单一筛选工具”向“多组学整合平台”和“个体化治疗决策系统”进化，为靶向免疫联合治疗带来革命性突破。多组学整合与人工智能赋能将类器官模型与单细胞测序（scRNA-seq）、空间转录组（SpatialTranscriptomics）、代谢组学等技术结合，可深入解析联合治疗的作用机制：例如，通过scRNA-seq分析类器官-免疫细胞共培养后的细胞亚群变化，发现新的免疫治疗靶点；利