2026届高三生物二轮复习课件：专题八　热点聚焦　PCR技术及应用

大二轮专题复习第一部分专题八生物技术与工程热点2常用PCR技术及原理热点1

PCR引物归类分析内容索引热点1

PCR引物归类分析

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PCR技术及应用真题引领1.引物的设计(1)(2020·山东，25节选)通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是_____________________________________________________________________________。(2)(经典高考题)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。

引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)碱基互补配对G、C含量高(1)PCR技术中，提高复性的温度能有效减少反应非特异条带的产生(2021·湖北，16)(

)(2)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是______________________________________________________________。若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是______________________________。命题延伸——判断与填充√

引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)引物过短导致引物的特异性下降提醒(1)PCR引物的设计原则①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23bp。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构(如图)，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3′端的互补重叠以防形成引物二聚体(如图所示)。提醒(2)引物与复性温度①复性温度：复性温度高，扩增特异性强；复性温度低，扩增效率高。②引物：a.引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度。b.引物GC含量越高，越容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。2.引物的修饰(1)(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_______(填“3′端”或“5′端”)。能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸5′端引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。解析②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是____________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_____________________________________________。P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取

在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。解析确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑______________________和________________。(2)(2021·天津，16节选)研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。如图为构建表达载体时所需的关键条件。在设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列时，为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正包含BamHⅠ的识别序列将GTG改为ATG思维延伸引物的结合方向和引物的数量计算1.引物的结合方向如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：扩增X蛋白基因所需的引物序列是____________________________；_____________________________。5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′5′-TGATCTACGGCTTACA-3′书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推测另外一条引物的序列。解析思维延伸2.引物的数量计算(1)如图：一个DNA分子进行了n次扩增，则：①子代DNA分子中等长链的DNA分子数为________个；②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为____个；③子代DNA分子中含模板链的DNA分子数为__个；2n－2n2n2思维延伸④子代DNA分子中含引物1(或2)的DNA分子数为_______个；⑤复制过程中共需引物________个；⑥第n次复制需要引物___个。2n－12n＋1－22n(2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第___轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。21.通过对多种植物研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成可以更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1基因，通过基因工程将Ers1基因反预测演练向连接在启动子后，筛选转入反义Ers1基因的草莓，达到延长储藏期的效果。在使用相关技术获得DNA后，需要通过PCR技术进行扩增Ers1基因(如图)。为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加限制酶XhoⅠ(识别序列为5′—CTCGAG—3′)的识别序列。已知Ers1基因左端①处的碱基序列为—TTCCAATTTTAA—，则其中一种引物设计的序列是5′_____________________________3′。在PCR体系中，加入的dNTP可提供____________。原料和能量—CTCGAGTTCCAATTTTAA—图中有磷酸基团连接处为5′端，－OH连接处为3′端，由题意得，Ers1基因左端①处的碱基序列为5′－TTCCAATTTTAA－3′，故可设计引物5′－TTCCAATTTTAA－3′，解析在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加识别序列为5′－CTCGAG－3′的限制酶XhoⅠ识别序列，故其中一种引物设计的序列是5′－CTCGAGTTCCAATTTTAA－3′。在

PCR体系中，dNTP(脱氧核苷三磷酸)在反应过程中可以提供原料(合成

DNA的脱氧核苷酸)和能量(dNTP水解会释放能量)。pMag是在蓝光环境下能够相互结合的两种光敏蛋白。研究人员通过PCR技术获得融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因连接，构建成基因表达载体，然后将其导入受体菌，获得了所需的工程菌。研究人员利用PCR技术实现编码T7RNAPN端的基因下游序列与编码nMag的基因上游序列的无缝连接，获得编码T7RNAPN端－nMag的融合基因，2.研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维素薄膜。蛋白T7RNAP是一种噬菌体RNA聚合酶(T7RNAP的N端或C端单独存在时不能发挥作用，二者结合可形成完整的T7RNAP)，nMag和由图可知，引物2的5′端9个碱基序列为5′__________________3′，如此设计引物2的目的是__________________________________________________________。用同样的方法获得编码pMag－T7RNAPC端的融合基因。—CCTGCACCT—

使T7RNAPN端基因的下游添加与nMag基因的上游相同的序列解析观察题图，要实现编码T7RNAPN端的基因下游序列与编码nMag的基因上游序列的无缝连接，引物2的5′端9个碱基序列应包含nMag基因的上游序列(从图中可知)，所以为5′－CCTGCACCT－3′。如此设计引物2的目的是使T7RNAPN端基因的下游添加与nMag基因的上游相同的序列，从而获得融合基因。3.(2025·聊城二模)大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因(GFP)进行拼接获得融合基因。成功表达的Y－GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究。研究中首先要对Y基因进行PCR扩增。PCR反应要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中一般需要加入Mg2＋，其原因是______________________________。如图所示Y基因序列为转录的_____________(填DNA聚合酶需要Mg2＋激活“模板链”或“非模板链”)。已知EcoRⅠ识别序列为5′－GAATTC－3′，BamHⅠ识别序列为5′－GGATCC－3′，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y－GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应为5′－____________________－3′(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。GGATCCATGTTC非模板链由于DNA聚合酶需要Mg2＋激活，因此缓冲液中一般需要加入Mg2＋。转录出来的信使RNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG应该跟模板链TAC是互补配对的，跟非模板链ATG是相同的，题图中Y基因单链部分的左端起始位置是ATG，刚好跟信使RNA解析的起始位置是相同的，故图中所示Y基因序列为转录的非模板链。据题图分析可知，Y基因上面没有EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，所以要扩增Y基因时，引物的5′端要加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y基因单链部分是非模板链，所以Y基因是从左到右与载体部分连接。故在Y基因的左端连接EcoRⅠ的识别序列，Y基因的右端连接BamHⅠ的识别序列。即Y基因的下游扩增引物上面应该添加BamHⅠ的识别序列，再根据“在获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除”可知，Y基因下游最右端的三个碱基转录为终止密码子，故这三个碱基要剔除，所以为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y－GFP融合蛋白，Y基因的下游扩增引物应为5′－GGATCCATGTTC－3′。返回热点2常用PCR技术及原理

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PCR技术及应用1.实时荧光定量RT－PCR技术检测病毒核酸病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。主干整合段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：2.PCR定点突变——重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片3.PCR定点突变——大引物PCR技术大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图：4.反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图：进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图：5.巢式PCR首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物1.(2023·山东，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图所示：真题引领构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图中的引物__________________。F1和R2(或F2和R1)据图可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图中的引物F1和R2或F2和R1。解析另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是___________________。2.(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中乙和丙目的基因反向连接如图所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450bp片段。若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400bp片段。解析3.(不定项)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是A.上述PCR反应体系中只加入一种引物B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G√√利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；电泳时，产物的DNA片段越大，迁移速率越慢，B错误；根据题图可知，对照个体PCR子链的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，而患者该段序列为5′-CTACCTGTGAT-3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，C正确，D错误。解析模型构建“双脱氧法”基因测序原理解读(1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。模型构建(4)双脱氧法原理示意图：1.如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。下列叙述错误的是A.PCR1所用引物应为引物A和BB.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板C.PCR3无需额外加入引物D.PCR4的作用是大量扩增突变基因预测演练√引物与模板的3′端结合，由图PCR1的产物可知，PCR1所用引物应为引物A和B，A正确；由图可知，PCR1和PCR2均以原始DNA为模板，PCR3以PCR1和PCR2的产物为模板，PCR4以PCR3的产物为模板，B错误；由图可知，两条链互为模板和引物，故PCR3无需额外加入引物，C正确；PCR4的作用是大量扩增突变基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正确。解析2.荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算初始模板量。如图为某荧光定量PCR的标准曲线。下列叙述错误的是A.一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关B.每个反应管内荧光探针的量相同C.样品甲的初始模板量大于样品乙D.荧光强度不再变化时PCR反应停止√在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关，A正确；最终各反应管的荧光强度一样，说明每个反应管内添加的荧光探针的量相同，B正确；解析PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此DNA数量越多，荧光强度越大，样品甲达到最大荧光强度所用的循环数小于乙，因此样品甲的初始模板量大于样品乙，C正确；荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等消耗尽，若为前者，则PCR反应仍在进行，D错误。3.融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题：(1)图1第一阶段中PCR至少进行____次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的__________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。2互补配对分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增(循环)，得到的含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进解析行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。(2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计____种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有___种。86图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。解析(3)图2中需使用_______________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。Spe

Ⅰ、Sal

Ⅰ复制原点图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe

Ⅰ和Sal

Ⅰ的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间