生物化学与分子生物学实验四Westernblot(七年制)

Westernbot实验目的了解凝胶中蛋白质的电转移技术与方法了解抗原-抗体印迹的技术和方法掌握Westernblot的基本原理Westernblot是利用抗体作探针来检测已转移到固相支持物上的靶蛋白。用于对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白质进行鉴别和定量。实验原理通过电泳区分待测样品不同的组分，再在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上，通过特异抗体作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测低至1~5ng(最低可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。SDS电泳Westernblot流程转膜一抗、二抗孵育底物显色蛋白样品制备封闭SDS电泳PAGE组成PAGE是由丙烯酰胺（Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr+Bis

多孔三维网状结构PAGE的聚合需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。化学聚合：AP-TEMED系统过硫酸胺（AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42-

。注意：

TEMED会影响催化作用，须在碱性条件下聚合。氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和

Bis的总克数。

T=（a+b）/m×100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。

T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。

C——Bis占单体与交联剂总量的百分比C=b/（a+b）×100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小SDS的作用SDS:使蛋白变性，并带上等量的电荷在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小分离原理浓缩效应1.凝胶层的不连续性两层凝胶T与C不同

孔径不同浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。2.缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸（pI=6.0）进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（

）很小，有效迁移率（M

）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl

是强电解质，

=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。

pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸HCl蛋白质浓缩胶分离胶样品PH=6.7T=3%PH=8.9T=8%分子筛效应与电荷效应进入分离胶后，Gly-成为快离子分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离Bis～Arc摩尔比为1：29。

凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：

丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）

1512～431016～687.536～945.057～212Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200SDS操作过程1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小烧杯2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板)

*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板

3.按比例配好分离胶（P44，表1-4-4）,用移液枪快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5-7厘米,之后加少许蒸馏水液封，保持胶面平整，排气泡,静置至胶凝(约20-30min)

*凝胶配制过程要迅速,AP、TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。Arc-Bis具有神经毒性，操作时要戴手套。4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶（P44，表1-4-4）,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝

*梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平

5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出6.上样：（1）marker和样品均上20µl

（2）上样顺序：左→右：Marker--牛血清--牛血清白蛋白--g-球蛋白，多余的上样槽不能空，加入等量上样缓冲液100℃沸水，5min蛋白变性上样MarkerFermentas预染蛋白Marker#SM1811

7.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始恒压100V），当进入分离胶后改为150V，溴酚蓝跑至凝胶边缘时，停止电泳(90min)

8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，对称切开，一半加入考马斯亮蓝染色染色液，60℃水浴，15min,

9.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰

*剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分

10.实验结果分析注意事项胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽是混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适转膜Membrane:吸附生命大分子的固体材料NC膜：硝酸纤维素膜，0.22um,0.45umNDM膜：尼龙膜PVDF膜：聚偏二氟乙烯膜DBM膜：重氮苄氧甲基膜1带手套切2张NC膜和12张的滤纸。2

在一托盘中注入500ml左右的转膜缓冲液，放入2张膜，4块海绵和12张滤纸及转膜所用模具。3

在模具的黑色板（负极）上先铺一块海绵，接着依次放3张浸湿的滤纸，对齐后，用玻璃棒赶净气泡（很关键）。4

在滤纸上放凝胶，放的时候可加一点缓冲液在凝胶上。

5.放好胶后，放NC膜。注：NC膜一旦放到胶上就不宜再作移动，因为这时已有蛋白结合到膜上。然后，在膜上加一点缓冲液，用玻璃棒尽量使之铺平6

在膜上依次放好三张滤纸和海绵后，即可夹好转膜模具。注：每层间都要注意赶气泡7

黑对黑，白对红在电泳槽中放好模具。冷却管一端接上水龙头，出水口放在水槽中，以防转膜过程中温度过高，影响转膜效率。（也可冰浴）8

转膜缓冲液注满电泳槽后。红对红，黑对黑接好转膜装置（及电泳装置）。设置电泳参数：140mA，1~2h（根据目的蛋白大小而定）胶负膜正Westernblot示意图丽春红染色1.转膜结束后，取下转膜装置，打开夹板，小心用镊子取出NC膜(在膜右上角剪一缺口，以区分正反面），蛋白面朝上置于10ml1×的丽春红染液中，摇床上染色10min左右

2.蛋白面朝上，用TBST洗膜3-4次，至红色基本褪去后，拍照。

3.再用TBST液洗膜至红色完全褪去注意事项戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转移

滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致

以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜5min

方向正确：凝胶在负极，膜在正极排去滤纸、胶和膜间的气泡电转时间：140mA1-2h,转移结束后，膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置封闭1.取出两块膜，用滤纸将残留液体吸净后，将两块膜的蛋白面相对放入封闭液（5%BSA或5%脱脂奶粉用TBST配制）2.

RT（室温），1-2hours（摇床）或4℃过夜抗体孵育1把膜从冰箱中取出，RT，30min。注：封闭液可回收2.膜放入杂交袋，加1:800倍稀释(根据抗体的灵敏度而定）的抗体（HRP标记的羊抗人IgG抗体），排出气泡，密封袋口。3.蛋白面朝上，RT下孵育1h4.摇床上漂洗TBST10min×3（也可5min×6)显色漂洗后，放在一培养皿中，按滤膜面积加入0.1ml/cm2的底物溶液观察反应，一旦蛋白带颜色达到要求（约2min)，即取出NC膜，移到盛有TBST的培养皿中。记录条带位置，拍摄NC膜照片，留作实验记录一抗孵育1把膜从冰箱中取出，RT，30min。注：封闭液可回收2.膜放入杂交袋，加1:100—1:2000(根据抗体的灵敏度而定）的一抗200ul，排出气泡。3.蛋白面朝上，RT下孵育2hours(也可4℃过夜）4.TBST10min×3（也可5min×6)二抗孵育1.二抗孵育方法同一抗，加入二抗浓度一般为1:30001:10000(注意区分兔抗、鼠抗、羊抗）2.4℃孵育1~2h，（二抗孵育时间不可过长，否则背景很深