萘丁美酮的代谢活化研究

[15]。胆总管剥离：将麻醉好的大鼠头部和四肢固定在大鼠固定板上，找到大鼠胸腔凸出下约2cm处，剃毛备皮，用酒精棉球消毒后，剪开一个长约2.0cm的小口，在肝脏下方找到接近胃部的肠，用镊子轻轻提起小肠，看到一条淡黄色管道与肝脏下部相连。用手术剪从根部托起胆总管，用棉签轻轻擦去表面脂肪，可以看到淡黄色液体流动。在靠近肠的远心端用消毒棉线结扎，在靠近结扎处分离出约1cm胆总管。收集胆汁：用消毒过的眼科剪在靠近结扎处剪破一个小口，将实验插管头部剪成45度角，轻轻插入胆总管，用镊子轻轻提拉胆总管，辅助插管进入胆总管1cm。用灭菌粗棉线固定插管，观察到胆汁顺利流出。缝合手术部位，消毒，加盖无菌纱布。用EP管收集1.5mL空白胆汁。而后根据大鼠体重换算给药体积，用注射器按刻度吸取，灌胃给药。分段收集给药后的胆汁，放入冰箱，待测。4.1.3大鼠尿液的收集使用代谢笼法收集尿液。选择三只大鼠，放到代谢笼中，先让大鼠适应代谢笼环境，在室温、每天给予12h光暗交替环境的条件下，喂养一周后开始实验。在实验前12h禁止大鼠禁食，允许自由饮水。先收集前两小时的空白尿液，而后根据大鼠体重换算给药体积，用注射器按刻度吸取，灌胃给药。收集给药后24h的尿液，于-80℃冰箱保存备用。实验期间允许大鼠饮食。4.2生物样品预处理向收集的胆汁或尿液样品中加入三倍体积冰乙腈来沉淀蛋白，之后涡旋3min。将样品配平后放入离心机，在4℃，19,000条件下，离心10min。取上清液于EP管中，锡纸包裹后用氮气吹干，浓缩样品。用初始流动相复溶后，再次在4℃，19,000条件下，离心10min。取5微升上清液与液相小瓶中，进LC-MS/MS分析。4.3.液质联用分析4.3.1.液相色谱条件同3.4.1中所述的液相色谱条件。4.3.2.质谱色谱条件同3.4.2中所述的质谱色谱条件。

第五章实验结果与分析5.1萘丁美酮母药药物代谢以母药为起始进行，因此了解母药的裂解规律尤为重要。首先对萘丁美酮进行LC-MS/MS分析。依照3.4.1中的液质色谱条件对萘丁美酮母药进行分析，在正离子模式下进行检测，萘丁美酮在反向色谱体系中显示出稳定的分离性能，如图Figure5-1A所示，萘丁美酮在液相中的洗脱时间为11.68min。如图Figure5-1B所示，萘丁美酮在质谱图上显示[M+H]+为229的准分子离子峰。在二级质谱中，可以观察到两个主要的碎片离子，响应最高的是萘丁美酮的特征碎片离子，质荷比为m/z171，它是萘环侧链C3和C4发生裂解生成的；而相应较低的碎片离子m/z128可能是萘环两个侧链同时发生断裂的结果，碎片离子断裂方式如Figure5-1C所示。这些碎片离子有效反映了萘丁美酮母药的裂解规律，为推测代谢结合物结构提供了重要依据。Figure5-1ChromatographicandMassSpectrometricBehaviorofnabumetone.A:Extractedion(m/z228.9→171.2)chromatogramobtainedfromLC-MS/MSanalysis.B:MS/MSspectrumofnabumetone.C:Structureoffragmention.5.2萘丁美酮体外代谢结合物的检测在多反应离子监测扫描（MRM）模式下，通过扫描离子对m/z520/245，在含有萘丁美酮的孵育体系中，检测到了一个谷胱甘肽结合物M2，保留时间为10.36min，如图Figure5-2B所示，而在未加入NADPH的孵育体系中则没有检测到该结合物，如图Figure5-2A所示。接着对M2的二级质谱进行分析，m/z445是谷胱甘肽结合物中甘氨酸基团（-75Da）断裂产生的特征碎片，m/z391是谷胱甘肽结合物中γ-谷氨酰基（-129Da）发生中性丢失产生的特征碎片，m/z213和m/z245为C-S键断裂形成的碎片离子。Figure5-2ChromatogramsobtainedfromLC-MS/MSanalysisofratlivermicrosomeincubationscontainingnabumetoneandGSHinthepresence(B)orabsence(A)ofNADPH.C:MS/MSspectraofNABandGSHconjugateobtainedfromratlivermicrosomeincubationandstructureofritodrineion.5.3体内代谢结合物分析为了研究萘丁美酮在体内的生物活化过程，分别收集给药前0-2h内的大鼠空白胆汁和给药后的大鼠胆汁，将胆汁按照4.2.1处理方式处理，再进行LC-MS/MS分析。结果显示，空白胆汁的空白组中（Figure5-3A）没有发现任何代谢物。在给药后的大鼠胆汁中，检测到萘丁美酮体内高反应性代谢中间体与GSH结合物，保留时间为10.35min（见Figure5-3B）。将大鼠体内模型胆汁样品结果分析与大鼠肝微粒体体外孵育实验所预测的萘丁美酮与还原型谷胱甘肽结合物结合物的质谱图进行对比，发现二者质谱图十分相似，碎片离子（m/z445、391、213、245）也大致相同。推测大鼠体外肝微粒体孵育所捕获的代谢结合产物与给药大鼠体内代谢活性中间体结合物可能为同一结合物。推测GSH结合萘丁美酮氧化代谢物的位置以及代谢结合物的断裂方式见Figure5-3C。Figure5-3ChromatogramsobtainedfromLC-MS/MSanalysisofbile(A&B)ofratsgivencornoilorNAB.

第六章实验结论萘丁美酮是一种长效非甾体抗炎药，临床上用于治疗类风湿性关节炎，骨关节炎，与其他非甾体抗炎药相比具有安全性更高的优点。但是随着全球患者广泛使用，其出现不良反应的报道也在增加。有少数临床数据表明，患者会出现ALT与AST短暂升高的现象。因为萘丁美酮具有萘环成分，并且代谢活化途径包括O-脱烷基过程，萘酚结构可以重排为具有高反应性的亲电中间体萘醌结构，此种结构可以与谷胱甘肽结合变成无毒形式，但如发生谷胱甘肽耗竭，此类中间体会与体内生物大分子如蛋白质核酸等结合，形成共价结合物，造成肝损伤。因此本文拟建立体外肝微粒孵育模型，和体内代谢模型检测是否有萘醌结构中间体与谷胱甘肽结合，以研究萘丁美酮产生肝损伤的机制。在体外大鼠肝微粒体孵育实验中，使用还原性谷胱甘肽来捕获高反应性中间体，根据5-2的实验结果图进行分析，结果表明得到一个结合物，保留时间为10.36min，空白组无此响应峰，说明萘丁美酮代谢过程中会产生高反应性中间体，结构可能为醌类物质。在大鼠体内实验中，检测到胆汁结合物，其保留时间为10.35min，空白组没有检测到结合物。进一步对比体外与体内实验结果，发现胆汁结合物保留时间与体外孵育实验中与谷胱甘肽结合物保留时间一致，说明萘丁美酮在体内也发生类似代谢反应，生成高反应性代谢中间体，并与谷胱甘肽形成结合物。并且根据萘丁美酮母药的二级质谱碎片断裂规律，推测中间体与谷胱甘肽的结合位点，与断裂特征。综上所述，本文建立了体内与体外模型对萘丁美酮的肝毒性机制进行了深入研究，提出了一种与萘丁美酮所致肝毒性密切相关的代谢活化路径，即萘丁美酮通过O-脱烷基化生成M1，然后进一步氧化生成萘醌中间体，该中间体可与谷胱甘肽的巯基发生共价结合，生成结合物，整个过程在细胞色素P450酶的催化下进行。Figure6-1SpeculatedmetabolicpathwayofNabumetone-inducedhepatotoxicity

第七章讨论萘丁美酮是一种非酸性非甾体抗炎药，多用于治疗风湿性关节炎，骨关节炎等。虽然其胃肠道反应小于双氯芬酸和萘普生等其他非甾体抗炎药，但在临床报道中发现少量患者出现肝损伤的情况，这一点与其他非甾体抗炎药类似。因此本文通过建立体外与体内代谢模型来探究萘丁美酮产生肝毒性的潜在机制。证据表明，外源性药物的代谢活化是引发肝毒性的重要因素。萘丁美酮是一种前药，其母药本体无活性，约35%在肝脏P450酶的作用下发生氧化反应，产生C-C键断裂，生成活性代谢物6-MNA，而后生成葡萄糖醛酸结合物经尿液排出体外。在I相代谢的其他途径中，萘丁美酮可脱O-甲基形成萘酚（M1），萘酚可以进一步被氧化为萘醌。醌类物质结构不稳定，是一种高反应性活性中间体，易与体内含硫醇的物质如蛋白质发生共价结合，导致蛋白质功能障碍，进而产生肝脏毒性。在体内，该高反应性活性中间体与谷胱甘肽的硫醇基结合，使其极性增加，并排泄到胆汁中，实现解毒。因此在体外肝微粒体孵育实验中采用谷胱甘肽作为高反应性活性代谢物的天然捕获剂，筛查可能产生肝毒性的活性中间体。经LC-MS/MS分析，观察到谷胱甘肽结合物（M2）。NADPH是细胞色素P450酶的辅酶，在没有NADPH的体系中，没有M1和M2的出现，说明细胞色素P450酶在萘丁美酮的代谢中有重要作用。在体内实验中，在胆汁中检测到谷胱甘肽结合物，与体外所得谷胱甘肽结合物保留时间相同。综上，可推测萘丁美酮经脱烷基代谢为萘酚，进一步氧化为萘醌这一高反应性活性中间体，其与蛋白质结合会产生肝脏毒性，后续可通过化学合成与人重组P450酶实验验证化合物结构与参与代谢的主要酶。

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