《输入性疟疾检测-疟原虫核酸多重PCR法》团体标准（征求意见稿）

ICS11.080

团体标准

T/SPMA00X—2022

输入性疟疾检测-疟原虫核酸多重PCR法

ImportedMalariaDetection-MalariaParasitesNucleicAcidMultiplexPCRMethods

（征求意见稿）

2022-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

上海市预防医学会发布

T/SPMA00X—2022

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由上海市预防医学会提出并归口。

本文件主要起草单位：

本标准主要起草人：

II

T/SPMA00X—2022

输入性疟疾检测-疟原虫核酸多重PCR法

1范围

本文件规定了疟原虫核酸检测多重PCR方法的技术规范。

本文件适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构、海关以及各相关院校和科研院所对疟原虫的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用必不可少。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

WS259-2015疟疾的诊断

WS/T569-2017疟原虫检测血涂片镜检法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1疟原虫（Plasmodiumspp）

疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。寄生于人体的疟原虫主要

有恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum）、间日疟原虫（Plasmodiumvivax）、三日疟原虫（Plasmodium

malariae）和卵形疟原虫（Plasmodiumovale）等。四种疟原虫的形态特征参见WS/T569-2017附录E。

3.2疟疾（Malaria）

由疟原虫寄生人体引起的传染性寄生虫病，主要有恶性疟、间日疟、三日疟、卵形疟等。疟疾的流

行病学和临床表现参见WS259-2015附录A。

3.3疟原虫核酸检测（Malariaparasitesnucleicacidtesting）

采用核酸检测方法从疟疾患者血液样本中检测疟原虫特异性基因。本文件推荐的两种多重PCR方法

的检测原理参见附录A。

3.4多重PCR（MultiplexPCR）

在同一PCR反应管中同时加入多对特异性引物进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体或鉴定同种

属不同型的病原体感染。本文件推荐了普通的多重PCR和多重荧光PCR两种方法，两种方法检测的特异性

基因种类和数量参见附录B和附录C。

3.5Ct值（Cyclethreshold）

1

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每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4仪器设备

4.1PCR扩增仪：温度范围为4℃～99℃，温度精确为0.1℃，热盖为105℃。

4.2凝胶成像系统：图像分辨率1392×1040，光源为透射UV。

4.3核酸电泳仪：电压为5V～5000V，电流为1mA～500mA。

4.4荧光定量PCR仪：不少于3个荧光通道。

4.5二级生物安全柜。

4.6医用冰箱：冷藏温度2至8℃，冷冻温度-15至-25℃。

4.7超低温冰箱：最低温度至少可达到-70℃。

4.8天平：精密度0.01g以上。

4.9微波炉。

4.10高压灭菌蒸汽锅。

4.11台式高速离心机：最大相对离心力为12000g。

4.12涡旋振荡器：无极调速范围为200r/min～3000r/min。

4.13微量可调移液器:1μL、10μL、100μL、1000μL。

4.14实验室分区：核酸检测实验室应有相应的生物安全设施和功能分区，包括试剂配制区、样品处理

区、核酸扩增区和扩增产物分析区。各功能区有专用的试剂和实验材料，不可交叉使用。

5试剂材料

5.1试剂

5.1.1除特别说明以外，所用试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682规定的三级水。

5.1.2核酸提取试剂：全血DNA提取试剂盒，建议选用商品化产品。

5.1.3分子生物学试剂：2×MultiplesPCRMasterMix（含有Taq酶、dNTPs、Mg2+、其他盐离子、

蛋白稳定剂和PCR增强剂的多重PCR预混液）、分子质量指示物（DNAMarker）、核酸染料（Goldview），

建议选用商品化产品。

5.1.4核酸电泳试剂：参见附录D。

5.1.5特异性引物、探针：参见附录B、附录C。

5.1.6质控品：

阳性对照为阳性样本或含有疟原虫特异性基因序列的质粒DNA

阴性对照为健康人全血基因组DNA。

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5.2材料

5.2.1防护用品：乳胶手套、口罩、帽子、工作服等。

5.2.2一次性耗材：1.5mL离心管、0.5mL离心管、PCR反应管、荧光PCR反应管、滤芯吸头等。

6检测步骤

6.1样品准备

样本为人体静脉血或者末梢血。样本的采集、运输和保存、及核酸样品DNA的提取方法，参见附录E。

6.2核酸扩增

6.2.1多重PCR方法

以样品DNA为模板，多重PCR反应体系的配制和反应条件的参数设置，参见附录B。

6.2.2多重荧光PCR方法

以样品DNA为模板，多重荧光PCR反应体系的配制和反应条件的参数设置，参见附录C。

6.3结果的分析

6.3.1电泳分析

取多重PCR扩增产物10µL与2μL6×加样缓冲液混合，加样于含核酸染料的2％琼脂糖凝胶加样孔中，

在1×TAE缓冲液中，5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统或紫外分

析仪记录结果。

6.3.2荧光自动采集分析

多通道荧光PCR仪，根据探针标记荧光素的种类设定不同的通道，每个扩增循环反应结束自动收集

荧光信号。

6.4结果的判定

6.4.1电泳结果的判定

6.4.1.1试验的有效性判定

阴性对照和/或空白对照未见扩增条带，混合阳性对照扩增出5个条带，本次检测试验成立；阴性

对照和/或空白对照扩增出条带，本次试验不成功。需要检查原因并重新测试。

6.4.1.2样品检测结果判定

在检测试验有效时，根据扩增条带的数量和大小进行检测结果判定：

a)待测样品未见扩增条带，为多重PCR检测阴性；待测样品扩增出1个以上条带，为多重PCR

检测阳性；

b)以DNAMarker为参照，确定扩增片段的长度。阳性样品一般显示为属特异性和种特异性2个

条带，混合感染为2个条带以上。属特异性扩增产物长度为334bp，种特异性产物长度分别为：

恶性疟原虫256bp、卵形疟原虫400bp、三日疟原虫582bp、间日疟原虫778bp；

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c)4种疟原虫特异性扩增片段长度的电泳图型示意图参见附录B.7；

d）若只扩增出属特异性条带没有种特异性条带，可能是样本的原虫密度极低或为其它种类的疟

原虫，需对扩增产物进行测序分析后判定结果。

6.4.2荧光检测结果的判定

6.4.2.1试剂盒有效性判定

阳性对照的Ct值≤30，有明显指数增长。

阴性对照的Ct值＞38或无曲线，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期或无Ct值。

6.4.2.2样品检测结果判定

在检测试验有效时，根据Ct值和扩增曲线线形进行检测结果判定：

A）阳性：待测样品检测结果Ct值≤36，有明显指数增长。四种疟原虫的分型及疟原虫属阳性的

判定见附录C.6；

B）可疑：待测样品检测结果Ct值在36-39范围。此时应对样品进行重复检测，如重复实验结果

Ct值仍在36-39范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性；

C）阴性：待测样品检测结果Ct值＞39或无曲线，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和

平台期或无Ct值；

D）4种疟原虫的多重荧光PCR扩增结果示意图参见附录C.7。

7废弃物的处理和防止污染的措施

样本采集、运输及检测过程中产生的废弃物，应进行高压灭菌，103.4kPa（1.05kg/cm）高压蒸汽

灭菌20min。检测过程中交叉污染的预防和控制措施，见WS/T230-2002。

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附录A

（资料性）

多重PCR技术原理

A.1多重PCR

常规PCR仅使用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因

子的鉴定。多重PCR（multiplexPCR），是在同一PCR反应体系里加入两对以上引物，同

时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同。

本文件推荐的是一种嵌合引物多重PCR方法。选择疟原虫的核糖体18SrRNA和线粒

体细胞色素氧化酶亚单位两个基因为目标序列。设计疟原虫属和种特异性引物共5对。其

中，疟原虫属特异性引物扩增产物为线粒体基因片段，人体4种疟原虫种特异性引物分别

扩增核糖体18SrRNA特异性区段。上述基因特异性引物分别与一段共同的非特异性核酸

片段（通用引物，5’-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3’）连接。使每一条引物的3’端为序

列特异性识别位点，5’端为一段21bp的无关序列，形成嵌合引物（chimericprimers）。反

应条件采用“三温”循环，低温循环（58℃）有利于嵌合引物中特异性区段的退火，中温

循环（62℃）使在低温循环中扩增的带有嵌合引物的产物进一步扩增，高温循环（68℃）

仅利用通用引物使不同大小的产物高效同步扩增。由于反应的温度逐级递增，低温循环中

产生的非特异性产物在后期循环中不能继续扩增，提高了检测敏感性和特异性。该体系检

测不同原虫密度样本的结果显示，以18SrRNA为目的基因的种特异性检测，检出原虫密

度平均值为4.85个原虫/μL。检测线粒体基因的属特异性片段，检出原虫密度平均值为0.41

个原虫/μL。属特异性和种特异性两个基因同时检测进一步提高了检测结果的准确性和敏感

性。

A.2多重荧光PCR

采用实时荧光PCR技术，反应液含有各目标基因的特异性扩增引物和检测探针，探针

为包含5’端标记发光基团和3’端标记淬灭基团的寡核苷酸序列，若探针保持完整，发光基

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团所发出的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到信号。在PCR扩增进程中，与模板特异性

结合的探针会被Taq酶（具5’-3’外切酶活性）切断，发光基团与淬灭基团分离，产生荧光

信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的

定性分析。

本文件推荐的是一种多重荧光PCR方法。选择疟原虫的核糖体18SrRNA基因为目标

序列。设计疟原虫属和种特异性引物及探针共5套。将恶性疟原虫、间日疟原虫和疟原虫

属的引物及探针放在同一管反应液中，三日疟原虫和卵形疟原虫的引物及探针放在同一管

反应液中，分别组成三重和双重共五重的疟原虫检测反应体系。可以同时对疟原虫属和四

种不同型的疟原虫样本进行检测。间日疟原虫、恶性疟原虫、疟原虫属在三重体系中荧光

信号分别标记为FAM、HEX、CY5，卵形疟原虫和三日疟原虫在双重体系中荧光信号分别

标记为FAM、HEX。对制备的含目的片段的质粒DNA模板进行扩增结果显示，每个荧光

信号通道结果呈S型曲线，质粒DNA模板梯度稀释曲线方程R2分别为0.998、0.999、0.999、

1、1，结果可信。在质粒DNA模板浓度为10copies/μL时，检出率均<95%；质粒DNA为

模板浓度为102copies/μL时，检出率均>95%，因此，该检测体系的最低检测限为102

copies/μL。

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附录B

（规范性）

多重PCR检测方法

B.1引物序列

疟原虫核酸检测多重PCR扩增引物的序列见表1。每条嵌合引物的3’端为序列特异性

识别位点（下划线），5’端为一段21bp的通用引物序列。

表1.多重PCR引物序列

种属名引物序列（5’-3’）产物长度

疟原虫属F：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATAGAAACAGATGCCAGGCCA

334bp

PlasmodiumR：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTATGTTAGAAGCAAACACTAGCGGTG

恶性疟原虫F1：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGATGTTTCATTTAAACTGGTTTGGGA

256bp

P.falciparumR1：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTACAATGAACTCAATCATGACTACCCG

卵形疟原虫F2：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGCTAATACTTGCTTTAATGCGTTTG

400bp

P.ovaleR2：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTCCAATTACAAAACCATGAAATGGCC

三日疟原虫F3：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATTTCAAGGAATCAATATTTTAAGT

582bp

P.malariaeR3：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATGTCTCTTTTATTTTTTACTCTATC

间日疟原虫F4：GAGTCCTGCGGTCTCAAATTTAAGGACTTTCTTTGCTTCGGC

P.vivaxR4：GAGTCCTGCGGTCTCAAATTAAATCAACCGAATTCAGTCCCAC778bp

通用引物

CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT21bp

Universal

B.2引物混合液配制

在试剂配制区进行。用无菌去离子水将合成的引物溶解后，配制成20μM/mL的保存

液，-20℃冷冻保存备用。将表1中的各引物混合配制成引物混合液，10条嵌合特异性引

物的浓度分别为0.56μM/mL，1条通用引物的浓度为5μM/mL。

B.3反应体系配制

在试剂配制区进行。取出反应体系各组分的试剂，室温融化后漩涡混匀，快速离心。

反应体系配制见表2。根据待测样品数量配制适当体积的反应混合液，分装至PCR反应管

中，每管18μL。

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表2多重PCR反应体系的配制

反应体系中的各组分每个样品各组分的用量（μL）

无菌去离子水7

引物混合液1

2×MultiplesPCRMasterMix10

总体积18

B.4加样

在样品处理区进行。在各PCR反应管中分别加入待测样品DNA各2μL，同时设置阳

性和阴性对照。盖紧管盖，做好标记，简单离心使反应液集中于管底。

B.5扩增反应条件

在核酸扩增区进行。循环反应参数设置：95℃预变性5min；94℃15s、58℃20s、72℃

20s，循环5次；94℃15s、62℃20s、72℃20s，循环10次；94℃15s、68℃20s、72℃20s，

循环25次；72℃3min，10℃保持。

B.6扩增产物的电泳分析鉴定

在扩增产物分析区进行。取PCR扩增产物10μL进行2%琼脂糖电泳分析，凝胶成像

系统中观察并拍照。以100bpDNAMarker为参照，确定扩增片段的长度。阳性样品一般

显示为属特异性和种特异性2个条带，混合感染为2个条带以上。

B.7多重PCR电泳结果示意图

800bp

间日疟（778bp）

500bp三日疟（582bp）

400bp卵形疟（400bp）

300bp疟原虫属（334bp）

200bp恶性疟（256bp）

MPvPmPoPfNMpM

图1多重PCR电泳图

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M.100bp分子量标准；Mp.多重PCR混合阳性对照；N.阴性对照；Pv：间日疟；Pm：三日疟；Po：卵形疟；Pf：恶

性疟.

B.8标准参考序列

B.8.1恶性疟原虫标准参考序列（序列号M19173，扩增序列位于该基因的654-867）

CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGATGTTTCATTTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATTATAT

ATTTTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTAATAAATTATGTTTTTATCAGATATGACAGAATCTTT

TTTAAAATCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAAATTAAGT

GTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCATTGTAATTTGAGACCGCAGGACTCG（256bp）

B.8.2卵形疟原虫标准参考序列（序列号KF696365，扩增序列位于该基因的164-521）

CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGCTAATACTTGCTTTAATGCGTTTGATTCATTTTTGTGTCTTAC

GTATGTACTTGTTAAGCCTTTAAGAGAAAAGTTTACAACTTAAGGAATTATAACAAAGAAGTAA

CACATAATAAGTTTACCTTATTTAGTGTGTATCAATCGAGTTTCTGACCTATCAGCTTTTGATGTT

AGGGTATTGGCCTAACATGGCTATGACGGGTAACGGGGAATTAGAGTTCGATTCCGGAGAGGG

AGCCTGAGAAATAGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATTCTAAA

GAAGAGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAAGGCCATTTCATGGTTTTGTAATTGGAATTT

GAGACCGCAGGACTCG（400bp）

B.8.3三日疟原虫标准参考序列（序列号AF145336，扩增序列位于该基因的33-572）

CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATTTCAAGGAATCAATATTTTAAGTAATGCTTTGTATATTT

ATAACAAAGTTGTACGTTAAGAATAAACGCCAAGCGTTATATTTTTTCTGTTACATTTTGTTTT

ATTAATATATATATGCGTTCTTATTATAAAAATGATTCTTTTTAAAATTCTTTTGTATAATTTTT

TATGCATGGGAATTTTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAACAGTTAAAACAGT

TTCTGTGTTTGAATACTACAGCATGGAATAACAAAATTGAACAAGTCAGAATTTTGTTCTTTTT

TCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGCTTGGGGGCATTTGTATTCAGATGTCAG

AGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACAAGCAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCC

ATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCAT

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T/SPMA00X—2022

AAACTATGCCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAAAAATAAAAGAGACATTCAATTTGAGA

CCGCAGGACTCG（582bp）

B.8.4间日疟原虫标准参考序列（序列号U07367，扩增序列位于该基因的757-1493）

CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTTAAGGACTTTCTTTGCTTCGGCTTGGAAGTCCTTGTTACTTTG

AGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAACAGATATAGCATTGCGCGTTTGAATACTACAGCATGG

AATAACAAATTGAACAAGTCAGAATTTTTGTTCTTTTTTCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAA

TAGGAGTAGCTTGGGGGCATTTGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAG

ACAAACAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGG

AGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGCTTTGGATG

AAAGATTTTAAAATAAGAATTTTCTCTTCGGAGTTTATTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTGCCTT

ATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGA

ATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAA

CTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTTCTTGGATG

GTGATGCATGGCCGTTTTTAGTTCGTGAATATGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGA

GATCTTAACCTGCTAATTAGCGGCAAATACGACATATTCTTACGTGGGACTGAATTCGGTTGA

TTTAATTTGAGACCGCAGGACTCG（778bp）

B.8.5疟原虫属标准参考序列（序列号NC007243，扩增序列位于该基因的1436-1727）

CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATAGAAACAGATGCCAGGCCAAAAACCCAAAAATAGAGC

TATGACGCTATCA--ATTTGACAAGGCAGATAAATTCTTTCATAGAACTTAACGTTTCATCCTC

CATACATAAATAAAACGGTAGATAGGGAACAAACTGCCTCAAGACGTTCTTAACCCAGCTCA

CGCATCGCTTCTAACGGTGAACTCTCATTCCAATGGAACCTTGTTCAAGTTCAAATAGATTGG

TAAGGTATAGCGTTTACTATCGAATGAAACAATGTATTCCACCGCTAGTGTTTGCTTCTAACA

TAATTTGAGACCGCAGGACTCG（334bp）

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附录C

（规范性）

多重荧光PCR检测方法

C.1引物和探针序列

疟原虫核酸检测多重荧光PCR扩增引物和探针的序列见表3。探针的5’端标记有荧光

素，3’端标记淬灭基团。

表3疟原虫物种特异性型别检测引物和探针

疟原虫引物和探针序列（5'-3'）

疟原虫通用型上游引物5’-CGAARGCATTTGCCTAAAATAC-3’

疟原虫通用型下游引物5’-CTAGTYGGCATAGTTTATGGTTAAG-3’

疟原虫通用型探针5’CY5-CGACGGTATCTGATCGTCTTCACTCC–BQ2-3’

恶性疟原虫上游引物5’-TGCTTTTGAGAGRTTTTGTTACTT-3’

恶性疟原虫下游引物5’-TGTAGTATTCAAACACAATGAACTC-3’

恶性疟原虫探针5’JOE-TCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGA-BQ1-3’

间日疟原虫上游引物5’-CAACGCTTCTAGCTTAATCCACA-3’

间日疟原虫下游引物5’-AAGCCGAAGCAAAGAAAGTC-3’

间日疟原虫探针5’FAM--CGACTTTGTGCGCATTTTGCTATTAT-BQ1-3’

三日疟原虫上游引物5’-CAAGGAATCAATATTTTAAGTA-3’

三日疟原虫下游引物5’-CAAAGTAACAAAATTCCCA-3’

三日疟原虫探针5’FAM-TACGTTAAGAATAACCGCCAAGG-BQ1-3’

卵形疟原虫上游引物5’-TCAAAGAATCAATATTTTAAGT-3’

卵形疟原虫下游引物5’-AAGGAATGCAAAGAGCAG-3’

卵形疟原虫探针5’JOE-AGRTGCTTAGRACAATACAACG-BQ1-3’

C.2多重荧光PCR检测预分装试剂盒

基于C.1引物和探针生产的多重荧光PCR预分装试剂盒包含PCR反应液（A管和B

管）及阴性和阳性对照。只需将DNA样品模板加入反应管中即可检测，应用方便。试剂

盒的储存条件、有效期和适用仪器参见试剂盒说明书。

C.3加样

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C.3.1取出试剂准备区准备好的八联PCR反应管，低速离心10s。

C.3.2在样品处理区打开PCR反应管盖，每管加入相应的待测DNA样品模板5μL。阳

性对照和阴性对照分别加入5μL。

C.3.3盖好PCR反应管盖，记录待测样品加样顺序，低速离心10s后将PCR反应管转

移至核酸扩增区。

C.4上机检测

C.4.1开机预热并检验仪器性能。

C.4.2取准备好的PCR反应管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。

C.4.3按表4设置仪器核酸扩增相关参数，进行PCR扩增。

表4.仪器核酸扩增相关参数

体系反应体系设为25μL

FAM通道、HEX/JOE/VIC通道和CY5通道对A管进行荧光信号采

信号采集

集；FAM通道和HEX/JOE/VIC通道对B管进行荧光信号采集。

阶段条件循环数

UNG处理50℃：2min1

PCR反应预变性95℃：3min1

条件95℃：5s

PCR55℃：60s40

（此阶段结束时采集荧光信号）

C.5结果分析

C.5.1反应结束后，点击分析（Analysis）自动获得分析结果。

C.5.2根据分析后的曲线调节基线（baseline）的起始值（Start）、终点值（End）及阈值

（threshold）。Start值可以在3-15的范围、End值可以设在5-20范围，调整阴性对照的曲

线平直或低于阈值线。

C.5.3保存实验结果，在报告（report）界面查看结果，根据需要进行打印。

C.6结果判定

C.6.1试剂盒有效性判定

阳性对照：Ct值≤30，有明显指数增长。

阴性对照：Ct值＞38或无曲线，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期或

无Ct值。

C.6.2样本结果判定

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阳性：样本检测结果Ct值≤36，有明显指数增长。四种疟原虫的分型及疟原虫属阳性的

判定见表5。

可疑：样本检测结果Ct值在36-39范围。此时应对样本进行重复检测，如重复实验结果

Ct值仍在36-39范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果Ct值＞39或无曲线，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期

和平台期或无Ct值。

表5.多重荧光PCR扩增结果判定

反应液检测通道检测型别结果判定

CY5CY5通道Ct值≤36疟原虫属

A管FAMFAM通道Ct值≤36间日疟原虫

HEX/JOE/VICHEX/JOE/VIC通道Ct值≤36恶性疟原虫

FAMFAM通道Ct值≤36三日疟原虫

B管

HEX/JOE/VICHEX/JOE/VIC通道Ct值≤36卵形疟原虫

C.7多重荧光PCR扩增结果示意图

A管B管

图2多重荧光PCR扩增示意图

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附录D

（规范性）

试剂的配制

D.16×加样缓冲液

溴酚蓝0.25g，蔗糖40g，加蒸馏水至100mL。置于4℃保存备用。也可选用市售产品。

D.22%琼脂糖凝胶

琼脂糖2.0g加1×TAE定溶至100mL，微波炉加热完全融化后，溶液冷却至60℃，加

核酸染料（Goldview）5μL，轻轻混匀后，倒入模具中制备凝胶。

D.3Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）储存液

50×TAE的配制：三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱）242g，冰乙酸57.1mL，0.5Mol/L

EDTA(pH8.0)100mL，加去离子灭菌水定溶至1000mL，混匀4℃保存备用。

D.4TAE使用液

50×TAE20mL加蒸馏水定溶至1000mL，混匀备用。

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附录E

（资料性）

样品准备

E.1样本的采集

E.1.1静脉血样

采集人体静脉血，用抗凝采血管，吸取适量血液后混匀，每份样本标记编号、名称、

样本来源和性质、采集时间等相关信息。采集过程中应该避免交叉污染并参照GB19489进

行生物安全防范。

E.1.2末梢血样

用一次性采血针耳垂或手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。将适量血滴于滤纸

上，自然干燥后装入自封袋保存。采集过程中应该避免交叉污染并参照GB19489进行生物

安全防范。

E.2样本的运输和保存

采集的样本密封后，应在6-8小时之内运送到实验室，运输过程中可在生物安全转运箱

内加冰袋，或使用保温壶。全血样本在2-8℃条件下保存不应超过24小时，在-20℃冷冻条

件下保存不超过3个月；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，避免反复冻融。

E.3核酸样品DNA的提取

E.3.1样本的处理

新鲜采集的静脉血样可以直接用于核酸提取，冷冻保存的血样需先在室温融化。末梢

采集的微量血样或滤纸保存血样需估算血量用于核酸提取。DNA样品的提取需要根据使用

量和样本量确定，推荐血液样本使用量与提取后获得的DNA样品量一致，即用100μL血

样提取100μLDNA样品。

E.3.2样品DNA的提取

推荐使用具有质量保证的商品化全血DNA提取试剂盒，可参照试剂盒说明书进行核酸

样品DNA的提取。

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T/SPMA00X—2022

参考文献

[1]江莉,蔡黎,张耀光,王真瑜,朱民,马晓疆,吴寰宇.疟疾种属同检的嵌合引物多重

PCR分子检测试剂盒及其检测方法.发明专利ZL201610181822.3

[2]田仁鹏,江莉,慕丽影,吴寰宇,吴成贡,张耀光.疟原虫分型检测试剂盒及其检测方法.

发明专利申请号：202211131066.5

[3]深圳生科原生物股份有限公司.疟原虫（疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟

原虫、三日疟原虫）核酸检测预分装试剂盒（荧光PCR法）说明书.医疗器械生产企业

许可证编号：粤食药监械生产许20051134号

16

T/SPMA00X—2022

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4仪器设备...........................................................................2

5试剂材料...........................................................................2

6检测步骤...........................................................................3

7废弃物的处理和防止污染的措施.......................................................4

附录A（资料性）多重PCR技术原理....................................................5

附录B（规范性）多重PCR检测方法....................................................7

附录C（规范性）多重荧光PCR检测方法...............................................11

附录D（规范性）试剂的配制.........................................................14

附录E（资料性）样品准备...........................................................15

参考文献.............................................................................16

I

T/SPMA00X—2022

输入性疟疾检测-疟原虫核酸多重PCR法

1范围

本文件规定了疟原虫核酸检测多重PCR方法的技术规范。

本文件适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构、海关以及各相关院校和科研院所对疟原虫的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用必不可少。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

WS259-2015疟疾的诊断

WS/T569-2017疟原虫检测血涂片镜检法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1疟原虫（Plasmodiumspp）

疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。寄生于人体的疟原虫主要

有恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum）、间日疟原虫（Plasmodiumvivax）、三日疟原虫（Plasmodium

malariae）和卵形疟原虫（Plasmodiumovale）等。四种疟原虫的形态特征参见WS/T569-2017附录E。

3.2疟疾（Malaria）

由疟原虫寄生人体引起的传染性寄生虫病，主要有恶性疟、间日疟、三日疟、卵形疟等。疟疾的流

行病学和临床表现参见WS259-2015附录A。

3.3疟原虫核酸检测（Malariaparasitesnucleicacidtesting）

采用核酸检测方法从疟疾患者血液样本中检测疟原虫特异性基因。本文件推荐的两种多重PCR方法

的检测原理参见附录A。

3.4多重