（正式版）DB51∕T 1546-2012 《植物检疫实验室常规检验技术 真菌》

DB51DB51/T1546—2012植物检疫实验室常规检验技术真菌2012-12-20发布2013-03-01实施四川省质量技术监督局发布I 2规范性引用文件 13术语和定义 14原理 25试剂与材料 6仪器与用具 27取样及送样要求 28检测方法 9结果判定 3附录A(资料性附录)真菌病害主要症状特征 附录B(资料性附录)真菌病害显微镜检查 6附录C(资料性附录)真菌病害染色检验 附录D(资料性附录)真菌病害分离培养检验 8Ⅱ本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则进行编写。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局发布。本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。本标准主要起草人：宁红、李小松、刘可、赵兰鸰、帅波、黄玲、熊玉兰、杨重渝、袁曦。植物检疫实验室常规检验技术真菌本标准规定了植物检疫实验室真菌的检验程序和检验技术。2规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。3.1病原真菌plantpathogenicfungi能够寄生于植物并引起植物出现病理过程的一类真菌。植株受病原菌侵染后，内部生理活动和外观上的生长发育呈现出某种异常状态。病原菌在植物受害部位产生的结构特征。真菌的典型营养体，通常呈丝状，单根的叫菌丝，菌丝的集合体叫菌丝体。真菌产生孢子的结构，如子囊果、担子果、分生孢子器、分生孢子盘、子座等，统称为子实体。真菌不经过性细胞或性器官的结合而从营养体上直接形成繁殖体，主要2如发现一种不熟悉的或新的病害时，应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定。对具有典型症状的真菌病害，可根据特有的症状和镜检观察菌丝及孢子形态进行鉴定；对症状不行鉴定；对通过分离培养仍不能确定病原菌的病害，需按照柯赫氏法则进行鉴定。—乳酚油(苯酚结晶20mL,乳酸20mL,甘油40mL,蒸馏水20mL)——酒精(70%、95%)——龙胆紫(0.04%)-甘油乳酸(乳酸10mL,甘油20mL,蒸馏水10mL)——酒精冰醋酸混合液(95%酒精20mL,冰醋酸20mL)——苯胺蓝水溶液(苯胺蓝0.1g,蒸馏水100mL)—水合氯醛水溶液(水合氯醛5g,蒸馏水2mL)——升汞水溶液(升汞1g,浓盐酸2.5mL,蒸馏水1000mL)---福尔马林醋酸酒精固定液(FAA)(95%酒精20mL,福尔马林5mL,冰醋酸5mL,蒸馏—-培养基(见附录D)显微镜、扩大镜、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、培养皿、三角瓶、载玻片(盖玻片)、7.1取样要求调运检疫样品按照GB15569-2009附录D和E相关规定进行取样，产地检疫样品按照各种检疫性有害生物相应产地检疫技术规程规定的取样标准进行取样。7.2送样要求在调运检疫和产地检疫过程中，采集具有可疑症状的叶片、枝条或果实等新鲜材料，用纸袋包装，3观察样品有无异样，初步判断是否具有真菌病害的表现特征(见附录A),持扩大镜观察感病植株切取的培养物放在玻棒上，置于25℃~28℃恒温箱中培养一定时间，待培养物长出菌丝或子实体进行镜检鉴定。见附录D。8.6柯赫氏法则鉴定将分离得到的纯培养物制成孢子(或菌丝)悬浮液，通过喷雾、涂抹或针刺的方法将病原菌接种到相同品种的健株上，保湿约24h～48h,诱发寄主发病。然后再从接种发病的植株上再次分离得到其纯9.2根据染色检验、保湿培养或分离培养，镜检观察病原菌的形态学特征，符合某种病害的病原菌特9.3采用柯赫氏法则判定，如寄主在接种后产生与原发病害一致的典型症状，并能从典型症状上再次分离到与接种物性状一致的病原菌，根据病原菌形态学特征，可判定为该类病害。4(资料性附录)真菌病害主要症状特征真菌病害症状类型繁多，出现在植物的各个部位，在受害部位是否出现真菌的繁殖器官是诊断的主要依据，常见症状特征如下：A.1白粉类花、果、叶及嫩枝上覆盖白色粉状物，后期在白粉物上出现散生状针头大的颗粒，颗粒由白变黄，最后变黑。A.2煤污叶、枝、果实表面覆盖一层煤烟状物，用手容易擦掉，这种病害的发生通常与蚜虫和木虱等相关。A.3锈粉叶、果、枝、干上出现疣状、条状、毛状或毡状突起，后期常破裂，散出淡黄色、桔黄色、锈褐色或黑色粉状物。A.4霜霉为害叶、果、嫩枝，以叶片最为明显，在叶片背面形成灰白色霜状物，霜状或稀或密，叶片正面呈现黄色，无明显边缘。为害靠近土面的叶、茎、根，环境潮湿时产生白色绢丝状菌丝，干燥时菌丝易消失，后期产生油菜籽大小的菌核，菌核初期乳白色逐渐变黄变褐。A.6斑点花、果、叶上局部组织感病死亡后出现的症状。形状有角斑、圆斑、条斑、不规则斑，颜色有灰色、褐色、红色等，有的病斑边缘和中间颜色一致，有的不一致，病斑大小不一，病斑后期出现霉层、黑点。A.7炭疽与斑点相似，但颜色常是黑褐色，病斑上有轮生状排列的小黑点，潮湿时黑点出现粉红色胶状黏液，炭疽病也出现在果实，茎干和芽上。A.8畸形植物受害部位变大或缩小，生长不匀，失去原来形状，后期在受害部位出现病征。A.9溃疡发生在枝干皮层，病斑形状有圆形、近圆形、长形，通常病斑周围稍隆起，中间组织死亡，下陷，干裂，后期常产生小黑点或盘状物。A.10腐朽5发生在乔灌木的枝干或根部木质部，使木质部变质、变色、腐朽，树干内因木质部腐朽出现空洞，受害部位表面后期往往出现大型真菌繁殖体，如木耳、蘑菇或马蹄状等各种形状繁殖体。A.11腐烂分为湿腐和干腐。多汁部位破坏解体后产生湿腐或软腐症状；含水量低的植物组织软硬部位病死后产生的组织死亡称为干腐，在枝干上常与溃疡相似。A.12猝倒和立枯大多出现在播种育苗的苗木上。小幼苗根茎部发生腐烂使植物猝然倒伏，由于发生过程迅速，地上部分仍维持正常状态，称为猝倒；若幼苗根茎已木质化，茎部腐烂后不倒伏，地上叶子干枯，称为立枯。6(资料性附录)真菌病害显微镜检查用移植针挑取少许标本或培养上的菌丝体或子实体，放在加有一滴浮载剂显微镜下检视，常用浮载剂有蒸馏水、乳酚油和甘油乳酸等。检查叶片表面的真菌(如白粉菌、锈菌或其它霉菌等),采用粘贴检视的方法。将小段透明胶带粘贴在有真菌生长部位的叶面上，将胶带取下放在载玻片上的一滴甘油乳酸中，上面再加一滴甘油乳酸，加盖玻片进行检视。将小块病组织放在等量的酒精冰醋酸混合液中固定24h,再浸在饱和的水合氯醛水溶液中，待组织透明后取出用水洗净，经稀苯胺蓝水溶液染色，用甘油乳酸作浮载剂镜检。选择软硬适中的植物器官或组织为材料，直接切成长约2cm～35mm²。对于柔嫩的器官组织(如幼叶),可夹在通草、木髓和胡萝卜中进行切片。切片前先准备好一个材料和刀片的湿润。7(资料性附录)真菌病害染色检验挑取少量菌丝置于载玻片上，用加有0.1%苯胺蓝的乳酚油作浮载剂，将载玻片微微加热，盖上盖玻片，显微镜观察真菌孢子或菌丝隔膜。如果染色太深，可用未加染料的乳酚油褪色。8(资料性附录)葡萄糖(或蔗糖)10g燕麦片30gD.1.2制备方法在1000mL沸水中，加琼胶熔化后根据需要分装灭菌保存。将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000mL,然后加糖和琼胶，加热使琼胶完全熔化后，趁热用纱布过滤，根据需要分装三角瓶或试管灭菌保存。将燕麦片加水1000mL,在沸水浴上加热1h,纱布过滤后加水补足1000mL,加琼胶熔化后根据需D.2分离培养检测法打开超净工作台通风20min以上，用70%酒精擦拭手、台面和工作台出风口进行消毒，分离培养所需的用具用95%酒精擦拭后用火焰灼烧灭菌。9——从病健交界处切取边长约5mm的小块病组织备用。小材料可参照D.2.2.1,大材料可参照D.2.2.2。多肉的根、茎和果实等可参照D.2.2.2。将培养基加热融化，取出摇匀，在超净工作台上经无菌操作将培养基倒入已灭菌的培养皿中，厚度2mm～3mm,摇匀，静置冷却。可在10mL培养基中加入3滴25%乳酸，或加入40ug/mL链霉素防将分离的材料置于已灭菌的培养皿内，先在70%酒精中浸2s～3s,再放入0.1%升汞溶液处理30s~10min(根据材料大小、坚实程度不同有所差异),再用灭菌水清洗3～4次，用灭菌滤纸吸干材料上的此方法适用于产生大量孢子的病原菌。将寄主组织受害部分的孢子洗下配