课题分解纤维素的微生物的分离

教学目标:1、知道纤维素酶的种类及作用2、初步掌握从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验方法一.基础知识㈠.纤维素与纤维素酶1.纤维素

棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素可用于纺织工业，可造纸；纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。

2.纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素3.纤维素的分解：土壤中某些微生物(真菌、放线菌及细菌)能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。下列生物能分解纤维素的是（）

①人②兔③牛④蘑菇⑤纤维杆菌A.①②③④⑤B.②③⑤C.②③④⑤D.③⑤C兔、牛等草食性动物的肠胃中的共生微生物可合成纤维素酶分解纤维素。蘑菇、纤维杆菌能分泌纤维素酶分解纤维素；人不能消化纤维素。①取二支20mL的试管纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失

讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法______________。优点：该方法可以通过________反应直接筛选。刚果红染色法颜色2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成____________，当纤维素被_________分解后，红色复合物无法形成，出现以_____________为中心的________，可以通过___________________________来筛选纤维素分解菌。红色复合物纤维素酶纤维素分解菌

透明圈是否产生透明圈可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈大的，分解纤维素的能力就强啦(三)、实验设计土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别培养基挑选菌落什么样的环境取样?①培养的目的?②选择培养基的特点?挑选什么样的菌落?①鉴别培养基的特点?②如何鉴别?根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；刚果红染色法产生透明圈按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释1011021031041051064.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）制备鉴别培养基:（2）涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。

课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。〖旁栏思考1〗本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？

选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。

生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境〖旁栏思考2〗取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；【资料一】土壤取样

人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。〖旁栏思考3〗将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。

①选择培养的目的：②制备选择培养基：③操作：

将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。【资料二】选择培养培养基成分分析培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g生长因子、氮源、少量碳源水解酵素0.5g氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至1000mL水A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？

是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。

说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。（2）若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将__________改为_________。C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？葡萄糖纤维素粉用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基【资料三】刚果红染色法方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应（后置染色法）方法二：在倒平板时就加入刚果红（前置染色法）漂洗作用,氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去,这样就留下大大小小的透明圈,大的透明圈当然分解纤维素的能就强。方法一中NaCl溶液的作用？染色法优点缺点颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便不存在菌落混杂问题

产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。思考：这两种方法各有哪些优点与不足方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应方法二：在倒平板时就加入刚果红在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用〖旁栏思考4〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)纯化培养:挑选产生透明圈的菌落

挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯培养。四、结果分析与评价

1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2.分离的结果是否一致

由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。1.为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_____________实验，纤维素酶的发酵方法有______发酵和______发酵。2.纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________含量进行定量测定。发酵产纤维素酶

液体

固体

葡萄糖

五、课题延伸分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌课堂总结比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养基原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上固体培养基液体培养基筛选菌株选择培养,浓缩所需微生物比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH