【《纳米酶技术发展概述》8100字】

PAGE78纳米酶技术发展概述纳米酶是一类具有特定类酶活性的纳米材料[118-120]。纳米酶具有以下特点：第一，由纳米材料组成，具有特定的纳米结构以及不同的物理化学性质，并在生理作用下催化天然酶的生化反应。纳米酶遵循相同的酶动力学和催化机制，可通过抑制剂和激活剂调节自身的活性。催化活性来自纳米酶本身，不需要添加额外的天然酶或其他催化剂。换句话说，催化作用是一种内在的类酶活性。第二，典型的纳米尺寸效应，如大小、形态和表面，会显著影响纳米酶的活性，可以通过调节上述影响因素达到调节纳米酶活性的目的。与天然酶相类似，纳米酶也具有活性中心以及电子输运通道。活性位点赋予了纳米酶具有类酶活性或催化活性。例如，氮掺杂的碳纳米酶在HPR的活性中心具有与天然酶卟啉相似的结构。第三，纳米酶可替代人类健康中的酶，并且比天然纳米酶更具稳定性、成本更低、更容易生产。图1.9纳米酶功能类型。Fig.1.9Typeofnanaozyme.通常纳米材料被认为是催化惰性的，纳米材料的催化作用大多通过其表面氧化过的酶发挥作用，而纳米酶具有本身的内在催化活性。与传统的人工酶相比，纳米酶有许多特点或其他功能[121-124]。第一，纳米酶由无机或有机纳米材料制成，大小从几纳米到数百纳米不等。它们具有独特的纳米结构特征，如晶格、平面、缺陷、空位等。这些特性为纳米酶提供了大量影响催化活性的变量。相比之下，传统的人工酶是用小的有机化学物制备的酶，如环糊精，它只能提供有限的结构特征来模拟天然酶的活性部位。第二，由于上述丰富的结构特性，一种纳米酶可以模拟几种类酶的性能。例如，氧化铁纳米酶在酸性pH下具有类过氧化物酶活性，在中性pH下具有类过氧化氢酶活性。第三，纳米酶较传统人工酶和天然酶更容易调控，它可以通过简单地改变组分、大小、形态、手性选择性或表面性质等方法来调节纳米酶。第四，作为纳米材料，纳米酶同样具有纳米材料的物理化学性质，如磁性、荧光、电导率或光热效应、光动力学效应。这些物理化学特征可以通过pH值的改变影响其相互作用或调节其内在的类酶的活性，也为设计多功能材料或装置提供了可能，显示出纳米酶在实际应用中的巨大潜力。如图1.9所示，如今，纳米酶已经从新概念发展到新材料、新技术和新应用，并逐渐发展成为纳米生物学的一个新分支。近年来，随着纳米技术的发展，许多纳米材料的纳米结构和纳米效应被研究的越来越深入，这为人造酶提供了新的来源。例如，纳米石墨烯和富勒烯衍生物已被报道具有SOD酶模拟活动[125]。自2007年过氧化铁被发现具有过氧化物酶的活性以来，300多种纳米材料，如四氧化三铁、Co3O4、氧化铜、硫化亚铁、硫化亚铁、五氧化二钒、氧化铈、二氧化锰、Au、Ag、Pt、Pd、碳纳米管、石墨烯等材料被发现具有固有的类酶性质[126-130]。纳米酶的催化活性也从模拟天然酶发展到超越其活性。纳米酶的发现为解决天然酶的局限性提供了一种新的方法。与天然酶类相似，纳米酶类可在温和条件下有效地催化酶底物的转化，并表现出类似的甚至更高的催化活性。利用类似的酶反应动力学，可以使用酶法研究纳米酶。此外，纳米酶具有低成本、高稳定性、易于处理大规模等优异的特性。纳米酶的发现广泛地扩展了纳米材料的应用。例如，氧化铁纳米颗粒作为一种优秀的磁性纳米材料，已长期用于生物分离、传感器、磁共振成像和肿瘤体的治疗[131]。目前，纳米酶的应用已经从分子检测扩展到环境保护，以及癌症的诊断和治疗。纳米酶的应用前景为纳米材料开辟了一条新的途径。在生物分析学中，纳米酶可作为一种天然酶进行临床检测和环境监测，纳米酶具有稳定，易于制造，成本低的优点。例如，氧化铁纳米颗粒，可以模拟过氧化物酶氧化一些物质，比如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)或2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，以产生颜色或增强发光剂化学发光[132]。纳米酶的双重或多功能提供了一种智能的新材料，可用于人类健康和生活环境等领域。在体内研究中，纳米酶可以作为药物来调节/平衡活细胞的代谢。如图1.10所示，许多纳米酶具有类过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、SOD酶等活性，已被用于调节细胞中的ROS。在纳米酶催化过程中产生的强氧化活性基团，如羟基自由基和单线氧，可用于抑制肿瘤细胞生长。此外，利用这种能力，纳米酶在抗菌和抗生物膜形成和卵巢激素方面开以及一些由氧化还原失衡引起的疾病，如中风、帕金森氏症和阿尔茨海默氏症中得到了广泛研究[133-135]。图1.10纳米酶的类型与应用。Fig.1.10Typesandapplicationsofnanoenzymes纳米酶作为酶模拟物，在生理条件下催化天然酶底物的生化反应。其一，纳米酶的底物为标准酶分析中的天然酶或代谢物衍生物。其二，催化是在温和的条件下进行的，包括离子强度、pH和温度，这些条件必须在生理范围内。目前，类过氧化物酶活性是纳米酶最常见的活性之一[136-137]。具有类过氧化物酶活性的纳米酶可以作用于过氧化物，产生反应中间体，如自由基，进一步与另一底物快速反应。在该反应中，第一和第二底物也分别称为氢受体和氢供体。这种活性的第一底物（即氢受体）是过氧化物，主要是过氧化氢(H2O2)，这是辣根过氧化物酶的底物。它也可以是过氧化物的其他形式，如脂质过氧化物。一些类似过氧化物酶的纳米酶可能需要卤化物的存在才能表现出这种活性（例如溴代卤过氧化物酶的纳米酶）。这种催化的第二种底物一般只要它们能提供电子作为氢供体。主要包括一些小的代谢物（或其衍生物）和大的生物分子，包括酚类、甲酸、甲醛、乙醇、核酸(DNA/RNA)、蛋白质、多糖和脂类，这些物质都能与自由基反应，因此是潜在的靶点。因此，过氧化物酶活性的特异性作用于第一过氧化物底物，而不是第二氢供体。过氧化物酶活性的反应式如下：H2O2+H++X−→+H2O+AH→AX+H2O通常，纳米酶的类过氧化物酶活性可以通过使用天然过氧化物酶的标准底物来测定。例如，H2O2还有3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)都是经常使用的反应试剂[138]。在这个反应中，H2O2纳米酶的类过氧化物酶活性一般发生在酸性条件下。缓冲液是乙酸钠或柠檬酸钠，pH值为3-6，最优pH约为4，离子强度约为0.1~0.2M。反应温度发最佳温度为生理温度。当温度从室温上升到37°C时，纳米酶的活性增加，但一旦高于50°C，纳米酶的活性就会下降。也可以通过添加一些自由基猝灭剂来抑制或终止该反应，其中抗坏血酸、低牛磺酸、叠氮钠等比较常用。相较于天然酶和传统酶的模拟物，纳米酶的稳定性更好，对极端的pH和温度也具有一定的耐受性，而且还可以分离以供重复使用。类过氧化氢酶的活性是纳米酶常见的另外一种活性[139]。纳米酶的这种活性可以像天然过氧化氢分解酶一样分解H2O2变成O2和H2O。在该反应过程中可以观察到氧气气泡的产生。这种催化活性一般发生在中性或生理pH条件下。与天然过氧化氢酶相比，纳米酶往往具有更宽的最佳温度范围，也更具稳定性。除类过氧化氢酶活性之外，氧化酶活性也是纳米酶常见的类酶活性之一。纳米酶在氧气存在的条件下，不需要H2O2参与反应，可以直接催化氧化TMB发生颜色反应。它表现出与过氧化物酶活性相似的pH和温度依赖性。除上述几种活性以外，一些纳米酶还具有超氧化物歧化酶（SOD)的活性[140]。这些纳米酶可以催化超氧化物发生歧化反应产生O2和H2O2。这种活性通常发生在弱的碱性条件下(pH=8-9)。还有一些纳米酶具有类亚硫酸氧化酶的活性，例如，三氧化钼(MoO3)被发现可以催化亚硫酸盐的氧化生成硫酸盐[141]。类SOD活性的反应式如下：O−+Mn+1→2+nO−+n+2+→22+n+1亚硫酸氧化酶的反应式如下：SO32−+H2O→SO42−+2H++2e−除此之外，一些纳米粒子(例如AuNPs)和多金属氧酸盐被发现具有类蛋白酶活性或核酸酶活性[142-144]。纳米酶的在生物氧化还原反应中表现出的多重催化活性，与传统的天然酶催化的反应形成了鲜明对比。例如，氧化铁纳米酶具有过氧化物酶和过氧化氢酶活性。金纳米粒子具有葡萄糖氧化酶和过氧化物酶活性。纳米二氧化铈具有氧化酶、过氧化物酶和SOD酶活性。不同的纳米酶可能具有相同的催化活性。虽然目前对许多纳米酶的催化行为进行了系统的研究，但由于其复杂的组成、结构和表面修饰，比较不同纳米酶的活性的并不容易。在完全相同的反应条件(底物类型和浓度、pH、温度和缓冲液、时间等)下，用一定量的底物测定纳米酶的活性，在一定程度上反映了纳米酶的活性水平。纳米酶通常遵循与天然酶相似的反应动力学和机制，基于此原理可以用来表征纳米材料是否具有纳米酶活性[145]。通过动力学方法测定反应速率，可以确定纳米酶在不同反应条件下的催化效率。在反应过程中，纳米酶首先与相应的底物结合，然后通过表面催化反应将它们转化为产物。与天然酶一样，纳米酶只是加速反应速率，不会改变反应平衡。纳米酶催化的反应同样也遵循动力学原理。当纳米酶的浓度固定时，底物浓度相对较低时，反应速率随底物浓度的增加而增加，但底物浓度相对较高时，反应速率逐渐接近反应平台。当反应速率至最大时，底物占据所有的活性中心。与天然酶所不同的是，纳米酶在其表面可能有多个活性位点[146-148]。可以通过动力学分析研究反应速率与底物浓度的关系，并评价纳米酶的活性。动力学的反应式如下：E+S=ES=ES∗=EP=EP=E+P由于纳米酶催化的反应可能涉及多个底物以及产物。在动力学分析中，反应速率可以根据底物的消耗或产物的生成来确定。在大多数情况下，动力学分析方法主要通过使用紫外分光度计或荧光分光度计来确定。如果反应含有单一底物，则通过简单地验证底物浓度来进行动力学测定。然而，如果有两个或多个底物，则只允许一个底物的浓度变化，其他底物的浓度需要固定。用实验得到的动力学方程来表征纳米酶的性质。大多数纳米酶的动力学遵循Michaelis-Menten动力学方程，只有少数例外[149-152]。在过氧化物酶催化的反应中，过氧化物和氢供体为两种底物。因此，其中一种的动力学测定通常是通过固定另一种的浓度来进行的。在H2O2-TMB比色反应，H的动力学测定H2O2用固定在饱和浓度下的TMB进行，用固定的H进行TMB的测定H2O2浓度。通过这种方法，该反应遵循典型的米氏-曼滕动力学，就像辣根过氧化物酶一样。一些离子酶也显示出与辣根过氧化物酶(HRP)相似的催化机制[153]。在反应过程中，离子酶与第一底物(H)结合并与H2O2反应产生羟基自由基(·OH)，可以通过电子旋转共振(ESR)检测·OH中间体，进一步证实了其与过氧化物酶的相似的活性。由于过氧化氢酶在中性pH的条件下分解H2O2生成O2，确定过氧化氢酶活性的动力学是一件比较困难的事情，肉眼可以观察到O2的气泡[154-156]。为了进行定量分析检验，可以通过血氧测定法来检测O2在氧电极产生速率。该反应的催化速度与溶液中每秒产生的分子氧量成正比。该反应遵循了典型的米氏-Menten动力学的过氧化氢酶反应。但是，水中溶解O2的含量受许多外部因素的影响，如温度和压力等。其中一种测试方法是直接用分光度计在240nm处检测H2O的吸光度变化或用ESR测量DEMPO捕获的羟基自由基。因此，需要更准确的方法来表征过氧化氢酶活性。如果纳米酶被证实具有模拟天然酶的活性，那么也应该对其活性位点进行分析，以了解催化机理。一般情况下，天然酶中有一个典型的活性位点，底物与酶的结合位点存在于酶的蛋白质结构中。由于氨基酸构成的蛋白质支架的柔性，底物与酶的结合可以导致酶的结构构象，并将底物捕获到活性位点以完成催化。这是因为天然酶通常由氨基酸、糖类、金属原子和其他辅助因子组成。氨基酸形成具有特定结构的蛋白质支架，为辅助因子与金属原子配位和底物结合提供立体空间。此外，该支架对离子强度、pH和温度等环境因素的响应是灵活和动态的。这种复杂的结构使天然酶具有较高的活性、选择性和可调节性。在许多天然的过氧化物相关酶中，一个共同的特征是蛋白质支架中有一个或多个血红素分子作为活性位点，如HRP、CAT和细胞色素C(CytC)[157-159]。这三种酶虽然都有血红素基团，但活性却不不同：HRP将过氧化氢分解为羟基自由基；CAT分解H2O2生成O2和水；CytC催化O2变成H2O2。由于血红素的反应中心被铁所占据，金属原子在血红素酶的催化过程中起到关键作用。然而，只有金属原子不能形成天然酶中活性位点的典型结构。以血红素在HRP作为模型[160]。血红素是一种配位复合物，其中铁离子与具有四齿结构的卟啉配位。铁离子是进行催化的临界原子，负责O2或者H2O2的吸附以启动催化反应。在血红素中，除了卟啉环外，远端还有两个羧基以及蛋白质支架中的两个钙离子配位。如果钙元素损失，那么血红素的酶活性将会降低40%，这表明钙对血红素的催化作用很重要。此外，在HRP中存在一些糖基化基团。在HRP的结构中，碳水化合物占比高达21.8%，并附带着8个N-连接的聚糖，这些聚糖与底物结合有关。上述结构信息表明，HRP中的活性位点由血红素与周围氨基酸残基组成，远端的钙和糖基化也会影响其催化性能。血红素中心的铁负责吸附氧气或过氧化物，卟啉为电子转移提供了基础，羧基和近端氨基酸残基参与催化过程并产生对于底物的特异性，远端钙离子和聚糖维持了较高的活性。这些特征在CAT和CytC等天然酶中很常见，为理解和设计具有类似酶活性的纳米酶的活性位点提供了理论基础。然而，纳米酶是由具有非常坚韧结构的纳米材料制成的进而缺少这种结构的灵活性，但是纳米酶的活性位点和结合位点与天然酶具有相同的结构特征。2007年，研究者发现氧化铁具有过氧化物酶活性，可以作为一种纳米酶。在天然的过氧化物酶和过氧化氢酶的活性部位均有血红素作为辅助因子。其中铁元素的可逆价态在催化中起着关键作用。同样地，氧化铁纳米粒子含有大量的铁，进而这些纳米粒子可以模拟过氧化物酶或过氧化氢酶活性。如果纳米结构含有与血红素相类似结构，理论上来说该纳米材料可以模拟与血红素相类似的活动。然而，在纳米材料中，铁原子不是自由的，而是与氧原子结晶的Fe3O4或者Fe2O3。除铁在催化中的作用外，其他原子结构也可参与催化过程。实际上，血红素结构中也有两个羧基而羧基有利于与底物的结合。虽然纳米酶的活性位点与天然酶的活性位点还是存在较大的差异，但仍有可能通过对纳米酶的表面修饰来提高纳米酶对底物的反应速率与选择性。在氧化铁纳米酶或其他金属氧化物纳米酶的研究中，金属原子通常被认为是纳米酶的关键活性中心[161]。但仍有许多不含金属的纳米酶，如碳纳米酶等[162]。它们也表现出类过氧化物酶和过氧化氢酶活性。那么这些碳纳米酶中的活性位点在哪里呢？研究发现氧化石墨烯(GO)、碳点和碳纳米管(CNTs)具有类酶活性。这些碳纳米酶的最大特点是它们没有金属原子负责催化。这些碳纳米复合材料中的主要结构单元是在二维六方晶格中排列的芳香碳，主要由碳原子组成，同时也包括少量含氧化学基团。一个有趣的问题是，为什么这些非金属的碳材料具有与金属纳米材料相似的类酶活性。巧合的是，天然酶中也存在芳香结构。例如含有卟啉环螯合铁为活性中心的血红素。与先前对血红素特征的描述一样，卟啉作为一种良好的电子转移系统，有利于催化，远端羧基可以与底物结合。相应地，碳纳米材料中的芳香单元，如石墨烯，赋予了材料优异的电子转移能力与高导电性。因此，电子性质可能主要有助于石墨烯和其他碳纳米材料的类酶活性。然而，裸石墨烯对这些催化作用不是很活跃。相比之下，氧化石墨烯的过氧化物酶活性增加。量子点是一种零维材料，具有石墨烯和碳点的共同特征。研究发现，-C=O基团是催化活性中心，而O=C-O-基团作为底物结合位点，-C-OH基团降低了QCD的活性。一些研究表明，在碳纳米酶中添加多巴胺可以提高其催化活性[163]。受含有氮杂原子和螯合铁的血红素特征的启发，将氮掺杂到碳纳米球中，发现其催化活性不仅显著提高，而且可以模拟四种类似酶的活性：过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶和SOD。在碳纳米球中掺杂铁可以改善类过氧化物酶活性非金属纳米酶通过模拟蛋白质支架中氨基酸的有机基团和残基的特征，为设计和开发人工酶提供了一种替代的概念。在金属和金属氧化物纳米酶的研究中发现，一些具有相同的组分，但晶面不同的纳米酶可能影响活性位点的形成现象[164]。例如，在Fe3O4纳米结构中，在不同的表面地区暴露不同晶面后，Fe3O4展示出不同的过氧化物酶活性。在晶面中，暴露的311晶面比220晶面和111晶面具有更高的催化效率。同时对TMB的底物也具有较高的亲和力，这表明在311晶面上暴露出更多的具有催化活性的铁原子。实际上，这三种材料的比表面积是相似，但活性水平依次为：311>220>111，表明不同的晶面形成不同的原子结构会影响纳米酶的催化活性。更重要的是，不存在于天然酶中的贵金属也具有类酶活性，这一现象显示了晶体平面上对原子结构的依赖[165]。然而，这种类型的纳米酶并没有发现与金属氧化物或碳纳米酶有共同特征。它们既没有氧合形式的过渡金属原子，也没有有机基团，如卟啉和羧基。例如，具有氧化酶活性的金纳米酶的活性顺序为：(211)>(110)>(111)。对于(111)和(211）的金面，前者具有平坦的表面，而后者具有台阶结构。如果以较低的配位数暴露金原子，从而使其与氧的吸附能力变强。这一现象发现，金纳米粒子只有在其尺寸为纳米尺度(例如3-5nm)时才表现出催化活性。同样，具有（111)面的钯纳米晶比具有(100）面的钯纳米晶具有更高的过氧化氢酶活性和SOD活性。天然SOD酶活性不同于天然过氧化物酶和过氧化氢酶活性，因为它没有典型的血红素辅助因子。天然SOD酶只需要金属原子螯合到蛋白质支架中，如Fe、Mn、Cu-Zn和Ni。这些金属原子经常与蛋白质支架中氨基酸的残基配位，如组氨酸的咪唑部分。事实上，一些金属纳米材料已被报道具有类似SOD的活性，比如含铈纳米材料具有这种活性[166]。在催化过程中，超氧自由基能从水中捕获质子并吸附到纳米酶的表面，发生反应生成H2O2和O2。如果纳米酶具有类过氧化物酶或过氧化氢酶活性，那么H2O2和O2会进一步发生反应。金属纳米结构的晶面上通过底物吸附、中间解离和电子转移过程，产生类酶的催化效果。反应位点上反应的反应能和活化能决定了催化的可行性和速率。因此，这种纳米酶可以作为一个理想的模拟分析模型，以揭示基于经典化学催化知识的机理，如吸附能、活化能等。然而，实际制备的纳米酶并没有均匀的纳米结构。纳米酶表面存在大量的缺陷，如空位、边缘、无序、多态、掺杂或合金等。缺陷的存在可能有利于活性位点的生成以提高纳米酶的活性。目前，大多数纳米酶表现出与氧相关的活性底物(如H)的氧化还原反应。从化学成分上来讲，这些纳米酶是由金属、金属氧化物或碳的无机元素组成的。相比之下，天然酶则是由具有精确结构的蛋白质支架构建的。很多纳米酶的反应的中心为金属原子，在纳米酶的催化作用进程中，通过金属价态的变化而发生反应。金属元素的价态变化帮助纳米酶实现过氧化物酶的催化循环。Fe(II)改为Fe(III)可以实现氧化酶的循环，铁的价态变化需要将H2O2或者氧气上的电子转移到铁原子上。因此，如果纳米材料能够实现类似的电子转移，那么理论上，纳米酶可以实现相应的类酶活动。如图1.11所示，普鲁士蓝（PB）纳米粒子具有类多酶活性，包括过氧化物酶、过氧化氢酶和SOD活性[167]。一般情况下，PB可以通过电子转移还原成普鲁士白(PW)，氧化成柏林绿色(BG)或普鲁士黄色(PY)。在不同的pH条件下，PB/PW、BG/PB和PY/BG的不同氧化还原电位使它们能够进行上述多种类