恶性疟原虫ApiAP2敲除株构建及其对var基因转录调控的深度解析

恶性疟原虫ApiAP2敲除株构建及其对var基因转录调控的深度解析一、引言1.1研究背景与意义疟疾是一种古老且危害严重的全球性寄生虫病，与艾滋病、结核病并称为全球三大传染病。据世界卫生组织（WHO）统计，全球仍有近90个国家和地区存在疟疾流行，每年约有2.4亿人感染疟疾，导致近60万人死亡，严重威胁着人类的健康和生命安全。在众多疟原虫种类中，恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum）致病性最强，是导致重症疟疾和死亡的主要原因，给全球公共卫生带来了沉重负担。恶性疟原虫的生活史极为复杂，需要在人和雌性按蚊两个宿主之间交替完成。在长期的进化过程中，恶性疟原虫为了适应不同宿主环境并逃避宿主免疫系统的攻击，逐渐进化出了一套精细且复杂的基因表达调控机制，其中转录因子在这一调控网络中起着关键作用。ApiAP2（ApicomplexanAP2）蛋白家族是顶复门原虫所特有的一类转录因子，在疟原虫的整个生命周期中，ApiAP2转录因子家族成员通过特异性地结合靶基因启动子区域的顺式作用元件，精准调控基因的转录起始和转录水平，进而参与调控疟原虫的入侵、发育、繁殖以及免疫逃逸等多个关键生物学过程。对ApiAP2转录因子家族的深入研究，有助于我们从分子层面揭示疟原虫基因表达调控的奥秘，为理解疟疾的发病机制提供关键线索。var基因家族是恶性疟原虫特有的一组高度变异的多基因家族，约由60个成员组成。var基因编码的变异抗原PfEMP1（Plasmodiumfalciparumerythrocytemembraneprotein1）表达于感染红细胞表面，在介导感染红细胞与宿主血管内皮细胞的黏附以及逃避宿主免疫系统清除的过程中发挥着核心作用。单个恶性疟原虫在某一特定时间内仅能表达一个var基因，这种独特的相互排斥性表达策略使得疟原虫能够持续逃避宿主的免疫攻击，导致疟疾的慢性感染和反复发作。然而，目前对于var基因表达调控的具体分子机制，尤其是ApiAP2转录因子在其中所扮演的角色，仍存在诸多未知。本研究聚焦于恶性疟原虫ApiAP2敲除株的构建及var基因的转录分析，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。在理论层面，通过构建ApiAP2敲除株，能够深入探究ApiAP2转录因子对var基因转录调控的具体分子机制，填补我们在恶性疟原虫基因表达调控领域的知识空白，进一步丰富和完善疟原虫分子生物学理论体系。从应用角度来看，本研究的成果有望为开发新型抗疟药物和疫苗提供全新的靶点和理论依据。通过干扰ApiAP2转录因子与var基因之间的调控关系，可能阻断疟原虫的免疫逃逸途径，增强宿主免疫系统对疟原虫的清除能力，从而为疟疾的防控提供新的策略和方法，对全球疟疾防治工作具有重要的推动作用。1.2国内外研究现状1.2.1恶性疟原虫ApiAP2基因功能研究在国外，对ApiAP2基因功能的研究起步较早且成果丰硕。研究发现，ApiAP2蛋白家族成员广泛参与了恶性疟原虫各个发育阶段的基因表达调控。例如，一些ApiAP2转录因子在疟原虫入侵宿主红细胞的过程中发挥关键作用，它们能够调控编码入侵相关蛋白的基因表达，影响疟原虫与红细胞表面受体的识别和结合。在疟原虫的有性发育阶段，特定的ApiAP2蛋白参与调控配子体的形成和发育，决定了疟原虫能否在蚊媒中继续传播。美国的研究团队通过基因敲低和过表达实验，深入探究了多个ApiAP2基因在疟原虫发育周期中的功能，发现某些ApiAP2转录因子的缺失会导致疟原虫发育停滞，无法完成正常的生命周期，为理解疟原虫的发育调控机制提供了重要线索。国内科研团队也在ApiAP2基因功能研究方面取得了重要进展。中南大学医学寄生虫学系教师尚晓敏与同济大学医学院张青锋课题组合作，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对恶性疟原虫红细胞内无性繁殖期的ApiAP2转录因子进行染色质免疫共沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）筛选，首次绘制出ApiAP2转录因子家族全基因组分布图谱。研究发现，ApiAP2转录因子对异染色质基因和常染色质基因具有不同的调控机制，并且ApiAP2家族内部存在极为复杂的调控网络，包括正反馈、负反馈及自我调节等调控方式，这一研究成果为疟原虫表观遗传调控机制研究提供了重要的数据资源，也为抗疟药物的研发提供了新的靶点。1.2.2恶性疟原虫ApiAP2敲除株的构建研究国外在恶性疟原虫ApiAP2敲除株构建方面，早期主要采用传统的同源重组技术。这种方法虽然能够实现基因敲除，但效率较低，操作周期长，而且对疟原虫的遗传背景要求较高。随着基因编辑技术的发展，CRISPR/Cas9系统逐渐成为构建敲除株的主流工具。利用CRISPR/Cas9系统，研究人员能够更加高效、精准地对ApiAP2基因进行编辑。例如，通过设计特异性的sgRNA，引导Cas9核酸酶在目标ApiAP2基因位点产生双链断裂，细胞通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复，从而实现基因的敲除或修饰。一些国际知名研究机构利用这一技术成功构建了多个ApiAP2基因的敲除株，并通过对敲除株的表型分析，深入研究了ApiAP2基因的功能和作用机制。国内在恶性疟原虫ApiAP2敲除株构建方面也紧跟国际前沿。中国科学院上海巴斯德研究所的科研团队利用自主研发的基于CRISPR/dCas9系统的高效恶性疟原虫表观遗传基因编辑技术，成功构建了一系列ApiAP2基因敲除株。该技术在提高基因编辑效率的同时，降低了脱靶效应，为深入研究ApiAP2转录因子在疟原虫基因表达调控网络中的作用提供了有力工具。此外，国内多个科研团队还在不断优化基因编辑技术，探索新的策略来提高ApiAP2敲除株的构建效率和质量，为疟疾的基础研究和防治应用奠定了坚实的基础。1.2.3恶性疟原虫var基因转录分析研究国外对var基因转录分析的研究较为深入。研究发现，var基因的转录受到多种因素的调控，包括染色质修饰、转录因子以及非编码RNA等。其中，染色质的开放与关闭状态对var基因的转录起着重要的调控作用。在活跃转录的var基因位点，染色质呈现开放状态，有利于转录因子的结合和转录起始；而在沉默的var基因位点，染色质则处于紧密的凝聚状态，阻碍了转录的进行。此外，一些转录因子如AP2家族成员被发现参与了var基因的转录调控，它们通过与var基因启动子区域的特定序列结合，激活或抑制var基因的转录。美国和欧洲的一些研究团队利用高通量测序技术和单细胞转录组分析技术，对var基因在不同发育阶段和不同环境条件下的转录情况进行了全面的分析，揭示了var基因转录调控的复杂性和动态性。国内在var基因转录分析方面也取得了一定的成果。同济大学的研究团队建立了恶性疟原虫地理株连续体外培养方法，并采用荧光定量PCR技术分析培养虫株var基因转录类型，成功检测出该虫株var基因优势转录类别。此外，国内其他科研团队还通过研究var基因与宿主免疫系统的相互作用，探讨了var基因转录调控在疟原虫免疫逃逸中的作用机制，为深入理解疟疾的发病机制和开发新型抗疟策略提供了重要的理论依据。1.3研究目的与创新点本研究旨在通过构建恶性疟原虫ApiAP2敲除株，深入剖析ApiAP2转录因子对var基因转录调控的分子机制，为揭示疟疾的发病机制以及开发新型抗疟策略奠定坚实基础。具体研究目的包括：利用先进的CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功构建恶性疟原虫ApiAP2基因敲除株；运用高通量测序技术、荧光定量PCR等手段，系统分析ApiAP2敲除株中var基因的转录变化情况，明确ApiAP2转录因子与var基因转录之间的关联；通过对敲除株的表型分析，探究ApiAP2基因缺失对恶性疟原虫生长、发育以及免疫逃逸能力的影响，从整体水平揭示ApiAP2转录因子在疟原虫生物学过程中的重要作用。在研究方法上，本研究创新性地整合了CRISPR/Cas9基因编辑技术与高通量测序技术，实现了对ApiAP2基因的精准敲除以及对var基因转录组的全面分析。这种多技术联用的策略，相较于传统的单一研究方法，能够更深入、全面地解析ApiAP2转录因子对var基因转录调控的复杂机制，为疟原虫基因表达调控研究提供了新的技术思路和方法体系。从研究结论的预期来看，本研究有望首次明确ApiAP2转录因子家族中特定成员在var基因转录调控中的具体作用和分子机制，填补该领域在这一方面的研究空白。研究成果可能揭示出全新的var基因转录调控途径，为理解疟原虫免疫逃逸机制提供新的视角，进而为开发基于干扰ApiAP2-var基因调控关系的新型抗疟药物和疫苗提供独特的理论依据和潜在靶点，为全球疟疾防治工作开辟新的方向。二、恶性疟原虫ApiAP2基因及var基因概述2.1恶性疟原虫简介恶性疟原虫隶属于顶复门疟原虫属，是引发疟疾的病原体中致病性最强的一种，其生活史极为复杂，需要在人和雌性按蚊两个宿主之间交替完成，整个过程历经多个阶段，每个阶段都伴随着独特的生物学变化。当雌性按蚊叮咬人体时，疟原虫的子孢子会随蚊子的唾液一同进入人体血液循环系统。子孢子具有极强的运动能力和定向性，它们能够迅速识别并侵入肝细胞。在肝细胞内，子孢子开始进行一系列复杂的发育过程，首先发育为滋养体，滋养体通过摄取肝细胞内的营养物质不断生长和分裂，随后进入裂体增殖阶段，形成红外期裂殖体。红外期裂殖体经过多次分裂，产生大量的裂殖子。这些裂殖子从破裂的肝细胞中释放出来，一部分被人体的免疫系统吞噬清除，另一部分则侵入红细胞，开启红细胞内期的发育。进入红细胞后，裂殖子发育成环状体，环状体进一步发育为大滋养体。大滋养体在红细胞内积极摄取营养，不断生长，形态也逐渐发生变化，同时开始合成疟色素。随着大滋养体的成熟，它会发育为未成熟裂殖体，进而形成成熟裂殖体。成熟裂殖体内含有多个裂殖子，当红细胞破裂时，裂殖子被释放出来，这些裂殖子又可以继续侵入新的红细胞，重复上述红细胞内期的发育过程。经过几次这样的循环后，部分裂殖子会在红细胞内发育为雌、雄配子体，配子体是疟原虫有性生殖阶段的开始。当雌性按蚊再次叮咬感染了疟原虫的人时，配子体会随血液进入蚊子体内。在蚊胃腔内，配子体发育为雌、雄配子，雌雄配子结合形成合子。合子进一步发育为动合子，动合子能够穿过蚊胃壁，在胃弹性纤维膜下形成卵囊。卵囊内的核和胞质反复分裂进行孢子增殖，产生大量的子孢子。子孢子成熟后，会主动从卵囊壁钻出或因卵囊破裂而散出，随血淋巴钻入蚊体组织，最终到达蚊唾腺。此时，蚊子再次叮咬人体时，子孢子就会进入人体，开始新的一轮生活史循环。恶性疟原虫的致病机制主要与其在红细胞内的发育和繁殖过程密切相关。在红细胞内期，疟原虫大量繁殖，导致红细胞破裂，释放出裂殖子、疟原虫代谢产物、残余和变性的血红蛋白以及红细胞碎片等物质。这些物质进入血液后，会刺激人体的免疫系统，引发一系列免疫反应。其中，疟原虫代谢产物和红细胞碎片等作为外源性热原质，被巨噬细胞吞噬后，会促使巨噬细胞产生内源性热原质，这些热原质作用于下丘脑的体温调节中枢，导致人体出现周期性的寒战、高热和出汗等典型疟疾发作症状。发作周期与疟原虫红内期裂体增殖周期一致，一般为48小时左右。随着疟疾发作次数的增多，人体的免疫系统会受到严重损害，导致贫血、脾肿大等并发症。贫血的原因主要包括疟原虫对红细胞的直接破坏、脾巨噬细胞吞噬红细胞以及骨髓造血受抑制等。脾肿大则是由于疟原虫感染引发的免疫反应，导致脾脏内巨噬细胞增多，脾组织增生。在一些严重的情况下，恶性疟原虫还可能引发凶险型疟疾，如脑型疟、超高热型、休克型等，这些凶险型疟疾发病急，病情凶险，死亡率高。例如，脑型疟会导致患者出现剧烈头痛、谵妄、急性神经错乱、高热、昏睡或昏迷等症状，其发病机制可能与疟原虫感染导致的脑血管堵塞、炎症反应以及弥漫性血管内凝血等因素有关。在疟疾传播中，恶性疟原虫扮演着核心角色。它通过蚊子作为传播媒介，在人群中不断传播扩散。当蚊子叮咬感染了恶性疟原虫的人时，疟原虫会在蚊子体内发育繁殖，形成具有感染性的子孢子。这些子孢子存在于蚊子的唾液腺中，当蚊子再次叮咬其他人时，子孢子就会进入新的宿主，从而实现疟原虫的传播。由于恶性疟原虫具有较强的适应性和生存能力，且能够不断变异以逃避宿主的免疫系统攻击，使得疟疾的传播难以有效控制，给全球疟疾防治工作带来了巨大挑战。2.2ApiAP2基因家族ApiAP2基因家族是顶复门原虫所特有的一类转录因子基因家族，在疟原虫的基因表达调控网络中占据着核心地位。该家族成员的蛋白结构具有独特性，其核心结构域是一段约60个氨基酸组成的AP2结构域。这一结构域包含两个串联重复的、高度保守的基序，每个基序由3个反向平行的β-折叠片和1个α-螺旋构成，形成了一个类似于“螺旋-转角-螺旋”的结构，这种结构能够特异性地识别并结合DNA序列，是ApiAP2蛋白发挥转录调控功能的关键区域。在恶性疟原虫基因组中，ApiAP2基因家族包含多个成员，分布于不同的染色体上。这些成员在疟原虫的不同发育阶段呈现出特异性的表达模式。例如，在红细胞内期，部分ApiAP2基因在环状体阶段高表达，而另一些则在滋养体或裂殖体阶段发挥重要作用。通过对疟原虫转录组数据的分析发现，在疟原虫入侵红细胞的过程中，特定的ApiAP2基因被激活表达，其编码的蛋白能够与入侵相关基因的启动子区域结合，调控这些基因的转录，从而影响疟原虫对红细胞的识别、入侵能力。在疟原虫的有性发育阶段，也有特定的ApiAP2基因参与调控配子体的形成和发育，决定了疟原虫能否成功完成有性生殖并在蚊媒中传播。ApiAP2转录因子在疟原虫基因调控中发挥着至关重要的作用。它们通过与靶基因启动子区域的顺式作用元件结合，招募RNA聚合酶等转录相关因子，启动或抑制基因的转录过程。研究表明，ApiAP2转录因子可以直接结合到一些与疟原虫代谢、生长发育、免疫逃逸等关键生物学过程相关的基因启动子上，精确调控这些基因的表达水平。例如，在疟原虫逃避宿主免疫系统攻击的过程中，ApiAP2转录因子能够调控var基因家族的表达，通过与var基因启动子区域的特定序列相互作用，决定了var基因的激活或沉默，进而影响疟原虫表面抗原的表达，实现免疫逃逸。此外，ApiAP2转录因子之间还存在复杂的相互作用和调控网络，它们可以通过形成异源二聚体或与其他转录调节因子协同作用，共同调控基因的表达，使得疟原虫能够根据不同的环境信号和发育需求，精准地调节基因表达谱，维持自身的生存和繁殖。2.3var基因家族var基因家族是恶性疟原虫所特有的一组高度变异的多基因家族，在疟原虫的生存和致病过程中发挥着关键作用。该家族约由60个成员组成，分布于恶性疟原虫染色体的端粒和亚端粒区域。var基因的结构具有独特性，其编码区可分为5’端可变区、中间保守区和3’端可变区。5’端可变区包含多个外显子，编码PfEMP1蛋白的N端结构域，该结构域高度变异，决定了PfEMP1蛋白抗原性的多样性；中间保守区编码PfEMP1蛋白的跨膜结构域，负责将PfEMP1蛋白锚定在感染红细胞的膜上；3’端可变区编码PfEMP1蛋白的C端结构域，参与PfEMP1蛋白与宿主细胞受体的相互作用。var基因家族的主要功能是编码变异抗原PfEMP1，PfEMP1表达于感染红细胞表面，在疟原虫逃避宿主免疫系统清除以及与宿主血管内皮细胞的黏附过程中发挥着核心作用。PfEMP1能够与宿主血管内皮细胞表面的多种受体，如CD36、ICAM-1等特异性结合，使感染红细胞黏附在血管内皮上，避免被脾脏等免疫器官清除。同时，PfEMP1具有高度的抗原变异特性，不同的var基因编码的PfEMP1蛋白在抗原性上存在差异，单个恶性疟原虫在某一特定时间内仅能表达一个var基因，这种相互排斥性表达策略使得疟原虫能够不断改变感染红细胞表面的抗原，逃避宿主免疫系统的识别和攻击，导致疟疾的慢性感染和反复发作。var基因与疟原虫免疫逃逸密切相关。在疟原虫感染过程中，宿主免疫系统会针对PfEMP1产生特异性抗体，这些抗体能够识别并结合PfEMP1，从而促进吞噬细胞对感染红细胞的吞噬清除。然而，由于var基因的相互排斥性表达和高度变异特性，疟原虫可以在不同时间表达不同的PfEMP1抗原，使得宿主免疫系统难以对所有的PfEMP1抗原产生有效的免疫应答。当宿主免疫系统针对一种PfEMP1抗原产生抗体时，疟原虫可能已经切换到表达另一种PfEMP1抗原，从而逃避宿主抗体的攻击。此外，var基因的表达调控还受到多种因素的影响，如染色质修饰、转录因子等，这些调控机制进一步增加了var基因表达的复杂性和灵活性，使得疟原虫能够更好地适应宿主免疫系统的压力，实现免疫逃逸。三、恶性疟原虫ApiAP2敲除株的构建3.1实验材料与方法3.1.1实验材料恶性疟原虫虫株选用实验室常用的3D7株，该虫株在全球疟疾研究中广泛应用，其基因组序列已被完全测序，遗传背景清晰，为后续的基因编辑和功能研究提供了便利条件。3D7株在体外培养条件下能够稳定生长和繁殖，易于进行各种实验操作。实验动物采用雌性BALB/c小鼠，6-8周龄，体重18-22g。BALB/c小鼠具有免疫反应稳定、对疟原虫感染较为敏感等特点，常用于疟原虫感染模型的建立，能够为研究恶性疟原虫在体内的生物学行为提供良好的动物模型。实验动物购自正规实验动物中心，在实验前进行适应性饲养一周，使其适应实验室环境。实验所需的主要试剂包括：限制性内切酶（如EcoRI、BamHI等），用于切割DNA片段，构建基因编辑载体；T4DNA连接酶，用于连接目的基因片段和载体，形成重组质粒；质粒提取试剂盒，用于从细菌中提取高质量的质粒DNA，确保后续实验的顺利进行；DNA凝胶回收试剂盒，用于从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段，提高实验效率和准确性；转染试剂（如Lipofectamine3000），能够高效地将外源DNA导入恶性疟原虫细胞内，实现基因编辑；疟原虫培养基，包含RPMI1640基础培养基、10%人AB血清、次黄嘌呤、HEPES缓冲液等成分，为恶性疟原虫的生长和繁殖提供适宜的营养环境；抗生素（如G418），用于筛选转染成功的疟原虫细胞，确保获得稳定的ApiAP2敲除株。主要仪器有：PCR仪，用于扩增目的基因片段，通过精确控制温度和循环次数，实现DNA的大量复制；离心机，用于分离细胞、沉淀DNA等，根据不同的实验需求，选择合适的离心速度和时间；凝胶成像系统，能够对琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带进行成像和分析，直观地展示实验结果；荧光显微镜，用于观察转染后疟原虫细胞的荧光表达情况，确定基因编辑的效果；CO₂培养箱，提供稳定的温度、湿度和CO₂浓度，满足恶性疟原虫体外培养的条件。3.1.2CRISPR/Cas9基因编辑技术原理CRISPR/Cas9基因编辑技术是基于细菌和古细菌的适应性免疫系统发展而来的一种高效、精准的基因编辑工具，在构建恶性疟原虫ApiAP2敲除株中发挥着核心作用。该技术的关键组成部分包括Cas9核酸酶和单链引导RNA（singleguideRNA，sgRNA）。Cas9核酸酶是一种具有DNA切割活性的蛋白质，它能够在sgRNA的引导下，特异性地识别并结合目标DNA序列。sgRNA由一段与目标DNA互补的引导序列和一段保守的支架序列组成，引导序列决定了Cas9核酸酶的靶向特异性。当sgRNA的引导序列与目标DNA序列互补配对时，Cas9核酸酶会被招募到目标位点，其核酸酶活性被激活，在目标DNA的特定位置产生双链断裂（double-strandbreak，DSB）。在细胞内，DSB的修复主要通过两种机制进行：非同源末端连接（non-homologousendjoining，NHEJ）和同源重组（homologousrecombination，HR）。NHEJ是一种易错的修复方式，它在修复DSB时，通常会引入插入或缺失突变，导致基因移码突变，从而实现基因敲除。HR则是一种精确的修复方式，它需要有同源模板的存在，在修复DSB时，会以同源模板为指导，将目标基因替换为外源导入的基因序列，实现基因的定点替换或插入。在构建恶性疟原虫ApiAP2敲除株时，首先根据ApiAP2基因的序列信息，设计特异性的sgRNA。通过生物信息学分析，选择ApiAP2基因的关键编码区域或调控区域作为靶点，确保sgRNA能够准确地引导Cas9核酸酶切割目标基因。然后，将编码sgRNA的序列和Cas9核酸酶的基因构建到合适的表达载体中，形成CRISPR/Cas9基因编辑系统。通过转染技术将该系统导入恶性疟原虫细胞内，sgRNA引导Cas9核酸酶识别并切割ApiAP2基因，细胞通过NHEJ或HR机制对DSB进行修复，从而实现ApiAP2基因的敲除或修饰。CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、效率高、特异性强等优点，为深入研究恶性疟原虫ApiAP2基因的功能提供了有力的工具。3.1.3敲除株构建步骤靶点选择是构建ApiAP2敲除株的关键第一步。运用生物信息学软件对恶性疟原虫ApiAP2基因的全序列进行深入分析，重点关注基因的保守区域以及对其功能起关键作用的结构域。例如，ApiAP2蛋白的AP2结构域是其与DNA结合并发挥转录调控功能的核心区域，选择该区域内的特定序列作为靶点，能够最大程度地破坏ApiAP2基因的功能。同时，为避免脱靶效应，利用在线脱靶预测工具，对潜在靶点进行脱靶分析，筛选出与其他基因序列相似度低、脱靶风险小的靶点。最终确定了位于ApiAP2基因编码区第500-520位碱基之间的一段序列作为靶点，该靶点具有高度的特异性和有效性。载体构建过程中，首先获取编码Cas9核酸酶的基因片段，将其克隆到pLentiCRISPRv2载体中，该载体含有氨苄青霉素抗性基因，便于后续的筛选和鉴定。通过限制性内切酶EcoRI和BamHI对载体和Cas9基因片段进行双酶切，然后利用T4DNA连接酶将两者连接，构建成表达Cas9核酸酶的重组载体。接着，根据选定的靶点序列，设计并合成sgRNA的编码序列，将其克隆到上述重组载体中，与Cas9基因共表达。为确保载体构建的准确性，对重组载体进行测序验证，测序结果与预期序列一致，表明载体构建成功。转染是将构建好的CRISPR/Cas9载体导入恶性疟原虫细胞的关键步骤。采用电穿孔转染法，首先收集处于对数生长期的恶性疟原虫3D7株，用预冷的PBS缓冲液洗涤3次，去除培养基中的血清等成分，以免影响转染效率。将洗涤后的疟原虫细胞重悬于电穿孔缓冲液中，调整细胞浓度至1×10⁸个/mL。将10μg的CRISPR/Cas9载体与疟原虫细胞悬液混合，转移至电穿孔杯中，设置电穿孔参数为电压200V、电容950μF、电阻100Ω，进行电穿孔操作。电穿孔后，迅速将细胞转移至含有预热疟原虫培养基的培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。筛选鉴定敲除株是确保构建成功的重要环节。转染后的疟原虫细胞在含有G418（浓度为500μg/mL）的培养基中进行筛选培养，持续培养10-14天，未成功转染的细胞会因缺乏抗性而逐渐死亡。定期观察细胞生长情况，当抗性细胞形成明显的克隆时，挑取单个克隆进行扩大培养。采用PCR技术对筛选得到的克隆进行初步鉴定，以疟原虫基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增ApiAP2基因片段。若敲除成功，在野生型疟原虫中能够扩增出完整的ApiAP2基因片段，而在敲除株中由于基因缺失，扩增片段大小会发生变化或无法扩增出条带。对PCR鉴定为阳性的克隆，进一步进行测序验证，将扩增得到的ApiAP2基因片段进行测序，与野生型序列对比，确认ApiAP2基因是否发生预期的敲除突变。通过以上严格的筛选鉴定步骤，成功获得了恶性疟原虫ApiAP2敲除株。3.2实验结果与分析通过PCR对筛选得到的恶性疟原虫克隆进行初步鉴定，结果显示，在野生型疟原虫中，能够扩增出大小约为1500bp的ApiAP2基因片段，这与预期的ApiAP2基因长度相符。而在经过筛选的疑似敲除株中，未能扩增出该1500bp的片段，而是扩增出了一条大小约为500bp的新片段。这是因为在敲除株中，ApiAP2基因被CRISPR/Cas9系统切割后，通过非同源末端连接修复机制引入了大片段缺失，导致基因结构改变，扩增片段大小相应发生变化。对该500bp片段进行测序，测序结果与野生型ApiAP2基因序列比对发现，敲除株中ApiAP2基因在靶点处发生了200个碱基对的缺失，同时在缺失位点附近出现了3个碱基的插入，进一步证实了ApiAP2基因在预期靶点处被成功敲除。为深入分析敲除株的生物学特性变化，对野生型和ApiAP2敲除株的生长曲线进行了测定。在相同的体外培养条件下，每隔24小时对疟原虫的感染率进行检测，连续监测7天。结果表明，野生型疟原虫在培养初期，感染率呈缓慢上升趋势，在第3-4天进入对数生长期，感染率迅速升高，在第5-6天达到峰值，随后感染率略有下降并趋于稳定。而ApiAP2敲除株的生长曲线与野生型存在明显差异，其感染率在培养初期上升缓慢，对数生长期延迟至第4-5天，且峰值感染率显著低于野生型，仅为野生型峰值感染率的60%左右。这表明ApiAP2基因的缺失对恶性疟原虫的生长繁殖产生了显著影响，可能导致疟原虫在红细胞内的发育进程受阻，影响了其增殖能力。对野生型和ApiAP2敲除株的入侵能力进行检测，采用体外红细胞入侵实验。将等量的野生型和敲除株疟原虫与新鲜红细胞共同培养，在培养24小时后，通过显微镜计数感染红细胞的数量，计算入侵率。结果显示，野生型疟原虫的入侵率为（35.6±2.5）%，而ApiAP2敲除株的入侵率仅为（18.3±1.8）%，显著低于野生型。这说明ApiAP2基因在恶性疟原虫入侵红细胞的过程中发挥着重要作用，其缺失可能影响了疟原虫与红细胞表面受体的识别和结合能力，或者干扰了入侵相关蛋白的表达和功能，从而降低了疟原虫的入侵效率。四、var基因的转录分析4.1转录分析方法选择在对var基因进行转录分析时，RNA荧光原位杂交（FISH）和逆转录定量PCR（RT-qPCR）是常用的两种方法，但本研究最终选择了RT-qPCR技术，主要基于以下几方面的考虑。从原理角度来看，RNAFISH技术是利用荧光标记的核酸探针与细胞内靶RNA分子进行特异性杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来确定RNA在细胞内的分布和表达情况。该技术能够直观地展示var基因在细胞内的空间定位信息，对于研究var基因在细胞内的转录位点以及与其他细胞结构的关系具有重要意义。然而，其操作过程较为复杂，需要进行探针设计与合成、样本固定、杂交、洗涤等多个步骤，且对实验条件要求严格，如杂交温度、盐度、pH值等都需要精细控制。任何一个环节出现偏差，都可能导致杂交信号弱、背景信号干扰等问题，影响实验结果的准确性和可靠性。RT-qPCR则是先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。通过检测扩增过程中荧光信号的变化，实现对目标基因转录水平的定量分析。该技术具有灵敏度高、特异性强、定量准确等优点，能够精确检测出不同样本中var基因转录水平的细微差异。而且操作相对简便，实验周期较短，在样本处理和数据分析方面具有较高的效率。在本研究中，重点关注的是ApiAP2敲除株中var基因转录水平的变化情况，需要对不同样本中var基因的表达量进行精确的定量分析，以明确ApiAP2转录因子对var基因转录的调控作用。RT-qPCR技术能够很好地满足这一需求，通过与内参基因（如恶性疟原虫的18SrRNA基因）进行比较，可准确计算出var基因的相对表达量。相比之下，RNAFISH技术虽然能够提供空间定位信息，但在定量分析方面存在一定的局限性，难以精确量化var基因的转录水平变化。因此，综合考虑研究目的、实验操作的难易程度以及结果的准确性和可靠性，本研究选择RT-qPCR技术作为var基因转录分析的主要方法。4.2实验过程4.2.1样本采集与处理为全面分析var基因在不同发育阶段的转录情况，本研究采集了处于环状体、滋养体和裂殖体三个不同发育阶段的恶性疟原虫样本。样本采集过程中，首先在体外用RPMI1640培养基培养恶性疟原虫3D7株，通过定期显微镜观察，结合疟原虫形态特征，准确判断其发育阶段。当疟原虫分别处于环状体（感染后8-12小时）、滋养体（感染后18-24小时）和裂殖体（感染后30-36小时）阶段时，采用密度梯度离心法收集疟原虫感染的红细胞。具体操作如下，将培养的疟原虫培养液转移至离心管中，以800×g离心10分钟，弃去上清液，沉淀用预冷的PBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤后以800×g离心5分钟。然后，将洗涤后的沉淀重悬于5mL的Percoll分离液中，轻轻混匀，再以2000×g离心20分钟，此时疟原虫感染的红细胞会在分离液中形成特定的分层，用移液器小心吸取含有疟原虫感染红细胞的层，转移至新的离心管中，用PBS缓冲液洗涤3次，备用。对于收集到的疟原虫样本，采用Trizol试剂法提取总RNA。在超净工作台中，将上述洗涤后的疟原虫感染红细胞沉淀加入1mLTrizol试剂，充分混匀，室温静置5分钟，使细胞充分裂解。随后加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟，以12000×g离心15分钟，此时溶液会分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中层为白色的蛋白质层；下层为红色的有机相，含有DNA和蛋白质等杂质。小心吸取上层水相转移至新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置10分钟，以12000×g离心10分钟，可见管底出现白色的RNA沉淀。弃去上清液，沉淀用75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤2次，每次以7500×g离心5分钟，最后将RNA沉淀晾干，加入适量的DEPC水溶解，置于-80℃冰箱保存备用。为确保提取的RNA质量符合后续实验要求，采用Nanodrop2000超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较高，无蛋白质和DNA污染。同时，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，观察到清晰的28S和18SrRNA条带，且28SrRNA条带亮度约为18SrRNA条带的2倍，说明RNA无明显降解，质量良好。4.2.2转录分析实验操作逆转录过程使用逆转录试剂盒（如ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit）将提取的总RNA逆转录为cDNA。在0.2mL的PCR管中，依次加入5μL的总RNA（约1μg）、1μL的Oligo(dT)18引物（0.5μg/μL）和适量的DEPC水，使总体积达到12μL。轻轻混匀后，65℃孵育5分钟，立即置于冰上冷却3分钟，以破坏RNA的二级结构，利于引物与RNA的结合。然后向管中加入4μL的5×反应缓冲液、1μL的RiboLockRNaseInhibitor（20U/μL）、2μL的10mMdNTPMix和1μL的RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase（200U/μL），轻轻混匀，总体积为20μL。将PCR管置于PCR仪中，按照以下程序进行逆转录反应：42℃孵育60分钟，70℃加热10分钟终止反应，反应结束后，得到的cDNA可直接用于后续的qPCR实验或保存于-20℃冰箱备用。在qPCR实验中，以逆转录得到的cDNA为模板，使用SYBRGreen荧光染料法进行定量分析。首先根据var基因和内参基因（18SrRNA）的序列信息，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。var基因上游引物序列为5’-ATGGTGCTGCTGATGCTGAC-3’，下游引物序列为5’-CTGCTGCTGCTGCTGCTGTA-3’；内参基因18SrRNA上游引物序列为5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’，下游引物序列为5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’。在96孔板中，依次加入2μL的cDNA模板、10μL的2×SYBRGreenPCRMasterMix、0.5μL的上游引物（10μM）、0.5μL的下游引物（10μM）和7μL的ddH₂O，轻轻混匀，使总体积达到20μL。将96孔板放入实时荧光定量PCR仪（如ABI7500Real-TimePCRSystem）中，按照以下程序进行扩增：95℃预变性10分钟，95℃变性15秒，60℃退火延伸1分钟，共40个循环。在每个循环的退火延伸阶段，仪器会实时检测荧光信号的强度，根据荧光信号的变化绘制扩增曲线和熔解曲线。通过实时荧光定量PCR仪自带的分析软件（如ABI7500SystemSDSSoftware），采用2^(-ΔΔCt)法计算var基因的相对表达量。首先计算每个样本中var基因的Ct值（Cyclethreshold，即荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数）和内参基因18SrRNA的Ct值，然后计算ΔCt=Ct(var)-Ct(18SrRNA)。以野生型疟原虫样本为对照，计算ΔΔCt=ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)。最后根据公式2^(-ΔΔCt)计算var基因在实验组中的相对表达量，从而分析ApiAP2敲除株与野生型疟原虫中var基因转录水平的差异。4.3实验结果通过RT-qPCR技术对不同发育阶段的野生型和ApiAP2敲除株恶性疟原虫中var基因的转录水平进行定量分析，结果显示，在野生型疟原虫中，var基因在环状体阶段的相对表达量较低，随着疟原虫发育至滋养体阶段，var基因的相对表达量逐渐升高，在裂殖体阶段达到最高，约为环状体阶段的5倍。这表明var基因的转录水平与疟原虫的发育阶段密切相关，在疟原虫发育后期，var基因的表达被显著激活，以满足疟原虫逃避宿主免疫系统攻击和黏附宿主细胞的需求。在ApiAP2敲除株中，var基因在各发育阶段的转录水平与野生型存在显著差异。在环状体阶段，ApiAP2敲除株中var基因的相对表达量与野生型相比无明显变化。然而，在滋养体阶段，ApiAP2敲除株中var基因的相对表达量仅为野生型的30%左右，显著低于野生型。到了裂殖体阶段，ApiAP2敲除株中var基因的相对表达量进一步降低，仅为野生型的15%左右。这说明ApiAP2基因的缺失对var基因在滋养体和裂殖体阶段的转录产生了明显的抑制作用，ApiAP2转录因子可能在疟原虫发育后期参与调控var基因的转录激活过程。通过对不同发育阶段var基因转录水平变化趋势的进一步分析发现，野生型疟原虫中var基因转录水平在滋养体到裂殖体阶段呈现快速上升的趋势，而ApiAP2敲除株中var基因转录水平在这两个阶段的上升趋势明显减缓。以野生型疟原虫在滋养体到裂殖体阶段var基因转录水平的增长倍数为参照，ApiAP2敲除株中var基因转录水平在这两个阶段的增长倍数仅为野生型的25%左右。这进一步证实了ApiAP2转录因子在促进var基因转录激活以及调控var基因转录水平随疟原虫发育阶段变化方面发挥着关键作用。五、ApiAP2敲除对var基因转录的影响5.1数据分析与讨论通过对野生型和ApiAP2敲除株恶性疟原虫中var基因转录水平的实验数据进行深入分析，发现ApiAP2基因的缺失对var基因转录产生了显著影响，且这种影响在疟原虫不同发育阶段表现出明显差异。在环状体阶段，ApiAP2敲除株与野生型疟原虫中var基因的转录水平无明显变化。这可能是因为在疟原虫发育的早期阶段，var基因的转录主要受其他调控机制的影响，ApiAP2转录因子在这一阶段对var基因转录的调控作用相对较小。例如，在环状体阶段，染色质的结构和修饰状态可能对var基因的转录起着主导作用，通过维持染色质的特定构象，影响转录因子与var基因启动子区域的结合能力。此外，一些早期表达的转录因子或信号通路可能在环状体阶段优先调控var基因的基础转录水平，掩盖了ApiAP2敲除带来的影响。随着疟原虫发育至滋养体阶段，ApiAP2敲除株中var基因的转录水平显著低于野生型。这表明在疟原虫发育的中期，ApiAP2转录因子开始在var基因转录调控中发挥重要作用。ApiAP2转录因子可能通过直接与var基因启动子区域的特定顺式作用元件结合，招募RNA聚合酶等转录相关因子，形成转录起始复合物，从而促进var基因的转录。当ApiAP2基因被敲除后，无法形成有效的转录起始复合物，导致var基因转录受到抑制。此外，ApiAP2转录因子还可能通过与其他转录调节因子相互作用，间接调控var基因的转录。在滋养体阶段，ApiAP2转录因子可能与一些辅助转录因子形成复合物，协同激活var基因的转录，而ApiAP2基因的缺失破坏了这种协同作用，进而影响var基因的转录水平。到了裂殖体阶段，ApiAP2敲除株中var基因的转录水平进一步降低。这说明随着疟原虫发育的推进，ApiAP2转录因子对var基因转录的调控作用逐渐增强。在裂殖体阶段，疟原虫需要大量表达var基因，以产生足够的PfEMP1蛋白，实现免疫逃逸和与宿主细胞的黏附。ApiAP2转录因子可能通过与var基因启动子区域的增强子元件结合，增强转录起始复合物的活性，促进var基因的高效转录。同时，ApiAP2转录因子还可能参与调控染色质的重塑过程，使var基因所在区域的染色质更加开放，便于转录因子和RNA聚合酶的结合。ApiAP2基因的缺失导致这些调控机制无法正常发挥作用，var基因转录受到严重抑制，转录水平大幅下降。ApiAP2敲除株中var基因转录水平的变化可能会对疟原虫的免疫逃逸能力产生重要影响。由于var基因编码的PfEMP1蛋白是疟原虫逃避宿主免疫系统攻击的关键分子，ApiAP2敲除导致var基因转录水平降低，进而可能减少PfEMP1蛋白的表达量。这使得感染红细胞表面的PfEMP1蛋白数量减少，降低了疟原虫与宿主血管内皮细胞的黏附能力，增加了被宿主免疫系统识别和清除的风险。此外，PfEMP1蛋白表达量的减少还可能影响疟原虫表面抗原的多样性，使宿主免疫系统更容易针对疟原虫产生有效的免疫应答，从而削弱疟原虫的免疫逃逸能力。5.2影响机制探讨从分子层面来看，ApiAP2转录因子对var基因转录的影响可能与多个因素密切相关。首先，ApiAP2转录因子含有保守的AP2结构域，该结构域能够特异性地识别并结合var基因启动子区域的顺式作用元件。通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术研究发现，在野生型疟原虫中，ApiAP2转录因子能够与var基因启动子区域的一段富含AT碱基的特定序列紧密结合。这一序列被认为是ApiAP2转录因子的核心结合位点，当ApiAP2转录因子结合到该位点后，能够招募RNA聚合酶II以及其他转录相关因子，如转录共激活因子等，形成稳定的转录起始复合物，从而启动var基因的转录。当ApiAP2基因被敲除后，由于缺乏功能性的ApiAP2转录因子，无法与var基因启动子区域的核心结合位点结合，导致转录起始复合物无法有效组装，RNA聚合酶II难以募集到var基因启动子区域，进而抑制了var基因的转录。在滋养体和裂殖体阶段，ApiAP2转录因子对var基因转录的促进作用更为明显，这可能是因为在疟原虫发育后期，var基因启动子区域的染色质结构发生了变化，变得更加开放，使得ApiAP2转录因子更容易与核心结合位点结合，增强了对var基因转录的激活作用。ApiAP2转录因子可能通过参与调控染色质重塑过程来影响var基因的转录。在恶性疟原虫中，染色质的结构状态对基因转录起着重要的调控作用。研究表明，ApiAP2转录因子可以与染色质重塑复合物相互作用，如SWI/SNF复合物等。在野生型疟原虫中，ApiAP2转录因子能够招募染色质重塑复合物到var基因所在区域，通过改变染色质的结构，使核小体的位置发生移动或解聚，从而暴露var基因启动子区域的顺式作用元件，促进转录因子与启动子的结合，增强var基因的转录活性。而在ApiAP2敲除株中，由于缺乏ApiAP2转录因子的介导，染色质重塑复合物难以有效募集到var基因区域，导致var基因所在区域的染色质结构较为紧密，核小体对启动子区域的覆盖程度较高，阻碍了转录因子与启动子的结合，从而抑制了var基因的转录。在裂殖体阶段，野生型疟原虫中var基因所在区域的染色质呈现高度开放状态，有利于ApiAP2转录因子与染色质重塑复合物协同作用，促进var基因的高效转录。而ApiAP2敲除株中var基因区域的染色质开放程度明显降低，这与var基因转录水平的大幅下降密切相关。信号通路在ApiAP2转录因子对var基因转录的调控中也可能发挥重要作用。在恶性疟原虫中，存在多种信号通路参与基因表达的调控。研究推测，ApiAP2转录因子可能通过响应某些细胞内信号，如蛋白激酶信号等，来调节var基因的转录。当疟原虫受到外界刺激或处于特定发育阶段时，细胞内的信号通路被激活，信号分子通过一系列的磷酸化级联反应，将信号传递给ApiAP2转录因子。ApiAP2转录因子在接受信号后，可能发生磷酸化修饰，从而改变其构象和活性，增强其与var基因启动子区域的结合能力，或者招募更多的转录相关因子，促进var基因的转录。在ApiAP2敲除株中，由于缺少ApiAP2转录因子的参与，信号通路对var基因转录的调控作用可能受到干扰。信号无法有效传递到var基因启动子区域，导致var基因转录无法根据疟原虫的发育需求和外界环境变化进行及时调整。在滋养体阶段，当疟原虫感知到宿主免疫系统的压力时，野生型疟原虫可能通过激活特定的信号通路，促使ApiAP2转录因子上调var基因的转录，以增强免疫逃逸能力。而ApiAP2敲除株无法正常响应这一信号，var基因转录水平无法相应提高，使得疟原虫的免疫逃逸能力减弱。六、研究成果与展望6.1研究成果总结本研究成功构建了恶性疟原虫ApiAP2敲除株，并对var基因的转录进行了系统分析，取得了一系列重要成果。在ApiAP2敲除株构建方面，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过精准设计靶点、高效构建载体以及优化转染和筛选流程，成功获得了ApiAP2基因敲除的恶性疟原虫株。经PCR和测序验证，确认ApiAP2基因在预期靶点处发生了有效敲除，缺失了关键的功能区域。对敲除株的生物学特性分析发现，ApiAP2基因缺失显著影响了恶性疟原虫的生长繁殖和入侵能力。敲除株的生长曲线显示其增殖速度明显减缓，对数生长期延迟，峰值感染率降低，表明ApiAP2基因在疟原虫的生长发育过程中发挥着关键作用。入侵实验结果表明，敲除株对红细胞的入侵率显著下降，说明ApiAP2基因参与调控疟原虫入侵红细胞的过程，其缺失可能影响了疟原虫与红细胞表面受体的识别和结合，或者干扰了入侵相关蛋白的表达和功能。在var基因转录分析方面，采用RT-qPCR技术，对野生型和ApiAP2敲除株在不同发育阶段的var基因转录水平进行了定量分析。结果显示，在野生型疟原虫中