（正式版）DB51∕T 1539-2012 《油菜根肿病菌土壤带菌PCR检测技术规程》

DB51DB51/T1539—2012油菜根肿病菌土壤带菌PCR检测技术规程2012-12-20发布2013-03-03实施四川省质量技术监督局发布I 1范围 12规范性引用文件 13原理 14试剂及材料 15仪器和设备 26田间土壤取样 27实验室检测 28结果及判断 39废弃物处理 3附录A(资料性附录)油菜根肿病基本信息 4Ⅱ本标准附录A为资料性附录。本标准按照GB/T1.1—2000规则进行编写。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：刘勇、黄小琴、张蕾、尹全、刘红雨、周西全、杨晓蓉。1本标准适用于油菜根肿病菌的土壤带菌检测。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682-1992分析实验室用菌属原生动物界、根肿菌门根肿菌纲根肿菌(Plasmodiophora),主要侵染十字花科作物，通过农事操作、种苗带菌、灌溉等多种方式进行传播。病原菌以休眠孢子(囊)随病残体在土壤中越冬，在土中能除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1—-三氯甲烷(CHCl₃)。—-无水乙醇(C₂H₆0)。——分子量标记：DL-1000。2-电泳缓冲液TAE:242gTris,57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加蒸馏水P1:5'-AATCGCCCTGGGTATGP2:5'-AGTTCGCTGCGTTCTT—阳性对照和阴性对照：以根肿病发病植株根部休眠孢子(囊)DNA提取液为阳性对-不锈钢土壤取样器。微型离心机。微量分光光度计。-聚合酶链式反应仪(PCR仪)。-核酸电泳仪。——冷冻干燥器。凝胶成像系统。品采用“S”形采集法，用不锈钢土壤取样器采集0～15cm耕层土壤，每个土样由15个样点组成，等量混合后采用四分法采取1kg土样装入干净塑料自封袋。一个土样用一个土壤取样器或用75%酒精消毒土壤取样器后再使用。土壤取样点分布范围根据种植面积大小确定(表1)。表1油莱根肿病田间土壤带菌检测取样标准种植面积(m²)以田块为单位进行土壤取样液，10000r/min离心3min,弃上清液，重复操作2次。在装有土壤的2mL离心管中加入0.2g灭菌玻37℃水浴30min,上下颠倒离心管数次，水浴结束后加入0.5mLSDS缓冲上下颠倒离心管数次，10000r/min离心5min,收集上清液。按上述方法再把残渣抽提1次。在上清液3中加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24:1,V/V),颠倒混匀放置10min,10000r/min离心5min,收集在电泳缓冲液中加入2%琼脂糖，加热融化后冷却至55℃左右加入5μLDNA荧光胶，凝固后进行电泳。5μLPCR扩增产物阳性对照经PCR扩增反应后出现498bp大小条带，而阴性对照和空白对照不出现任何条带，试验结4(资料性附录)A.1病原及其分类地位根肿病菌的休眠孢子囊在寄主根部薄壁组织细胞内形成，球形或扁圆形、单胞、无色或略带灰色，结构穿透寄主细胞壁，将原生质注入寄主细胞内，发育成原质团。A.3