DB22-T 3366-2022 牛中华泰勒虫病检测 PCR法

ICS11.220CCSB41DB22DB22/T3366—2022牛中华泰勒虫病检测PCR法PCRdetectionoftheileriasinensisinbovine2022-05-18发布2022-06-08实施吉林省市场监督管理厅发布IDB22/T3366—2022本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本文件起草单位：延边大学、吉林省牧业信息中心、吉林省畜牧总站、长春市中小企业人才创业指导中心、延边朝鲜族自治州动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。本文件主要起草人：贾立军、柴方红、王欣睿、王全利、陈健、王海军、梁晚枫、薛书江、陆秀娟、DB22/T3366—20221牛中华泰勒虫病检测PCR法本文件规定了牛中华泰勒虫病PCR检测方法的试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、结果判定和废弃物处理。本文件适用于牛中华泰勒虫核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1中华泰勒虫病theileriasinensis中华泰勒虫(Theileriasinensis)寄生于牛的红细胞和白细胞中，以发热、贫血、黄疸及体表淋巴结肿大为典型症状的一种蜱传播性血液原虫病。4试剂或材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1试剂或材料4.1.1血液DNA提取试剂盒。4.1.2dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。4.1.3TaqDNA聚合酶。4.1.4DNAMarker分子量标准。4.1.550×TAE缓冲液见附录A.1。4.1.6加样缓冲液见附录A.2。4.1.710mg/mL溴化乙锭见附录A.3。4.1.81%琼脂凝胶见附录A.4。4.1.9阳性对照见附录A.5。2DB22/T3366—20224.1.10阴性对照见附录A.6。4.1.11质粒DNA制备见附录B。4.1.12DNA凝胶回收试剂盒。4.1.13质粒DNA提取试剂盒。PCR反应引物序列与浓度见表1。表1PCR反应引物序列与浓度5仪器设备5.1PCR扩增仪，温度范围：4℃~100℃。5.2低温高速离心机，12000r/min以上。5.3高压灭菌器，120℃以上。5.4恒温水浴锅，室温～100℃。5.5分析天平，感量0.1mg。5.6水平电泳槽。5.7电泳仪，电压1V～300V；电流1mA～400mA。5.8凝胶成像系统。5.9微量移液器，单道2μL、10μL、20μL、100μL和200μL。6样品6.1采集按照NY/T541规定采集牛抗凝全血，编号待处理。6.2处理牛抗凝全血2000r/min离心5min，取沉淀待检。7试验步骤7.1模板制备按血液基因组DNA提取试剂盒(4.1.1)操作说明书或等效方法提取模板DNA。7.2PCR反应7.2.1反应体系DB22/T3366—20223PCR反应体系见表2。表2PCR检测反应体系7.2.2质量控制在试样PCR反应的同时，以无菌双蒸水作为空白对照，并设置阴性对照和阳性对照，各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与7.2.1相同。7.2.3反应条件延伸7min，4℃保存。将所有样品、阳性对照、阴性对照和空白对照的PCR产物按编号加入到1%琼脂糖凝胶板的各孔中，将凝胶的边孔中加入DNAMarker分子量标准（4.1.4将凝胶在150V恒定电压下电泳30min后，凝胶成像系统观察电泳结果。8结果判定8.1试验成立条件空白对照、阴性对照无扩增条带，阳性对照出现887bp的特异性条带，试验成立，否则应重新检测。标准对照和扩增序列见附录C。8.2试验结果判定若被检样品出现887bp的特异性条带，判为牛中华泰勒虫核酸阳性。若被检样品未出现扩增条带，判为牛中华泰勒虫核酸阴性。9废弃物处理试验过程中产生的废弃物，按GB19489规定处理。DB22/T3366—20224聚合酶链式反应（PCR）试验常用试剂配制A.10×TAE缓冲液A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTApH8.0）的配制见表A.1。表A.10.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTApH8.0）A.1.2TAE缓冲液（50×)的配制见表A.2。表A.2TAE缓冲液（50×)配制）（A.2加样缓冲液加样缓冲液的配制见表A.3。表A.3加样缓冲液0.5mol/LpH6.8的三羟甲基氨基甲烷A.310mg/mL溴化乙锭10mg/mL溴化乙锭的的配制见表A.4。DB22/T3366—20225表A.410mg/mL溴化乙锭A.41%琼脂糖凝胶将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出置室温冷却到50℃左右，加入10mg/mL溴化乙锭10μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后，4℃备用。1%琼脂糖凝胶的制备见表A.5。表A.51%琼脂糖凝胶的制备A.5阳性对照以含有中华泰勒虫887bp目的基因的质粒DNA作为标准阳性对照。A.6阴性对照以未感染中华泰勒虫牛血液提取的DNA作为标准阴性对照。DB22/T3366—20226质粒DNA制备质粒DNA制备：a)按血液基因组DNA提取试剂盒(4.1.1)操作说明书提取中华泰勒虫感染的牛血液基因组DNA；b)应用牛中华泰勒虫MPSP基因序列（KX375400.1）引物（4.2按PCR反应（7.2）扩增887bpc)应用DNA凝胶回收试剂盒（4.1.12）回收PCR扩增产物；e)将10μL连接产物加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰水浴30min，42℃热刺激70s，冰浴冷刺激2min，加入200μL无抗性LB液体培养基，于37℃振荡培养箱中培养2h后，涂布于含有Amp抗性的LB固体培养基平板上，37℃培养12h；f)挑取LB固体培养基平板上的单个菌落，加入到含有Amp抗性的LB液体培养基中扩大培养，按质粒DNA提取试剂盒（4.1.13）操作说明书提取质粒DNA；g)将提取的质粒DNA进行PCR鉴定和双酶切鉴定后，进行测序分析；h)将鉴定正确的含有887bp目的基因的质粒DNA置于-20℃保存备用。DB22/T3366—20227标准对照标准对照见图C.1。M:DL2000DNAMarker；1:标准阳性对照；2:标准阴性对照。图C.1牛中华泰勒虫PCR扩增标准阳性、阴性对照阳性对照序列见图C.2。cactgctatgttgtccaagagatattttaacgcactttgcttaggctatttcctcatcttctcagcccatgcagctgaagaagccaagaaagacggtgataagaaggatgataagaaggaaggtgataagaaggacttgactcttgaggtcactgccacatccgccgagaatgttacagtcaactccaccaatgcccttgatgttgtcttcaccgccgctgaaggcttccgcttcaagacccttaaggttggtgacaaaacattgtataccgtcgacacttccaaattcactcctactgttgcccacagactgaagcatggtgatgaccttttcttcaagctcaatctccacaacgccaagccacttttgttcaaaaagaagagtgacaaggaatgggttcagttcaactacgccacctacttggatgacgtcctttggaaggagaagaaggagaccaaggacctcgacgcttccaaattcgctgaggccaccctcttcaagagagaccccttcggctctggctacgtctacgacttcgtcggtaacttcaaggtcaagaaggttaccttcgagaacaaggacgttggcaagcatgacaagtgcaaatacaccgctgttaaagtgtacgtcggtgctgacaacaacaagattgtgagacttgactacttctacaccggcgatgagagattcaaggaggtttact