（正式版）DB51∕T 1474-2012 《动物狂犬病防制技术规范》

动物狂犬病防制技术规范2012-12-01实施2012-12-01实施四川省质量技术监督局发布I 本标准附录为规范性附录。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准由四川省动物疫病预防控制中心负责起草。本标准主要起草人：余勇、张东、毛光琼、陈斌、侯巍、阳爱国、郭莉、陈冬、文豪。1本标准规定了动物狂犬病的诊断、监测、疫情报告、疫情处理、预防与控制。本标准适用于四川省省内一切从事饲养、经营动物和生产、经营动物产品，以及从事动物防疫活动的单位和个人。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18635-2002动物防疫基本术语GB/T18639-2002狂犬病诊断技术《中华人民共和国动物防疫法》《中华人民共和国传染病防治法》《重大动物疫情应急条例》3术语和定义下列术语和定义仅适用于本标准。狂犬病(Rabies)狂犬病是由狂犬病病毒引起的急性自然疫源性传染病，所有温血动物均可感染，由于其症状明显，病死率极高，一旦发病，人畜的病死率几乎为100%。我国将其列为二类动物疫病。4诊断4.1流行特点虽然几乎所有的温血动物都对本病易感，但在自然界中主要的易感动物是犬科动物和猫科动物，以及翼手类(蝙蝠)和某些啮齿类动物。发病动物和带毒动物是狂犬病的主要传染源，这些动物的唾液中含有大量病毒。本病主要通过患病动物咬伤、抓伤而感染，动物亦可通过皮肤或粘膜损伤处接触发病或带毒动物的唾液而感染。本病的潜伏期长短差别很大，短者1周，长者可达1年以上，一般为2周～8周。咬伤头面部及伤口严重者潜伏期较短；咬伤下肢及伤口较轻者潜伏期较长。4.2临床特征2本病的临床特征为狂躁不安、意识紊乱，死亡率可达100%。狂犬病一般分为两种类型，即狂暴型前驱期：此期约为1天～2天。病犬精神沉郁，常躲在暗处，不愿和人接近，不听呼唤，强迫牵引兴奋期：此期约2天～4天。病犬高度兴奋，表现狂暴并常攻麻痹期：此期约1天～2天。麻痹期症状急剧发展，下颌下垂，舌脱出口外，流涎显著,不久后躯及四肢麻痹，卧地不起，最后因呼吸中枢麻痹或衰竭而死。整个病程7天～10天。程5天～6天。一般表现为狂暴型，症状与犬相似，但病程较短，出现症状后2天～4天即死亡。在发作时攻击其牛、羊、猪、马等动物发生狂犬病时，多表现为兴奋、性亢奋4.3.1免疫荧光试验或ELISA(见附录A)4.3.2小鼠和细胞培养物感染试验(见附录B)4.3.3反转录-聚合酶链式反应检测(RT-PCR)4.3.4内基氏小体(包涵体)检查(见附录C)4.4.1被发病动物咬伤或符合4.2特征的动物，判定为疑似患病动物。4.4.2具有4.3.3和4.3.4阳性结果之一的，判定为疑似患病动物。4.4.3具有4.3.1和4.3.2阳性结果之一的，判定为患病动物。4.4.4符合4.4.1且具有4.3.3和4.3.4阳性结果之一的，即判定为患病动物。35.1任何单位和个人发现有本病临床症状或检测呈阳性结果的动物，应当立即向当地县级以上动物疫5.2当地县级以上动物疫病预防控制机构、动物卫生监督6.1.1发现有兴奋、狂暴、流涎等具有典型性狂犬病症状的犬只，应立即采取措施予以6.1.2发现有被患狂犬病动物咬伤的动物后，畜主应立即将其隔离观察10天，限制其移6.1.3对经县级以上动物疫病预防控制机构诊断确认的疑似患病动物，当地人民政府应立即组圈养动物，疫点为患病动物所在的养殖场(户);散养动物，疫点为患病动物所在自然村(居民小区);在流通环节，疫点为患病动物所在的有关经营、暂时饲养或存放场所。疫点边缘向外延伸3公里所在区域。疫区划分时注意考虑当地的饲养环境和天然屏障(如河流、山脉等)。疫区边缘向外延伸5公里所在区域。4对未免疫犬、猫进行免疫，构建免疫带；停止所有犬、猫交易。发生疫情后，动物防疫监督机构应及时组织流行病学调查和疫源追踪；每天对疫点内的易感动物进行临床观察；对疫点内患病动物接触的易感动物进行一次抽样检测。所有患病动物被捕杀并做无害化处理后，对疫点内所有易感动物连续检测、观察30天以上，没有新发病例；疫情监测为阴性；按规定对疫点、疫区进行了终末消毒。符合以上条件，由县级以上兽医部门检查合格后，由原划定机关撤销疫点、疫区和受威胁区。动物防疫监督机构要继续对该地区进行定期疫情监测。7.1免疫接种7.1.1城市犬免疫密度应达到95%以上，农村犬免密度应达到85%以上。对幼犬按照疫苗使用说明书要求及时进行程序化免疫，以后所有的犬每年加强免疫一次。7.1.2所有的免疫犬和其他免疫动物要按规定佩带免疫标识，当地村级动物防疫机构要建立免疫档案。每年对老疫区和其他重点区域的犬进行1次～2次监测。采集犬的新鲜唾液，用RT-PCR方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)(见附录D)进行检测。检测结果为阳性时，再将脑组织送省动物预防控制中心实验室进行复核确诊(见4.3)。在运输、出售或出境时，犬、猫的畜主应向有管辖权的县级动物卫生监督机构申报检疫，动物卫生监督机构对检疫合格的犬、猫出具动物检疫合格证明；在运输、出售犬、猫时，犬、猫应具有狂犬病的免疫标识，畜主必须持有检疫合格证明。犬、猫应从非疫区引进。引进后，应至少隔离观察30天，隔离期间发现异常时，要及时向当地乡镇畜牧兽医站或县级动物卫生监督机构报告。养犬场要建立定期免疫、消毒、隔离等防疫制度；养犬、养猫户要注意做好圈舍的清洁卫生、并定期进行消毒，按规定及时进行狂犬病免疫。5(规范性附录)器材：荧光显微镜，恒温箱，载玻片(片厚2mm以下),盖玻片，冰冻切片机。试剂：异硫氰酸荧光黄(FITC)标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病荧光抗体)和未标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病未标记抗体)。使用时，用0.02%伊文思蓝(Evansblue)染色液稀释成2～4个染色单位。例如，荧光抗体染色效价为1:64,则作1:32～1:8稀释后使用。丙酮(分析纯)使用前置普通冰箱内预冷至4℃左右。0.01mol/LPH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)。A.1.2.2不能立即送检者，应加10%福尔马林溶液固定，或加50%甘油生理盐水4℃保存送检。A.1.2.3不能就地取脑时，小动物可送检接种了被检病料的细胞培养物(如神经母细胞瘤细胞),继续在二氧化碳恒温箱中培养48h,随后直接取此长满细胞单层的盖玻片作为标本片。然后按1.3.1.3风干、固定和保存。67器，普通离心机及离心管，0.25mL注射器及针头等。B.1.2试剂：0.5%水解乳蛋白汉克氏(Hanks)液，伊格尔氏(Eagle)最低要素培养液(EMEM),犊牛血清，20000IU/mL青霉素溶液，20000μg/mL链霉素溶液等。B.2样品的采取和运送液中，低温保存备用。过滤法处理。8可确诊为狂犬病感染者。如果症状不典型，可捕杀取脑，采用内基氏小体检查或免疫荧如果7d后不发病，可将其中2只小鼠放血致死，取脑作成10%(m/V)混悬液，接种健鼠盲目传代；第2性荧光时，可确诊为狂犬病感染者。为缩短检验时间，可在接种后48h抽荧光试验。对既无细胞病变又无特异性荧光反应者，可在盲传2次。第3代经15d观察仍无细9C.1.1器材：胶皮手套、口罩、防护眼镜等个人防护器具、骨锯、骨凿、骨剪、脑刀等动物解剖器具；C.1.2标本保存液10%(体积分数):福尔马林溶液50%(体积分数),甘油生理盐水。C.1.3染色液：塞勒(Seller)氏染色液，曼(Mann)氏染色液，其配制方法见附录F、G。C.3.1对新鲜脑组织，可用外科刀切开，已通过火焰去脂的载玻片在其切面上触压一下制C.3.3在甘油盐水中保存的新鲜病料，应先用生理盐水彻底洗去甘油，方可制片，制片同C.3.1。然后用蒸馏水冲洗，干燥后镜检。C.4.2.1将经过甲醇固定并风干的压印片，或者经过脱蜡、浸水、风干的切片浸入曼氏染色液中浸染。C.4.2.5依次通过无水乙醇和蒸馏水各数秒钟，分别洗去氢氧化钠和乙醇，在浸入微酸性水中1min～2退回至碱性乙醇，再作短时分化。C.4.2.66以蒸馏水水洗后，依次通过95%乙醇和无水乙醇脱水，并经二甲苯透明，最后加香胶封固。C.5显微镜检查及判定内基氏小体嗜酸性，位于神经细胞胞浆中，呈圆形、椭圆形或棱形，直径3μm～20μm,一个细胞内通常含有一个内基氏小体，但也可含有几个。用塞勒氏染色时，内基氏小体呈桃红色，神经细胞为蓝紫色，组织细胞为深蓝色。用曼氏染色时，内基氏小体为鲜红色，神经细胞的胞核为蓝色，胞浆为淡蓝色，红细胞为粉红色。有时，在鲜红色的内基氏小体中还可以见到嗜碱性的蓝色小颗粒。内基氏小体即狂犬病包涵体，为狂犬病所特有。因此一旦检出内基氏小体，即可确诊。但在检查犬脑时，应注意与犬瘟热病毒引起的包涵体相区别。犬瘟热包涵体主要出现于呼吸道、膀胱、胆囊、胆管等器官粘膜上皮细胞的胞浆细胞核内。在脑组织内，见于原浆细胞核一些小胶质细胞的核内，在神经原内很少见到。D.2.1取待检脑组织加样品稀释液研磨制成10%脑组织悬液，或直接取待检脑脊液约0.5mL,用稀释液0μL/孔，将酶标可拆板置湿盒内，37℃温育30min。剩余的阳性病毒对照保存于-20℃备用。D.2.2将浓缩的洗涤液用蒸馏水30倍稀释成工作浓度，取出酶标板，甩干，将洗涤液加满各孔，倾出，甩干，重复以上操作共3次。D.2.3取酶结合物加入各孔(空白对照孔中不加酶结合物),100μL/孔或2滴，置湿盒内，37℃温育3D.2.5将显色液A/B各一滴加入各孔中，置湿盒内至阳性对照显蓝色。将终止液加入各孔，50μL/孔或一滴，终止反应。置酶标仪上读数。上测定450nm处各孔吸光(A)值大于或等于阴性对照A平均值+0.08,即30D阴性对照+0.08,则表明该样品为狂犬病抗原阳性。E.1.1可用于狂犬病患者诊断的标本：唾液、泪液、尿液、鼻咽洗液、后颈带毛皮囊的皮肤组织或脑对引物：N1(+):(587)5’-TTTGAGACTGCTs、72℃60s,共扩增30个~35个循环；最后72℃延伸10min。(规范性附录)母液I:美蓝饱和溶液母液Ⅱ:复红饱和溶液母液Ⅲ:无水甲醇(分析纯)使用液：取母液I15mL与母液Ⅲ25mL混合，再加入母液Ⅱ2mL～4mL,充分混合，装入褐(规范性附录)H.1从事狂犬病可疑动物解剖