手掌参多糖体外调节肠道菌群作用研究

手掌参多糖体外调节肠道菌群作用研究摘要：手掌参常被用作中药材或蒙药，具有免疫调节，抗氧化，抗疲劳，耐衰老，降脂等药理作用，具有重要的研究价值。肠道菌群影响着多糖与人体之间的相互作用过程，可降解多糖，促进人体对多糖物质的吸收并产生活性代谢物；还可通过调节肠道菌群的比例来改善人体的健康状况。本文以手掌参多糖为研究对象，通过模拟肠道菌群体外厌氧发酵体系，测定酵解产物中pH值、还原糖含量、总糖含量和乳酸含量，并进行微生物测序分析。经体外肠道菌群厌氧发酵后，手掌参多糖酵解产物的pH值呈下降趋势，并且pH值(5.91)低于空白组(7.78)。还原糖含量先增加后减少，总糖含量随着酵解时间的延长，总体上呈现下降趋势，从8.918±0.258下降为7.841±0.458。乳酸含量增加但增加幅度较小，由0.322±0.200增加到0.862±0.145。肠道菌群物种组成结果分析发现，手掌参多糖对人体肠道菌群的影响主要是体现在显著上调大肠杆菌属、韦荣球菌属和巨球形菌属的相对丰度，并显著下调拟杆菌属和柠檬酸杆菌属的相对丰度。综上所述，手掌参多糖可以影响人体的肠道菌群。关键词：手掌参；多糖；肠道菌群；体外发酵InVitorFermentationOfPolysaccharidesFromGymnadeniaConopseaByHumanGutMicrobiotaAbstract:Gymnadeniaconopsea，isoftenusedasChinesemedicineorMongolianMedicine，hasthepharmacologicaleffectsofimmunoregulation，antioxidation，antifatigue，anti-agingandlipid-lowering.Therefore，ithasimportantvalueforinvestigation.Intestinalfloraaffectstheinteractionbetweenpolysaccharidesandhumanbody.Ontheonehand，itcandegradepolysaccharide，promotetheabsorptionofpolysaccharidesandtheproductlivingmetabolites;ontheotherhand，itcanalsoimprovehumanhealthbyadjustingtheproportionofintestinalflora.Inthisessay，theobjectofstudyispolysaccharidesfromgymnadeniaconopsea.Throughsimulatinginvitroanaerobicfermentationsystemofintestinalflora，wedeterminethepH，reducingsugarcontent，totalsugarcontentandlacticacidcontentofthefermentationproducts，andanalysesthemicrobialsequencing.Afteranaerobicfermentationofintestinalmicroflorainvitro，thepHofpolysaccharidefermentationproductofgymnadeniaconopseashowedadownwardtrend，andthepH(5.91)waslowerthanthatoftheblankgroup(7.78).Reducingsugarcontentincreaseedfirstandthendecreases.Thetotalsugarcontentdecreasedfrom8.918±0.258to7.841±0.458.Thecontentoflacticacidincreasedfrom0.322±0.200to0.862±0.145.Theresultsofspeciescompositionanalysisofintestinalflorashowedthattheeffectofpolysaccharidefromgymnadeniaconopseaonhumanintestinalflorawasmainlyreflectedinthesignificantup-regulationoftherelativeabundancesofE.coli，VeronicusandMacroglobulus，andthesignificantdownregulationoftherelativeabundancesofBacteroidesandCitrobacter.Tosumup，palmarginsengpolysaccharidecanaffecttheintestinalfloraofhumanbody.Keywords:Gymnadeniaconopsea;Polysaccharide;Invitrofermentation;Humangutmicrobiota目录TOC\o"1-3"\h\u15653第一章绪论 10310301.1手掌参 1011951.1.1手掌参植物概况 10165781.1.2手掌参的化学成分 10227301.1.3手掌参的药理活性研究 11327141.2肠道菌群 13254101.3多糖对肠道菌群的调节机制 14297441.3.1体外调节肠道菌群的生长 1477631.3.2体内调节肠道菌群的生长 1572561.4研究目的和内容 17131641.4.1研究意义和目的 17264861.4.2主要研究内容 176518第二章材料与方法 18110832.1实验材料、试剂及仪器 18246282.2实验方法 19251722.2.1体外模拟大肠酵解过程 19314002.2.2测定酵解产物的pH值 20137472.2.3酵解产物中还原糖含量测定 21244742.2.4酵解产物中总糖含量测定（苯酚—硫酸法） 22138482.2.5酵解过程中乳酸浓度检测 23282972.2.6微生物多样性检测 2316442第三章实验结果与讨论 24319383.1酵解过程中pH的变化 2417303.2酵解过程中还原糖含量的变化 24241633.4酵解过程中乳酸含量的变化 2545193.5微生物多样性检测结果 26103433.5.1主坐标分析法分析不同处理组微生物群落结构的差异 26106733.5.2不同处理组在不同酵解时间点的微生物组成(属水平） 2740013.5.3不同处理组在不同酵解时间点的微生物组成(种水平） 29125703.5.4微生物测序说明 31247663.5.5LDAEffectSize组间群落差异分析 3211219第四章结论与展望 34148514.1结论 3422654.2展望 346422参考文献 35文献综述1.1手掌参1.1.1手掌参植物概况手掌参(GymnadeniaconopseaR.Br)，又称藏三七等，是兰科手参属多年生草本植物手参或者粗脉手参的块茎，常被用做中药或蒙藏药。藏药名为旺拉，据古书记载，有益气补血、提高免疫的药效。手掌参不仅药用价值高，也常用作食疗原料。手参常见于疏林草地、河流两岸和矮树或丛林中，粗脉手参生常见于高山上的草地或者潮湿肥沃的地方[1]。目前市场上已有手参类的保健品，例如雪域旺拉（手参）胶囊，十味手参散，虫草手参组合系列保健品，这些都具有显著的预防治疗和滋补保健等双重功效[2]，人们常将手掌参入汤水或与酒、牛奶等同服，以达到助眠的功效。1.1.2手掌参的化学成分手掌参的根茎中主要含有苷类、糖类、二氢芪类、酚酸类、菲类化合物、甾醇类、醛类、醚类等成分。杨帆运用现代色谱方法从手掌参的块茎中分离获得了13个化合物，又运用物理化学方法和光谱学方法鉴定出了香草酸、腺嘌呤核苷、β—谷甾醇、蔗糖、胡萝卜苷、对羟基苯基β-D-葡萄糖苷等11个化合物，其中绝大多数为苷类化合物[3]。蔗糖和对羟基苯基β-D-葡萄糖苷是初次从手掌参属中分离的化合物。李敏等人运用柱色谱法来分离纯化和波谱法来结构鉴定，从手掌参块茎的乙醇提取物的正丁醇萃取部分获得对羟基苄基二硫醚、4，4′-对羟基苄基亚砜、腺嘌呤核苷、militarine、loroglossin、dactylorhinB、dactylorhinA这7个化合物[4]。其中化合物Ⅰ是初次从天然产物中分离出来，Ⅱ为初次从手掌参属中分离出来。岳正刚等人运用色谱法，从手参块茎的乙醇提取物中分离鉴定了凹舌兰素A、B、E和D、dactylorhinB、loroglossin、dactylorhinE、militarine、牛蒡酚、3-羟基苯甲酸、4-羟基异肽酸、4-羟基苯甲醇、4-羟基苄甲醚、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸等34个化合物[5]。其中17个化合物是初次从手参属植物中首次分离出来的。1.1.3手掌参的药理活性研究目前，关于手掌参植物的药理活性研究较少，据国内外实验证实，手掌参作为一种植物性多糖，主要有以下几个方面的药理活性作用。免疫调节手掌参多糖具有免疫调节作用，对于迟发型超敏反应一定程度上起到促进作用。尚林等在免疫抑制处理后，利用手掌多糖进行再处理，实验结果显示对于小鼠的胸腺和脾脏指数起抑制作用。其吞噬指数也在一定范围内得到提高，验证了猜想[6]。含手掌参成分的药物，对于亚急性衰老小鼠的免疫调节作用也有一定程度的加强[7]。多项研究表明，手掌参的免疫调节作用对于不同种情况处理下的小鼠均具有不同程度的影响。抗疲劳、抗氧化、耐缺氧、延缓衰老手掌参-37味丸的抗氧化和抗衰老能力在小鼠实验中得到印证，其作用机制是通过手掌参-37味丸可以降低小鼠血清中丙二醛(MDA）的含量，提高血清中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性，从而提高小鼠的抗氧化能力并能使小鼠延缓衰老[7]。该小鼠实验证明了手掌参-37味丸的抗氧化和抗衰老的药理作用。对于抗疲劳效用和耐衰老能力主要体现在，手掌参-37味丸能增加小鼠负重游泳时间、在耐缺氧时间及疲劳转棒落棒时间上均有不同程度的延长效果[8]。布仁巴图等人通过研究D-半乳糖使亚急性衰老小鼠的站立和活动，发现手掌参-37味丸可以明显提高站立和活动的次数，同时显著增强小鼠血清中SOD活性，这会对衰老小鼠的多项体征产生不同影响，在强健体质、应对疲劳状态、延缓衰老等方面均有显著的优势[9]。对手掌参进行不同处理，利用不同浓度条件下观察其产生结果的差异性。发现手掌参提取物对于清除自由基有明显作用，实验可知其中利用95%的乙醇提取物处理的手掌参的清除能力相较于其他条件的处理有更明显的优势，半抑制浓度（IC50）值达到0.1266mg/mL，乙酸乙酯的IC50值为0.1305mg/mL，水和酸性水提取物活性最弱[10]。另外，掌参合剂的剂量高、中、低组均具有抗疲劳效果，并且对于延长小鼠负重游泳时间均有提高，处理后实验组与空白对照组进行比较结果差异显著，其中低、中、高剂量呈量效关系[11]。手掌参提取物的抗氧化作用由此体现。改善记忆力和保护神经元于彩媛等人通过研究发现，5mg/kg的手掌参的提取物CE可以抑制胆碱能系统对于大鼠脑病理损伤的改变，明显增加大鼠脑的额叶皮层中的乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性[12]。由此推断CE可能通过保护胆碱能神经系统来改善学习记忆能力。于彩媛等人又通过另一项实验发现，5mg/kg的CE不仅能使损伤大鼠基底前脑病变部分恢复正常，还能使海马CA1区神经生长因子的表达水平上调，从而改善记忆损伤的大鼠在跳台试验中的表现[13]。CE对于大鼠的神经元中的微管蛋白β-tubulinIII的细胞结构和活性起稳定作用，从而可以减轻Aβ25-35所致的大鼠前额叶神经元的损失[14]。降脂作用张天娥等人通过每天给予大鼠高脂饲料，建立起关于大鼠高脂血症的模型，然后灌胃给予手参醇提物，实验结果显示，手参醇提物能不同程度地降低模型组大鼠血清中甘油三酯（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和肝组织中TG的含量，缓解脂质代谢对肝功能表达的负面作用[14]。其它作用手掌参对于HBSAG在特定情况下起遏制作用，另一方面它还具备促进定向干细胞增殖和对抗过敏源的功能。复方手参丸可以降低患者餐后尿微量白蛋白和血糖的排泄率，因此可以作为药物辅助治疗肾病和糖尿病[15]。除此之外，手掌参还能用于治疗急性胃溃疡，还能抑制染矽尘肺的纤维化。1.2肠道菌群肠道菌群是一个庞大复杂的肠道微生态系统，主要由厚壁菌门(60%～65%)、拟杆菌门(20%～25%)、变形菌门(5%～10%)、放线菌门(3%)组成，其中双歧杆菌、乳酸菌等为有益菌，而肠球菌、梭杆菌等为有害菌。人体的肠道内存在着许多菌群，一般情况下，人体肠道中有超过一千种细菌种类，细胞总量达到1014，超过人体细胞数的九倍之多，它们编码的基因总量可达到人体自身基因总数的150倍。目前已有大量国内外实验证明，肠道菌群的组成结构和比例与人的健康与疾病联系密切。事实上，人体的整个代谢过程就是其自身基因组与其肠道共生菌群活动的整合，人体所摄入的食物和药物都将由人体自身及其共生菌群共同加工代谢；肠道菌群所产生的代谢物会跟随着血液与营养分子一起，被运送到人体内的各个细胞组织中，因此肠道菌群代谢物都会影响每个细胞的生理活动；人体的尿液及粪便中的代谢产物除了含有人体自身代谢的，还含有肠道菌群的[16]。肠道菌群分解多糖链是通过分泌糖苷水解酶、裂解酶和酯酶等实现的，以此来获取能量，多糖酵解的最终产物有甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸，这些不仅参与哺乳动物的能量代谢，还具有广泛的生理功能。短链脂肪酸的种类和含量与肠道菌群的种类和组成比例存在着密切联系。大多数肠道菌群酵解多糖产生乙酸；拟杆菌属、梭菌属IX以及其他一些丙酸菌属酵解多糖产生丙酸；肝脏糖异生产生乙酸盐和丙酸盐；梭菌属ⅪⅤa、Ⅳ酵解多糖产生丁酸盐。乙酸盐和丙酸盐胆固醇的合成起抑制作用[17]；丁酸盐作为肠道上皮细胞的主要能源物质，能够影响肠道上皮细胞的发育、减轻氧化应激，对肠癌和炎症发生起抑制作用[18]。除此之外，短链脂肪酸还具有降低肠道pH值、抑制部分有害菌落的繁衍，提高肠粘膜免疫功能[19]等作用。1.3多糖对肠道菌群的调节机制1.3.1体外调节肠道菌群的生长Ho等人通过实验发现体肠道菌群经过体外培养，能够发酵不同聚合度的低聚木糖和木多糖混合物，并且与较高聚合度多糖相比，低聚合度的混合多糖对双歧杆菌的生长可以起到促进作用，还可以促进有机酸的生成[20]。Ahmadi等人发现，森林副产物——橡木果多糖具有抗氧化活性，橡木果多糖还能作为一种益生元[21]。Ahmadi等人比较了热空气干燥法、冷冻干燥法和真空加热干燥法得到的橡木果多糖，结果表明通过冷冻干燥得到的橡木果多糖对植物乳杆菌增殖的促进作用更加显著，由此推测多糖能否被肠道菌群所发酵与其溶解性和持水能力有关。相比热水提取法和超细粉碎提取法，超细粉碎-酶辅助提取法得到的龙眼肉多糖益生菌增殖的活性的促进作用最为显著，其主要促进植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌和明串珠菌的增殖[22]。Wang等人将肠道菌群与珊瑚虫多糖共同培养发酵，结果发现珊瑚虫多糖能够提高益生菌的数量[23]。除此之外，还能提高短链脂肪酸的产量。Xu等人将坛紫菜多糖与肠道菌群共同培养发酵，发现肠道菌群的种类在培养24h后显著增加，共同培养发酵后培养液中短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）的总量也显著增加，坛紫菜多糖改变微生物种群结构是通过促进益生菌的增殖和抑制病原体的增殖实现的[24]。Huang等人将O-乙酰-阿拉伯木聚糖(BSH-1)与肠道菌群体外共同培养发酵，结果发现肠道菌群能够利用BSH-1；共同培养发酵后的肠道菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌、类杆菌、普氏杆菌和副类杆菌的数量增加，而有害的梭杆菌、毛螺菌-UCG-008、嗜胆菌和脱硫弧菌数量降低；O-乙酰-阿拉伯木聚糖可以增加短链脂肪酸的产量，特别是乙酸、丙酸和正丁酸，从而影响肠道菌群的生态体系；除此之外，通过比较从竹茹中得到的BSH-1和从玉米芯中得到的次乙酰化木聚糖，发现BSH-1能够产生更多的正丁酸。硫酸软骨素梭形菌、双歧杆菌和类杆菌的增殖起促进作用，而对肠杆菌和乳酸杆菌的增殖起抑制作用[25]。海藻酸及其衍生物对卵状拟杆菌、木质拟杆菌和多形拟杆菌的增殖起促进作用，对短链脂肪酸的产生也起促进作用[26]。硫化浒苔多糖和硫化海带多糖促进乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖，也可增加短链脂肪酸（乙酸、丁酸和乳酸）的产生。与高分子量硫化多糖相比，低分子量硫化多糖对益生菌增殖效应的促进效果更加显著[27]。张海燕将肠道菌群与不同浓度的山药多糖进行体外共同培养，结果显示在12.5%下双歧杆菌数量增加最显著，25%下乳酸杆菌数量增加最显著，50%下抑制大肠杆菌、粪肠球菌生长效果最明显[28]。1.3.2体内调节肠道菌群的生长对机体正常肠道菌群的影响Zhang等人通过实验发现，42天后，500mg/kg/d剂量的紫花苜蓿多糖明显增加了仔猪的肠道中的乳酸杆菌的相对丰度，而减少了沙门氏菌和大肠杆菌的相对丰度；另一方面，还提高了仔猪的小肠蛋白酶和淀粉酶的作用表达。以上实验结果可以看出，紫花苜蓿多糖可以调节仔猪肠道的发育，增加仔猪肠道的益生菌的数量[29]。Gao等人利用水提法和碱水提法得到秋葵多糖WEP和AEP，给小鼠口服200mg/kg/d剂量的WEP和AEP21d后，WEP和AEP对小鼠的体重没有造成实质性变化；与阳性对照组比起来，WEP和AEP能够提高乳酸杆菌的相对丰度，但是有害菌的相对丰度没有变化；与空白对照组比起来，WEP和AEP能够提高小鼠体内益生菌的相对丰度，但是有害菌的相对丰度没有变化[30]。除此之外，还发现与WEP相比，AEP具有更好的改善作用。从以上实验结果可以看出秋葵多糖调节小鼠的肠道菌群主要是通过促进益生菌的增殖和抑制有害菌的增殖来实现的。高启禹等人通过给健康小鼠灌胃100、200、400mg/kg剂量的山药多糖，从而研究山药多糖对小鼠肠道菌群的体内调节作用。一段时间之后，发现山药多糖提高了小鼠肠道内的双歧杆菌和乳酸菌的数量，而减少了肠杆菌和肠球菌的数量[31]。Jasso-Padilla等人研究龙舌兰中的果聚糖体内调节小鼠肠道菌群作用，实验结果显示，果聚糖提高了小鼠肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，而降低了血清胆固醇和甘油三酯的浓度[32]。有实验发现谷物纤维中的阿拉伯木聚糖的水解产物低聚木糖可以改善肉鸡回肠的形态发育，另一方面也可增加肉鸡肠道内乳酸菌梭菌属ΧⅣa的数量，促进细菌产生丁酸，促进其对肠道的调节[33]。孙浩等人研究了玉屏风多糖对断奶獭兔的肠道菌群的调节作用，实验结果显示玉屏风多糖主要提高了拟杆菌门、乳杆菌属、厚壁菌门和梭菌属的相对丰度，而降低了肠球菌属和链球菌属的相对丰度。并且与空白对照相比，发酵后的玉屏风多糖对断奶獭兔的肠道菌群的影响更大[34]。对机体紊乱肠道菌群的影响Li等人通过研究发现，巴氏异粘菌岩藻糖基化硫酸软骨素提高了C57BL/6小鼠肠道内卟啉单胞菌科、巴氏杆菌和类杆菌的相对丰度，而减少了毛螺菌科和Allobaculum属的相对丰度，从而调节了厚壁菌门与拟杆菌门的比例[35]。Ren等人通过实验研究浒苔多糖对小鼠肠道菌群的调节作用，发现洛哌丁胺诱导便秘小鼠体内乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌的丰度增加，而厚壁菌门和放线菌的丰度减少。添加了浒苔多糖之后，上述菌群的丰度可以被调节恢复到正常小鼠水平[36]。除此之外，Ren等人还通过实验发现，正常的裸鼠肠道中微生物数量对的的菌群是拟杆菌门，其他数量多的菌群有变形杆菌和厚壁菌门，但添加了顺铂之后，裸鼠肠道中微生物数量最多的菌群变为变形杆菌，其次变成了拟杆菌门和厚壁菌门。换句话说，顺铂使拟杆菌属的相对丰度减少，而使变形杆菌的相对丰度增加。但添加浒苔多糖之后，肠道微生物的数量又会重新恢复到正常裸鼠水平[36]。石丹等人用七组不同剂量的蒲公英多糖对小鼠进行灌胃处理，结果发现这七组多糖均能改善小鼠的肠道菌群，蒲公英多糖使双歧杆菌和乳酸杆菌的数量大幅度上升、而使肠杆菌和肠球菌的数量减少，其中相对分子质量大于100000、6000～10000影响效果更为显著[37]。王艳等通过类似实验，发现50、100、150g/kg这三种剂量的山茱萸多糖对小鼠的肠道菌群的体内调节作用也有类似效果，但是没有类似的量效关系，例如150g/kg剂量下的山茱萸多糖对失调小鼠肠道菌群起抑制效果[38]。陈涟昊等人运用变性梯度凝胶电泳法来研究桑叶多糖对小鼠肠道菌群的体内调节作用，结果显示桑叶多糖组、乳酶生组的菌群落结构与空白对照组的类似，表明该桑叶多糖能够调节盐酸林可霉素诱导的小鼠肠道菌群失调[39]。1.4研究目的和内容1.4.1研究意义和目的活性多糖是指具有某种特殊生理活性，例如免疫调节活性的多糖，在动植物及微生物体内都广泛存在。众多实验研究证实，其中植物多糖是大多数药用植物的重要的活性物质，具有延缓衰老、缓解疲劳、耐缺氧、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种作用，随着多糖对肠道菌群的调节作用的研究实验的不断深入，通过该种方法发挥生理活性的作用已成为近些年来研究的热点。国内外已有实验证实，手掌参多糖具有免疫调节活性、抗氧化等药理作用，但还没有对手掌参多糖的体外酵解的研究实验，因此本文利用粪便菌群作为酵解模型，对手掌参多糖体外酵解行为进行研究，旨在通过测定手掌参多糖酵解后pH值和总糖、还原糖、和乳酸含量的变化以及微生物多样性检测来探究手掌参多糖在肠道中酵解过程。1.4.2主要研究内容通过体外模拟发酵体系考察手掌参多糖对人体肠道菌群的调节作用。测定发酵0h、6h、12h、24h和48h后的酵解培养物的pH，还原糖含量，总糖含量和乳酸含量并且进行微生物多样性检测。第二章材料与方法2.1实验材料、试剂及仪器实验材料：手掌参多糖（实验室自制）实验试剂：见表2-1。实验仪器：见表2-2。表2-1实验试剂试剂生产厂家氯化钠国药集团化学试剂有限公司氯化钾国药集团化学试剂有限公司碳酸氢钠国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钾国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钾上海申翔化学试剂有限公司硫酸镁国药集团化学试剂有限公司氯化钙国药集团化学试剂有限公司蛋白胨赛默飞世尔科技公司酵母提取物赛默飞世尔科技公司胆汁盐北京索莱宝科技有限公司刃天青北京索莱宝科技有限公司L-盐酸半胱氨酸北京索莱宝科技有限公司吐温80江苏彤晟化学试剂有限公司维生素K1上海源叶生物科技有限公司hemin上海源叶生物科技有限公司葡萄糖标准品上海源叶生物科技有限公司酒石酸钾钠国药集团化学试剂有限公司3，5-二硝基水杨酸上海源叶生物科技有限公司氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司苯酚上海申翔化学试剂有限公司浓硫酸东莞市力冠化工有限公司盐酸东莞市力冠化工有限公司低聚果糖北京索莱宝科技有限公司乳酸试剂盒南京建成生物工程研究所表2-2实验仪器仪器名称型号公司名称电子分析天平FA1204B郑州南北仪器有限公司电热恒温水浴锅HWS-26上海一恒科学仪器有限公司超声波清洗器KQ-250DB宁波新芝生物科技股份有限公司台式高速冷冻离心机5804REppendorf生物科学公司紫外可见分光光度计WFZUV-2100上海尤尼柯仪器有限公司pH计LA-pH10深圳式科力易翔仪器设备有限公司立式压力蒸汽灭菌器YXQ-50A上海博迅医疗生物仪器股份有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140A上海精宏实验设备有限公司高速冷冻离心机HC-2518R安徽中科中佳科学仪器有限公司大型恒温振荡器HZQ-X500C上海一恒科学仪器有限公司低温培养箱LRH-CL/CA上海一恒科学仪器有限公司2.2实验方法2.2.1体外模拟大肠酵解过程配制缓冲液和发酵培养基D-PBS的配制：称取1.6g氯化钠，0.04g氯化钾，0.29g磷酸氢二钠和0.04g磷酸二氢钾，用蒸馏水定容至200mL。吸取10ml上述溶液，加入190ml蒸馏水，即得10%D-PBS。于121℃，20min的灭菌条件下灭菌，以备使用。发酵培养基的配制：称取2.4g蛋白胨，0.12g氯化钠，2.4g酵母提取物，0.048g磷酸二氢钾，0.048g磷酸氢二钾，0.012g硫酸镁，0.012g氯化钙，2.4g碳酸氢钠，0.6gL-盐酸半胱氨酸，0.6g胆汁盐，0.024ghemin，10μl/L维生素K1，4mL0.025%（w/v）刃天青（厌氧指示剂）和2.4mL吐温80用蒸馏水定容于1.2L。用1mol/L盐酸调pH至6.8。于121℃，20min的灭菌条件下灭菌，以备使用。制备人体肠道菌群分别向2名志愿者收集新鲜粪便（要求志愿者没有肠道病史，至少3个月没有服用过抗生素类药物）。从每名志愿者粪便中取8g的粪便混合，加入10%（v/v）的D-PBS溶液配制成为20%（w/w）的固液混合物，在超净台上用4层无菌纱布过滤到另一无菌瓶中，获得20%（w/v）粪便稀释液，储存于厌氧容器中。体外发酵手掌参多糖将1mL手掌参多糖溶液与9mL人体肠道菌群培养液混合，整个过程均在厌氧环境中进行，并标记为GCPS-E1、GCPS-E2、GCPS-E3。用1mL无菌超纯水代替多糖溶液，其他步骤同上，作为空白对照组，标记为Blank1、Blank2、Blank3。用1mL低聚果糖溶液代替多糖溶液，其他步骤同上，作为阳性对照组，标记为FOS1、FOS2、FOS3。将所有的密封厌氧发酵管置于37°C，120rpm的摇床中培育反应，并且在0，6，12，24和48h五个时间点取出厌氧管，停止多糖发酵。2.2.2测定酵解产物的pH值将0，6，12，24和48h五个时间点取出的GCPS-E组，Blank组和FOS组的酵解产物离心（8000rpm，10min，4℃），然后将上清液转移到10mL加盖的EP管中。用pH计对酵解产物进行pH测定，每组平行测定三次。2.2.3酵解产物中还原糖含量测定1mg/mL葡萄糖标准液的配制准确称取10mg分析纯葡萄糖于小烧杯中，用蒸馏水溶解并定容至10mL，摇匀，放于4℃冰箱中，以备使用。3，5-二硝基水杨酸(DNS)的配制称取酒石酸钾钠109.2g，将其溶于300mL蒸馏水中，置于电炉上加热，加热温度不宜超过50℃，向热溶液中依次加入NaOH12.6g，3，5—二硝基水杨酸3.78g，苯酚3g，搅拌直至完全溶解。3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间间隙不宜过长，否则产生难溶的沉淀，导致DNS配制失败。冷却后用蒸馏水定容至600mL，贮存于棕色瓶中，室温保存，一周后才可使用。标准曲线的绘制表2-1123456葡萄糖标准液(1mg/mL)00.81.0蒸馏水(mL)1.00.20DNS试剂(mL)333333取25mL试管6支，标记为1、2、3、4、5、6，按照表2-1加入试剂，摇匀，在沸水浴中加热5min，取出将其冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，摇匀，然后在520nm波长处测定吸光值，绘制标准曲线。

还原糖的测定取2.2.2中离心上清液1mL于试管中，加入DNS试剂3mL，摇匀，在沸水浴中加热5min，取出将其冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，摇匀，然后在520nm波长处测定吸光值。2.2.4酵解产物中总糖含量测定（苯酚—硫酸法）葡萄糖标准液的配制吸取1mL中的葡萄糖标准液，加水稀释至10mL，混匀，即得浓度为0.1mg/mL葡萄糖标准液。6%苯酚溶液的配制称取12g结晶苯酚，加蒸馏水溶解，并定容至200mL，即得6%苯酚溶液。葡萄糖标准曲线的测定表2-2123456789100.1mg/mL葡萄糖溶液(mL)00.81.01.8蒸馏水(mL)2.01.21.00.26%苯酚(mL)1111111111浓H2SO4(mL)5555555555取10支试管，标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，按照表2-2加入试剂，缓慢摇匀，冷却至室温，15min后在490nm波长处测定各葡萄糖浓度的吸光度值，绘制标准曲线。总糖的测定吸取1mL2.2.2中离心上清液于试管中，加入1mL6%苯酚溶液和5mL浓H2SO4，缓慢摇匀，冷却至室温，15min后在490nm波长处测定各样品溶液的吸光度值。2.2.5酵解过程中乳酸浓度检测乳酸检测按表2-3中操作步骤进行。表2-3乳酸测试盒操作步骤空白管标准管测定管双蒸水（mL）0.033mmol/L标准品（mL）0.03待测样本（mL）0.03酶工作液（mL）显色剂（mL）混匀，37℃水浴准确反应10分钟终止液（mL）333摇匀，用双蒸水作为空白对照，在530nm波长处测定各管的吸光度值。2.2.6微生物多样性检测体外厌氧发酵结束后，收集菌体，-20℃冷冻保存，干冰条件下低温送生物科技有限公司进行微生物测序分析。

第三章实验结果与讨论3.1酵解过程中pH的变化图3-1发酵培养物在发酵0、6、12、24h和48h后的pH值如图3-1所示，随着发酵时间的延长，Blank组酵解培养物的pH值呈逐渐上升趋势，而FOS组和GCPS-E组酵解培养物的pH值呈逐渐下降趋势。在6h时，FOS组的pH下降显著，之后维持在4.6-4.1之间。12h后，GCPS-E组的pH稳定在5.9左右。GCPS-E组的pH显著低于空白组，表明GCPS-E组发酵液中产生了更多的游离H+。体外酵解实验也已证实[40]，多糖酵解可以使酵解溶液的pH降低。3.2酵解过程中还原糖含量的变化表3-1酵解产物中还原糖含量变化还原糖*0h6h12h24h48hBlank0.081±0.0080.071±0.0070.044±0.0060.031±0.0030.029±0.001FOS0.048±0.1464.657±0.3942.708±0.1523.206±0.2942.722±1.028GCPS-E3.299±0.0355.299±0.1172.055±0.0842.099±0.3781.260±0.095*平均值±标准偏差（n=3）如表3-1所示，从还原糖含量的变化趋势来看，随着酵解时间的延长，还原糖含量先增加后减少。在酵解过程中，多糖的糖苷键会被破坏，导致一些还原末端暴露出来，同时也会产生一些短链还原糖[40，41]。随着酵解过程的继续进行，这些短链还原糖会被消耗，因此含量会先增加后降低。3.3酵解过程中总糖含量的变化表3-2酵解产物中总糖含量变化总糖*0h6h12h24h48hBlank0.091±0.0110.033±0.0060.094±0.0110.073±0.0160.141±0.010FOS22.972±1.76225.789±2.00223.307±1.54120.559±0.32017.766±3.976GCPS-E8.918±0.2589.787±0.2985.687±0.57612.412±1.5637.841±0.458*平均值±标准偏差（n=3）如表3-2所示，FOS组的总糖含量先增加后减少，Blank组呈现先降后增再降的波动趋势，而GCPS-E组呈现先增后降再增的波动趋势，但总体上呈下降趋势，从8.918±0.258下降为7.841±0.458。3.4酵解过程中乳酸含量的变化表3-3酵解产物中乳酸含量变化乳酸*0h6h12h24h48hBlank0.146±0.0240.320±0.0920.122±0.0260.089±0.0570.158±0.050FOS0.103±0.0437.186±0.43723.988±1.23332.829±1.05225.838±4.095GCPS-E0.322±0.2000.462±0.0850.561±0.0121.091±0.0670.862±0.145*平均值±标准偏差（n=3）如表3-3所示，FOS组和GCPS-E组在酵解24h前浓度呈逐渐增加趋势，在第24h达最大值，而后逐渐下降。GCPS-E组变化幅度都较小，由0.322±0.200增加到0.862±0.145，可能是因为手掌参多糖发酵中产生乳酸的微生物比例比较低。3.5微生物多样性检测结果3.5.1主坐标分析法分析不同处理组微生物群落结构的差异图3-2主坐标分析法对不同样品组微生物组成的比较如图3-2所示，采用主坐标分析法（PrincipalCo-ordinatesAnalysis，PCoA）对不同样品组微生物群落结构特征进行分析。在PC1和PC2上，GCPS-E-24h组与Blank-24h组、FOS组之间和GCPS-E-48h组与Blank-48h组、FOS组之间均可明显区分开来，Blank组主要集中在象限右下侧，FOS组主要集中在象限左上侧，GCPS-E组主要集中在象限右上侧，形成了可区分的聚类区域，三种处理的样品成功聚类。3.5.2微生物组成分析(属水平）(b)(c)图3-3属水平物种分布柱状图（a)、丰度前10属水平星图（b)、热图（c)如图3-3所示，Parabacteroides、Phascolarctobacterium、Prevotella、Megasphaera、Lactobacillus、Veillonella、Citrobacter、Bifidobacterium、Bacteroides、Escherichia等属是体外厌氧发酵体系中的主要微生物类群。在酵解第24、48h时，与Blank组比，GCPS-E组酵解培养物中Escherichia、Veillonella和Megasphaera上升，Bacteroides、Bifidobacterium、unclassified、Citrobacter、Lachnoclostridium、Parabacteroides、Phascolarctobacterium下降；与FOS组相比，GCPS-E组酵解培养物中Escherichia和unclassified丰度较高，而Bacteroides、Bifidobacterium、Lachnoclostridium、Prevotella和Blautia丰度较低。3.5.3微生物组成(种水平）(a)(b)图3-4种水平物种分布柱状图（a）、热图（b）如图3-3所示，Parabacteroidesmerdae、Bilophilawadsworthia、gut_metagenome、Lactobacillusoris、Bacteroidesovatus、Parabacteroidesdistasnis、Lactobacillusmucosae、Bacteroidesthetaiotaomicron、Bacteroidesmassiliensis、Bacteroidesstercoris、Bacteroidesvulgatus、Megasphaeramicronuciformis、unculturedorganism、unculturedbacterium、Citrobacterbraakii、Bifidobacteriumpseudocatenulatum、unclassifieda等种是体外厌氧发酵体系中的主要微生物类群。在酵解第24、48h时，与Blank组比，GCPS-E组酵解培养物中unclassifieda和Megasphaeramicronuciformis丰度较高，Citrobacterbraakii、unculturedbacterium、unculturedorganism、Bacteroidesthetaiotaomicron、Bacteroidesmassiliensis、Bacteroidesstercoris和Bacteroidesvulgatus丰度较低；与FOS组相比，GCPS-E组酵解培养物中unclassifieda和Megasphaeramicronuciformis丰度较高，而Citrobacterbraakii、unculturedorganism、Bacteroidesvulgatus和Lactobacillusmucosae丰度较低。3.5.4微生物测序说明图3-5多样本稀释性曲线图3-6香农指数曲线如图3-5所示，Blank组、FOS组合GCPS-E组的OTUs的数量随测序量的增加都会显著增加，并且随着测序量的不断增大，新增的OTU的数量逐渐变缓，但在测序量达到最高时仍没有达到饱和，表明随着测序深度条数的增加，仍会有新的种系型OTU出现。但是从图3-6可以看出，代表粪便样品多样性的香农指数稀疏曲线在测序量达到最髙时已完全达到稳定状态。这表明随测序深度的增加可能会有新的物种出现，但对肠道菌群多样性的影响可能不大。3.5.5LDAEffectSize组间群落差异分析图3-7LAD条形图图3-8LEfSe树形图对测序结果的LEfSe树形图进行分析，可以探究Blank组、FOS组和GCPS-E组间形成显著差异的微生物物种。从图3-7和图3-8中可看出Haemophilus、Pasteurellaceae、Pasteurellales、Parasutterella、Sutterella、Alcaligenaceae、Burkholderiales、Betaproteobacteria增长幅度较大。第四章结论与展望4.1结论（1）经体外肠道菌群厌氧发酵后，手掌参多糖酵解产物pH呈下降趋势，并且pH值低于空白组，总糖含量随着酵解时间增长总体上呈现下降趋势，还原糖含量先增加后减少，乳酸含量增加但增加幅度较小。（2）肠道菌群物种组成结果分析发现，手掌参多糖对人体肠道菌群的影响主要是体现在显著上调大肠杆菌属、韦荣球菌属和巨球形菌属的相对丰度，并显著下调拟杆菌属和柠檬酸杆菌属的相对丰度。LEfSe分析结果显示，GCPS-E组中有8个OUT单元在丰度上有显著性差异。4.2展望多糖通过调节肠道菌群，从而发挥多种生物活性的作用逐渐成为热点，越来越多研究着着手研究。然而这些研究还存在着许多不足，研究还不够全面，关于多糖的种类、分子量、单糖组成、糖苷键连接方式这些因素对于其调节肠道菌群的作用机制和作用影响还不太清楚。虽然已有实验证实多糖对肠道菌群的体内发酵和体外发酵均具有调节作用，但对于所采用的实验方法、动物模型及理论依据仍然需要进一步完善。本实验虽然已得出手掌参多糖可以影响肠道菌群的结论，但还存在着一些不足。可从以下几个方面进行改进：本实验是将1ml手掌参多糖溶液与9mL肠道菌群共同体外厌氧发酵，没有从不同的剂量和分子量等方面研究不同浓度的手掌参对肠道菌群的影响。本实验只研究了两名志愿者的粪便菌群，之后还可以扩大志愿者数目和种类来进行研究。例如，可研究手掌参多糖对糖尿病患者的肠道菌群的调节作用；也可研究手掌参多糖对不同年龄段人群的肠道菌群的调节作用。参考文献[1]余培芝,韩鸿萍,尚军,等.手掌参多糖延缓衰老作用的研究[J].西北药学杂志,2018.[2]孙平,杨明明,周清贞,等.手掌参多糖的提取工艺研究[J].食品研究与开发,2010(03):84-87.[3]杨帆.手掌参块茎的化学成分研究[D].沈阳药科大学,2009.[4]李敏,郭顺星,王春兰,等.手参块茎化学成分研究[J].中国药学杂志,2007,42(22):1696-1698.[5]岳正刚,訾佳辰,朱承根,等.手掌参的化学成分[J].中国中药杂志,2010,35(21).[6]尚林,张国燕,李建菊,等.藏药旺拉多糖对免疫抑制小鼠免疫活性的调节[J].中药与临床,2015,6(3)：43-49.[7]斯琴,刘铜华.蒙药手掌参-37味丸对亚急性衰老模型小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影响[J].中医药导报,2014,20(4):10-11.[8]巴图德力根,韩志强,青玉,等.旺拉格-37味丸对正常小鼠抗疲劳作用的实验研究[J].辽宁中医杂志,2011,38(2)：366-367.[9]布仁巴图,韩志强,巴图德力根,等.旺拉格-37味丸对亚急性衰老小鼠自主活动记忆力、游泳耐力、SOD的影响[J].中华中医药学刊,2011,29(4):700-702．[10]李红兵,刘晔玮,李立,等.手掌参不同溶剂提取物清除自由基活性评价[J].中国卫生检验杂志,2010,20(12):3253-3255.[11]赵亮,刘国清.手掌参合剂抗疲劳作用的实验研究[J].中医临床研究,2011,3（22）:17.[12]于彩媛,石建功,张建军.藏药旺拉提取物对胆碱能损伤大鼠的神经保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(1):254-257.[13]周雅楠,杨彬,戴景峰,等.藏药旺拉提取物CE保护Aβ25-35介导的大鼠前额叶神经元损伤的作用研究[J].时珍国医国药,2011,22(5):1065-1068.[14]张天娥,陈朝勇,李少华,等.手参对高脂血症大鼠血脂及肝功能的影响[J].时珍国医国药,2013,24(4):865-867.[15]马宏伟,刘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