实验动物血清采集规范指南

实验动物血清采集规范指南一、引言实验动物血清作为生命科学研究中不可或缺的生物材料，广泛应用于免疫学、生物化学、药理学及临床医学等多个领域。其质量的优劣直接影响实验结果的可靠性与重复性。为确保血清采集过程的标准化、规范化，最大限度减少实验误差，保障实验数据的科学性与准确性，并兼顾实验动物福利，特制定本规范指南。本指南旨在为科研人员提供一套系统、实用的血清采集操作参考，涵盖从实验准备到样本处理及后续保存的各个关键环节。二、操作前准备（一）实验方案与伦理审查进行血清采集实验前，必须制定详细的实验方案，明确实验目的、动物种类、品系、数量、年龄、性别、体重范围、采血部位、采血量、采血频率及样本处理方法等。该方案需通过机构动物伦理委员会的审查与批准，确保实验设计符合动物福利原则，减少动物不必要的痛苦。（二）实验动物的准备1.健康状况评估：选择健康状况良好、无明显感染、无应激反应的实验动物。若动物出现精神萎靡、食欲减退、体温异常或局部感染等情况，应暂缓采血或剔除。2.适应性饲养：新购入动物应至少适应性饲养一周，使其熟悉环境，减少应激。3.禁食禁水：根据实验要求和动物种类，决定是否需要在采血前禁食（通常不禁水）。一般情况下，啮齿类动物采血前可不禁食，或仅短期禁食数小时；大型动物如犬、猴等，采血前12小时左右禁食，不禁水，以减少食物对某些血液成分的影响，并降低麻醉风险。具体禁食禁水时间需参考相关文献或实验方案。4.抓取与固定：根据动物种类选择合适的抓取和固定方法，动作应轻柔、迅速，避免过度刺激动物，引起应激反应导致血液成分改变。必要时可使用适当的保定工具或镇静/麻醉措施（需伦理审查批准）。（三）试剂与耗材的准备1.采血管：根据实验需求选择合适的采血管。血清采集通常使用不含抗凝剂的普通试管（红帽管）或促凝管（加速血液凝固，适用于需快速分离血清的情况）。若需避免血液凝固过程中某些成分的变化，或需快速获得血清，可选用含分离胶的促凝管。2.注射器与针头：根据动物大小和采血部位选择合适规格的注射器（1ml,2ml,5ml,10ml等）和针头（型号根据动物体型和血管粗细选择，如小鼠常用25G-27G，大鼠常用23G-25G，兔常用21G-23G）。针头应锋利、无弯曲、无倒钩。3.消毒用品：75%医用酒精棉球或棉片、碘伏（某些情况下使用）、无菌生理盐水、无菌纱布或脱脂棉球。4.其他耗材：无菌手套、口罩、实验服、标签、记号笔、离心管、移液器及吸头、止血钳、手术剪、镊子（若需手术采血）、保温灯或加热垫（必要时）。（四）仪器设备的准备1.离心机：提前预冷（若需低温离心），并校准转速和时间。离心参数通常为：室温或4℃下，____×g离心10-20分钟，具体参数需根据采血管类型和血清分离效果进行优化。2.天平：用于称量动物体重，估算总血量和采血量。3.保定台或固定器：根据动物种类选择。4.冰箱：4℃冰箱用于临时存放血液样本或分离后的血清；-20℃或-80℃冰箱用于血清的长期保存。（五）操作人员的准备操作人员应熟悉本指南内容及所操作动物的生物学特性和采血技术。操作前穿戴好个人防护用品（PPE），如无菌手套、口罩、实验服，必要时佩戴护目镜。手部需严格消毒或佩戴无菌手套。三、操作步骤（一）动物的抓取与保定根据动物种类和体型，采用规范的方法进行抓取和保定。确保动物安全，避免被动物咬伤或抓伤，同时避免动物过度挣扎造成损伤或应激。对于小型啮齿类动物（如小鼠、大鼠），可采用徒手抓取或使用专用固定器；对于兔、豚鼠等，可使用保定箱或由助手协助固定；对于大型动物，需使用专业保定设备并由多人配合。（二）采血部位的选择与处理根据动物种类、大小、实验需求（如单次采血量、采血频率）及操作人员熟练程度选择适宜的采血部位。常用采血部位包括：*大鼠、小鼠：眼眶后静脉丛、尾静脉、心脏（终端采血）、股静脉、颈静脉等。*兔：耳缘静脉、耳中央动脉（慎用）、心脏（终端采血）。*犬、猫：前肢头静脉、后肢隐静脉、颈静脉。*豚鼠：耳缘静脉、心脏（终端采血）、眶下静脉丛。*非人灵长类：后肢隐静脉、前肢头静脉、股静脉、颈静脉。选定采血部位后，用75%酒精棉球由内向外螺旋式擦拭皮肤2-3次，进行消毒，待酒精挥发干后再进行穿刺。（三）采血操作1.注射器采血法：*选取合适的注射器和针头，连接紧密，排尽注射器内空气。*操作人员一手固定动物及采血部位，另一手持注射器，针尖斜面朝上，根据不同采血部位的血管走向和深度，以适当角度刺入血管。当看到回血后，缓慢抽动注射器活塞，抽取所需血量。注意避免用力过猛导致溶血或血管塌陷。*采血完毕，用无菌干棉球或纱布轻压穿刺点，迅速拔出针头，持续按压止血30秒至数分钟，直至不出血为止。2.毛细管采血法（适用于小鼠眼眶后静脉丛等）：*左手拇指和食指轻轻压迫小鼠两侧颌骨，使眼球突出。*右手持肝素化或未肝素化的毛细玻璃管，从内眦部以45度角刺入，沿眼眶壁向眼底方向缓慢旋转前进，当感到阻力消失或有回血时，血液会自然流入毛细管。*采血量达到要求后，拔出毛细管，立即用干棉球轻压眼周片刻止血。3.注意事项：*避免溶血：采血过程中动作要轻柔，避免针尖在血管内反复穿刺；抽血速度不宜过快；避免血液受到剧烈震荡；注射器和采血管应清洁干燥；若使用针头转移血液，应将血液沿管壁缓慢注入采血管，避免产生气泡。*控制采血量：单次采血量一般不超过动物总血量的10%，两次采血间隔应不少于1-2周，以保证动物健康恢复。总血量估算：一般为动物体重的6-8%（ml/kg）。*多管采血：若需采集多管血液，应先将第一管血液注入含添加剂的采血管（如抗凝管），再注入血清管，以避免注射器内壁可能残留的添加剂影响血清成分。（四）血液样本的处理1.血液凝固：将采集到的血液（非抗凝）垂直放置于室温或4℃冰箱中静置30分钟至2小时，待血液自然凝固（可见血块收缩，血清析出）。若使用促凝管，可缩短凝固时间。避免剧烈晃动。2.离心分离血清：血液完全凝固后，将采血管放入离心机，按照预设的离心参数进行离心。离心时注意配平。3.血清转移：离心结束后，小心取出离心管，避免震荡。用移液器吸取上层淡黄色清亮的血清（注意不要吸到中间的白细胞层和下层的红细胞），转移至标记好的无菌离心管中。若血清中出现溶血、脂血或黄疸，应在记录中注明。（五）血清的分离与分装1.血清转移至离心管后，立即贴上标签，注明动物编号、品种/品系、性别、年龄/体重、采血日期、时间、采血部位、操作人员及其他必要信息。2.根据实验需要，可将血清进行分装，避免反复冻融。分装量以一次实验用量为宜。（六）血清的保存与运输1.短期保存：分离后的血清若在24-48小时内使用，可暂时存放于4℃冰箱。2.长期保存：应尽快放置于-20℃或-80℃冰箱冷冻保存。-20℃可保存数周至数月，-80℃可保存更长时间（数月至数年，具体取决于检测指标的稳定性）。3.避免反复冻融：反复冻融会导致血清中部分蛋白变性失活，影响检测结果。一旦解冻，应尽快使用，剩余部分若需保存，可冷藏于4℃并在短期内使用完毕。4.运输：血清样本运输时应使用足量的冰袋或干冰，确保样本在运输过程中保持冷冻状态（-20℃以下）或冷藏状态（2-8℃），并符合生物安全运输要求。四、操作后处理（一）实验动物的护理与观察1.采血完毕，将动物轻轻放回笼具，提供清洁饮水和饲料，单笼饲养观察一段时间（至少24小时），密切关注动物的精神状态、食欲、活动及穿刺部位有无出血、肿胀、感染等情况。2.对于采血量较大或精神萎靡的动物，可适当补充5%葡萄糖生理盐水。3.若出现异常情况，应及时采取相应的治疗措施，并向动物伦理委员会和实验动物管理部门报告。4.如为终端采血（如心脏采血致死），应确保动物无痛苦死亡，并按照实验动物福利要求进行尸体处理。（二）实验废弃物的处理使用过的针头、注射器、采血管、棉球等医疗废弃物，应分类收集于指定的利器盒和生物安全垃圾袋中，按照机构规定进行无害化处理，不得随意丢弃。（三）实验记录及时、准确、完整地记录实验数据，包括：*实验动物信息：编号、品种/品系、性别、年龄、体重、健康状况。*采血信息：采血日期、时间、部位、方法、采血量、血液外观。*样本处理信息：凝固时间、离心参数、血清外观（是否溶血、脂血）、分装情况、保存条件。*动物反应：采血过程中及采血后的动物反应。*操作人员及其他特殊情况记录。四、注意事项与质量控制要点1.避免溶血：溶血是血清样本最常见的质量问题，可导致多种生化指标（如钾、乳酸脱氢酶等）异常升高。需严格遵守采血和处理操作规程。2.控制采血量：过度采血会导致动物贫血、休克甚至死亡，影响实验结果的同时也违背动物福利原则。3.防止交叉污染：不同动物样本、不同批次样本处理时，应更换手套、移液器吸头，避免使用同一未消毒的器械接触不同动物。4.无菌操作观念：虽然血清并非无菌，但在采集和处理过程中应尽量减少微生物污染，操作前对台面、器械消毒，操作人员注意手卫生。5.样本标记清晰：从采血开始，每个环节都要确保样本标记清晰、唯一、可追溯。6.生物安全：实验动物可能携带人畜共患病病原体，操作人员必须严格遵守生物安全操作规程，做好个人防护，防止职业暴露。实验废弃物按规定处理。7.定期培训与考核：对操作人员进行定期培训和操作技能考核，确保其能够熟练掌握规范的操作流程。8.持续改进