用于细胞治疗应用的GMP级Cas9核酸酶的性能分析

|CTSTrueCutCas9性能比较：CTSCas9vs供应商ACas9药品监督管理局（FDA）批准，是癌症治疗领域中一个迅速发嵌合抗原受体（CART细胞疗法最早于2017年获得美国食品展的领域，涉及从患者血液中分离并激活T细胞进行体外基因修饰。CRISPR-Cas9是应用最广泛的非病毒编辑工具之一。CRISPR-Cas9是一种RNA引导的DNA核酸酶系统，由向导CTSCas9和供应商ACas9转染效率的任何干扰下，提供了一种简单的方法来直接并排比较CTSCas9和供应商ACas9所Cas980ng48ngngCTSCas9ACas9ACas9达到需要48ngCTSCas9ngACas9CTSCas9RNAgRNACas9核酸酶组成。Cas9核酸酶在该系统的整体Cas9核酸酶在CART细胞疗法工作流中发挥着至关重要的作用，但获GMPCas9依然是一个挑战。ThermoFisherScientific提供专为细胞治疗研究应用而设计的各种高质量产品。从培养基、试剂、生长因子和酶到分选磁珠和设GibcoCTS21CFR第820部分质量体系法规标准和/或获得ISO13485和ISO9001遵守这些质量法规可助力实现从实验室到临床环境的无缝转换。为了满足对高质量和高性能GMP级Cas9核酸酶的稳健供应的需求，ThermoFisherGibco™™TrueCut™Cas9采用更具有生理学相关性的模型系统，对CTSTrueCutCas9CTSCas9ACas9GMP级Cas9CTSCas9的性能始终匹配或超过供应商ACas9CTSTrueCutCas9TheworldleaderinservingscienceAB0切割未切割8064483216(ng)CTSCas9供应商ACas9(ng)CTSCas9供应商ACTSCas9的切割活性高于供应商ACas9将不同量的Cas9与等量的靶向HPRT40nggRNAHPRT300ng37°CInvitrogen™iBright™CTSCas9和供应商ACas948ng时，CTSCas9的切割效率达到ACas9达到36.5%。细胞检测TRAC-0TRAC-4TRAC-6和TRBC-1KO）ACas9相比，CTSCas9的敲除效率高出20%2B所示。TRAC-4和TRAC-6的KO效率没有显著差异。这一结果表明，当测试等剂量核酸酶时，与供应商ACas9CTSCas9CTSCas9活性在转移到细胞TCART细胞个CARTTRACTRBC和CD52种gRNAInvitrogen™Neon™μL试剂CTSCas9和供应商ACas9为了在基因组水平上进一步确定Cas9泛的一组gRNANGS的3CD52和gRNACD52-5CD52-6和）NGS的如图3AACas9CTSCas9与7种gRNA中的3TRAC-0和CD52-5个gRNATRAC-4TRAC-6CD52-6和超过Cas9Cas9种Cas9为了评估Cas9核酸酶在细胞环境中的性能，我们首先利用流式细胞术对CTSCas9和供应商ACas9在蛋白质水平的TTCRKOCas9个靶向TTRAC和TRBCgRNA22A显示了两种Cas9蛋白达到的编辑效率的代表性数CTSCas9的TCRKO超过ACas9的TCR达到。gRNANGS42AB806040200模拟CTSCas9RNP供应商ARNP****TCR(-)9.2%TCR(-)TCR(-)70.9%TRBC-1TCRa/b-PECas9供应商A图2.CTSCas9的TCR敲除效率高于供应商ACas9将靶向TTRAC和TRBCCas9pmolInvitrogen™TrueGuide™合成sgRNApmolCas9-RNPCas9-RNP复合物使用NeonMPK5000500,000T小时后收获细Invitrogen™eBioscience™FixableViabilityDyeFVDVioleteBioscience™anti-TCRa/bInvitrogen™Attune™NGS的TCRKOACas9CTSCas9的KO效率超过ACas9的KO效率达到基于NGS的KOACas9CTSCas9在各种靶标上达到的平均KO**P<0.01为了进一步探索两种Cas9研究中使用的Cas9原始5pmol稀释液进行了剂量依赖性研究。连续稀释两种Cas9T细胞中对TRAC-4TRAC-6CD52-6和3BCas9稀释度低于饱和水平CTSCas9个gRNA达到的编辑效率高于供应商ACas9CTSCas9ACas9Cas9蛋白在性能上的差异以TRAC-6ACas9的编辑效率为40%CTSCas9的编辑效率为60%体CTSCas9商ACas9ABTRAC-4TRAC-6100806040200100806040200100**806040200**1稀释度1稀释度**Cas9供应商ACD52-6806040200806040200TRAC-0TRAC-4TRAC-6TRBC-1CD52-5CD52-6CTSCas9供应商A11稀释度稀释度图3.在原代TCTSCas9的编辑效率高于供应商ACas9将CTSCas9或供应商ACas9pmolpmol个相应TrueGuide合成sgRNANeonµL的规模转染到T3IonTorrent™NGSTRAC-TRBC-1和CTSCas9和供应商ACas9pmolpmolCas9pmol相应的TrueGuidesgRNATRAC-4TRAC-6和Neon转染系统转染TACas9CTSCas9**P<0.013结论GMP级Cas9CTSTrueCutCas9蛋CTSCas9个供应商的GMP级Cas9ACas9ACas9CTSCas9的性Cas9饱和浓度下，CTSCas9始终匹配或优