第十二章固相膜免疫测定

第十二章固相膜免疫测定

第一节概述放射免疫测定1960’酶免疫测定1970’荧光免疫测定1980’－1990’化学发光免疫测定1990’－膜固相免疫测定1990’－标记免疫测定免疫浊度测定Ag+AbAgAb+Ab标记免疫测定

Ag+Ab*AgAb*+Ab*

（B）（F）免疫测定分类利用抗原抗体反应检测标本中微量物质抗原+抗体抗原抗体复合物

Ag+Ab

Ag*Ab免疫测定原理

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb固相免疫测定B与F分离多孔性毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原高度敏感性易于漂洗

操作简便

固相膜的特点玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜常用的固相膜固相膜的技术要求孔径：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示均一性固相NC膜第二节免疫金标记技术

免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。免疫金标记技术

胶体金（colloidalgold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（goldsolution）。胶体金制备原理

胶体金的制备及特性胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（nm)

（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙红色522411.00红色52571.50.70紫色535*还原100ml0.01%HAuCl4所需量胶体金（ColloidalGold）15~60nm优质劣质

胶体金结合物（Conjugate）第三节膜载体免疫测定的种类与原理固相微孔膜测定种类

免疫渗滤测定（IMMUNOFILTRATIONASSAY，IFA）免疫层析测定（IMMUNOCHROMATOGRAPHICASSAY，ICA）IFA和ICAIFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA横流（LATERALFLOW）免疫渗滤测定(IFA)AB双抗体夹心法测抗原IFA免疫层析测定

ICA样品垫结合物垫NC膜吸水垫ICA试剂条

双抗体夹心法测抗原ICA间接法测抗体ICA

阳性阴性无效ICA结果观察IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存4~8℃6个月室温一年操作步骤3~51观察时间3min3~20min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深IFA与ICA的比较优点不足之处简便，快速敏感度略低，价格略高（与ELISA比）单份测定精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志心肌标志滥用药物膜固相免疫测定的特点阳性阴性固相膜固相抗原待测抗体金标记抗人IgG抗体人IgG固相抗人IgG抗体快速检测（渗滤法）原理图GIFA技术的发展（间接法测抗体）第一代

1988HIVCHEK（DuPont）单点，5~10分钟，血清，金标试剂瓶装冻干品改进抗原HIV1+2，提高敏感度和特异性，缩短反应时间，减少步骤，样品多样化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22点（测试+控制）金标试剂：单人份、液体样品：血清、血浆、全血、尿液第九~十二代

研制中单一试剂GIFA技术的发展1990年ABBOTT公司胶体硒标记ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原体彩色胶乳标记ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml

合成TnT质控点ICA技术的发展IFA肌红蛋白双孔法

S：测定孔

C：定量质控

100μg/LIFA微量白蛋白单孔法

T：测定孔

C1：定量质控30mg/LC2：定量质控200mg/L

结果判定：（-）<30（+）30~100、

（++）100~200

（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）参考值：30μg/L肝癌诊断值：>400μg/L结果判定：（-）<30

（+）30~200

（++）200~400

（+++）>400μg/LSC测定线对照线TC2C1半定量测定Dot-ELISA

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过CTL公司生产的ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。ELISPOT检测原理哪些斑点是抗原特异性T细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有T细胞研究价值）斑点大小的意义在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸如何从单个细胞基础上分析实验精确度有多高？