骨靶向外泌体药物递送系统治疗骨质疏松的研究进展总结2026

骨靶向外泌体药物递送系统治疗骨质疏松的研究进展总结2026

骨质疏松症是一种以破骨细胞活性增高、成骨细胞活性降低为特征的代谢性骨病，导致骨微结构恶化。现有的骨质疏松症治疗药物依照机制分类可分为：骨骼健康基础用药、抑制骨吸收药物、促骨形成药物以及其他机制类药物。主治疗骨质疏松的药物绝大多数为骨吸收抑制剂（如雌激素、双膦酸盐、降钙素等），而骨形成促进剂（如甲状旁腺激素等）的种类却非常少。然而以上药物只能起到缓解和减缓疾病进展的作用，并没有达到逆转病情甚至治愈的效果，因此亟需想办法解决这一问题。

外泌体是来源于人体细胞的天然细胞载体，因其在体内具有良好的耐受性、重复给药而不会失去传递效果[1]、对受体细胞靶向选择、与核酸分子有更好的亲和性[2]、低生物毒性和高穿透屏障能力[3]等优点受到广泛关注，在药物传递方面具有引人入胜的潜力。外泌体用于药物传递的有趣潜力已经受到了广泛关注。探索外泌体参与调节骨细胞代谢，并将其作为骨靶向载体促进骨再生，可为骨质疏松症的治疗提供新思路。1外泌体的生物学特征

外泌体是直径为40～100nm的单膜分泌细胞器，其拓扑结构与细胞相同，见图1。外泌体是纳米级脂质包裹体结构，内含脂质、蛋白质、核酸等代谢物，存在于各种液体中，例如血液、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水、脑脊液、胆汁和精液[4]。脂质富含鞘糖脂（GSL）、鞘磷脂（SM）、胆固醇（CHOL）和磷脂酰丝氨酸（PS），外层的长链SM和内层PS物种之间存在相互交叉，在胆固醇的作用下发挥着巨大的作用力，可以通过配体-受体相互作用，胞饮、吞噬或膜融合等过程将信号传递至其他细胞和组织[5-7]。核酸包括许多蛋白质，特别参与膜运输和融合的蛋白质。值得注意的是四倍半蛋白（如CD63、CD9和CD81）、热休克蛋白（如Hspa8、Hsp90）、GTPases（如EEF1A1、EEF2）和核内体蛋白和标志物（如Alix）[8-10]等。这些蛋白具有靶向细胞、黏附因子、信号转导、膜融合、抗凋亡等多种功能[11]。

外泌体的核酸含量主要由各种类型的DNA（单链DNA、双链DNA、基因组DNA、线粒体DNA等）和RNA（snRNA、miRNAs、tRNAs、YRNA、vaultRNA、重复元件RNA和片段RNA)组合而成。尽管外泌体中特定DNA的选择性测序仍不清楚，但人们认为外泌体介导的DNA分泌参与调节炎症反应，并可能作为肿瘤、病毒感染和耐药性等疾病的有希望的分子标志物。就RNA而言，外泌体主要携带广泛的RNA种类，特别是miRNAs。这些特定的miRNAs在促进细胞间的长期信息交换中起着至关重要的作用，并对成骨产生重大影响[12]。通过外泌体介导的旁分泌信号传导，miRNAs可以通过转移到靶细胞的胞内环境来调节靶细胞中的基因表达和细胞功能[13]。例如，肥大细胞增殖衍生的外泌体将miR-23a和miR-30a转运至促成骨细胞，有效抑制成骨细胞的产生，阻碍骨的形成。类似地，miR-128-3p由骨髓间充质干细胞(BMSCs)衍生的外泌体携带，通过靶向Smad5的3'-UTR区域直接损害骨质疏松性骨折愈合[14-15]。这些实验结果突出了外泌体卓越的靶向能力，并证明了它们作为对抗骨质疏松症的创新型靶向纳米药物的潜力。2外泌体的起源和功能特性

外泌体的表面磷脂成分具有显著的功能特性，使其能够选择性地靶向参与骨再生的细胞。这些小囊泡包裹着与其亲本细胞相似的分子成分，选择产生外泌体的细胞类型对于临床应用至关重要。2.1间充质干细胞来源外泌体

间充质干细胞（MSCs）是一种能够自我复制并分化成各种细胞类型的成体干细胞。自体和异体间充质干细胞一般都能被机体很好地耐受，不会引起明显的免疫反应[16]。间充质干细胞分泌的外泌体（MSC-Exos）在减少缺血/再灌注损伤模型的梗死面积方面显示出良好的潜力[17]。例如，在小鼠研究中，用间叶干细胞外泌体对小鼠进行预处理后，瘢痕减少了45%，氧化应激减少，抗炎作用增强，受伤组织的代谢恢复得到改善[18]。2.1.1骨髓间充质干细胞：骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化成骨细胞和脂肪细胞，是成骨细胞主要分化来源。随着年龄的增加，BMSCs偏向于脂肪细胞分化，这种转变使成骨细胞分泌减少，骨形成受损[19]。来自BMSCs的外泌体已被发现通过参与免疫调节和促血管生成特性的机制促进骨再生。例如，在肌腱袖重建后肌腱-骨愈合的背景下，BMSC-Exos证明可以抑制M1巨噬细胞的极化，减少促炎因子的分泌，并通过促进VEGFR的磷酸化，促进人脐静脉内皮细胞的增殖，迁移和血管生成管的形成，促进骨生成[20]。2.1.2脂肪间充质干细胞：脂肪间充质干细胞(ADSCs)由于其快速增殖、低免疫原性和高稳定性，被认为是生产外泌体的理想细胞来源。ADSCs衍生的外泌体（ADSCs-Exos）显示出可通过优化成纤维细胞特性来加速皮肤伤口愈合的潜力[21]。ADSC-Exos含有调控各种参与成骨过程的信号通路的microRNAs。在用TNF-α预处理ADSC条件培养物的情况下，研究发现ADSC-Exos可通过提高Wnt-3a水平和抑制Wnt信号通路来抑制人成骨细胞的成骨基因表达[22]。ADSCs-Exos中的miRNA通过调节MAPK、Wnt、TGF-β、SIRT7和β-catenin等信号通路参与成骨。经TNF-α预处理后，ADSC-Exo中Wnt-3a含量增加，抑制了Wnt信号通路，降低了TNF-α预处理的ADSC条件培养基培养的HOB的成骨基因表达水平[23]。人脂肪来源干细胞的成骨分化也可通过慢病毒转染来控制[24]。2.1.3脐带间充质干细胞：人脐带间充质干细胞（hucMSCs)来源于产后废弃组织，因而无伦理道德争议，来源易得，分离方法简单、产量高、增殖快，易于大规模生产，期待取代其他间充质干细胞实现骨损伤治疗。当将hucMSC-Exos掺入透明质酸水凝胶和定制的纳米羟基磷灰石/聚ε-己内酯支架中时，可显著促进大鼠的颅骨再生[25]。体外实验表明，hucMSC-Exos通过上调NOTCH1/DLL4通路促进内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)的增殖、迁移和血管生成分化，miR-21作为传递介质[26]。2.2成骨细胞来源外泌体

成骨细胞主要由骨髓间充质干细胞分化而来，经历增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段调控骨重塑的复杂过程。在增殖期，成骨细胞迅速繁衍，形成多层细胞，随羟基磷灰石的沉积完成矿化[27]。矿化成骨细胞(MOB)分泌的外泌体miRNA通过上调Runt相关转录因子2(RUNX2)和碱性磷酸酶促进成骨的分化[28]。成熟的成骨细胞位于骨表面，承担着合成骨基质的重要功能。UAMS-32P成骨细胞系释放的外泌体携带RANKL蛋白，该蛋白可通过受体配体(RANKL-RANK)转移到破骨细胞前体。这种转移刺激RANKL-RANK信号激活NK-κB通路，促进破骨细胞的形成[29]。外泌体是成骨细胞和破骨细胞之间进行信息交流的渠道，有望成为骨质疏松症患者的新型治疗靶点。成骨细胞来源的外泌体表现出显著升高的miRNAs表达，通过各种信号通路如Wnt、胰岛素、TGF-β和钙信号通路促进成骨细胞分化[30-31]。2.3破骨细胞来源外泌体

破骨细胞是单核细胞/巨噬细胞系在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体受体激活剂(RANKL)的影响下产生的大型多核细胞。在骨重建的动态过程中，对维持骨形成和骨吸收之间的微妙平衡起着至关重要的作用。信号受体RANK作为RANKL的中介，在成骨细胞和破骨细胞之间建立了相互调节关系。破骨细胞分泌富集microRNA的外泌体，特别是源自miR-214的外泌体，对成骨有显著影响。研究发现，这些特殊的外泌体可诱导成骨细胞祖细胞分化，在体外抑制成骨细胞活性，并通过抑制Runx2和促进YAP1介导的MT1DP，在体内减少骨形成[32]。2.4巨噬细胞来源外泌体

巨噬细胞来源于单核细胞，在体内经历复杂的激活过程，涉及多种细胞及其通路调控，通常分为M1经典极化及M2交替极化。在骨质疏松的背景下，在骨重塑的动态过程中，巨噬细胞的极化状态在调节骨形成和骨吸收之间的微妙平衡中起着至关重要的作用。巨噬细胞极化过程中释放的炎症因子破坏RANK-RANKL-OPG轴，影响破骨细胞发生，抑制成骨细胞分化，从而影响骨质疏松的发生。巨噬细胞的极化状态是动态的，可以根据内环境中细胞因子不同在两组极化状态之间切换，调节内环境中的细胞因子环境代表了针对OP中巨噬细胞极化的潜在策略。

从小鼠骨髓分离的M2型巨噬细胞富集miR-5106，含有miR-5106的M2D-Exo已显示出通过抑制成骨相关基因SIK2和SIK3的表达来增强骨髓间充质干细胞成骨分化的能力。此外，在动物模型中[33]，它已被证明可以加速骨折愈合。另一项研究显示，骨髓源性巨噬细胞(BMM)中的miR-128水平依赖于破骨细胞分化活性，敲低miR-128导致破骨细胞形成减少[34]。

初步实验表明，受BMP-2刺激的巨噬细胞(BMP-2/Mφ)分泌的外泌体显著提高了成骨相关基因如骨钙素(ALP)、成骨细胞素(Oncorin)和Runx2的表达水平。这些外泌体通过与TNF-α信号通路的结合，诱导人骨髓间充质干细胞中BMP-2和BMP-7等基因的表达[35]。此外，纳米管包裹的外泌体已被发现诱导骨髓间充质干细胞自噬，影响骨重塑过程。3外泌体对骨代谢的影响及应用3.1生物性诊断标志物

在病理性细胞损伤期间，细胞会释放包括外泌体在内的大量成分[36]。这些外泌体携带蛋白质和核酸，提供有关细胞状态的信息，使其成为各种疾病有价值的诊断标志物[37]。

Chen等[38]的研究利用定量蛋白质组学鉴定了与骨质疏松密切相关的4种外泌体蛋白：PSMB9、PCBP2、VSIR和AARS。这些蛋白在骨质疏松分类中显示出0.805的高曲线下面积(AUC)值，为骨质疏松和骨代谢性疾病的新外泌体相关机制提供了线索。此外，Huo等[39]的一项研究显示，骨质疏松症和骨量减少的个体血清外泌体中17种蛋白的表达发生了显著变化。这些蛋白分别是整合素β3、整合素α2β1、Talin1和Gelsolin在血清外泌体中表现出腐烂期间的人类骨量。这项研究有可能识别骨质疏松症的分子标记，并有助于更好地了解其发病机制。

由于磷脂分子层保护外泌体的RNA，不会被RNase分解，可以在血液中稳定检测到，可成为一种完美的诊断性生物标志物。在众多外泌体载体中，miRNAs作为关键调控分子，对肿瘤血管生成、细胞增殖、迁移等具有重要的调控功能。对其对原位或远程受体细胞的调控功能进行了进一步的探索。对骨肉瘤患者血浆外泌体的分析发现了上调的miRNAs(miR-92a-3p、miR-130a-3p、miR-195-3p、miR-335-5p和let-7i-3p)，它们具有作为骨肉瘤的生物标志物的潜力[40]。3.2骨代谢的调节

外泌体通过其携带的蛋白质和核酸在调节受体功能和细胞通讯方面发挥着重要作用。在骨质疏松症中，来自不同类型细胞的外泌体被认为参与了骨重塑过程的调节。例如，BMSCs分泌的外泌体表达CD63、CD81和CD9等四跨蛋白，可促进BMSC向骨生成、脂肪生成和软骨生成方向分化[41-44]。

Xu等[45]利用qPCR发现，与幼龄大鼠相比，衰老骨髓间充质干细胞衍生的外泌体中mir-31a-5p的表达水平显著升高，证实了外泌体mir-31a-5p可以参与体外破骨细胞功能和骨吸收。来自不同细胞来源的外泌体的mirna可以稳定地从骨微环境转移到骨髓间充质干细胞中，并通过靶向成骨相关基因调控骨髓间充质干细胞。通过检索近年来发表的文献，对具有调节骨髓间充质干细胞成骨分化功能的外泌体来源的miRNAs进行整理总结，见表1。4骨靶向外泌体修饰的骨微环境表征与工程

自然分泌的外泌体中的miRNAs可以通过基因工程和化学修饰技术人工改变来增强或削弱靶细胞的功能。来自内皮细胞的外泌体(EC-Exos)在体内和体外通过传递miR-155特异性地回到骨组织并促进骨质疏松症的恢复[84]。然而，EC-Exos也可以被巨噬细胞内化，并在骨髓巨噬细胞中高表达，从而通过miR-155活化促进骨吸收。本研究证实了天然EC-Exos具有良好的靶向能力，有望成为治疗骨质疏松症的靶向纳米药物。但是，大多数纯化的、未成形的外泌体缺乏强大的骨靶向能力，很容易在相对较短的时间内从体内清除[85]。因此，天然外泌体需要通过修饰来增强骨靶向能力和延长治疗效果[46]。外泌体的靶向转化主要通过细胞外修饰和细胞内修饰两种方式实现。细胞外修饰直接靶向外泌体本身，通常在外泌体分离和提取后进行。骨靶向外泌体的直接细胞外修饰包括点击化学、膜后插入、疏水插入和受体配体结合。另一方面，细胞内修饰技术涉及在分离外泌体之前对产生外泌体的细胞进行修饰，允许对外泌体表面进行轻松操作，并通过各种工程方法为创建骨靶向载体提供灵活性。5骨靶向外泌体的药物转移技术

外泌体具有靶向性和特异性等特点，主要是因为外泌体具有特异性的表面标志物，使其能够与靶细胞特异性结合。该靶向型外泌体在减少非靶器官损伤的同时，提高疗效。因而，外泌体也被认为是理想的药物输送系统。通过将药物包裹在外泌体内，可以增强药物对患处的靶向性和递送性，从而提高疗效并降低毒副作用的风险[86]。药物主要通过主动包载和被动包载进行装载，两种方法所得外泌体中药物的包封率及稳定性都不相同。5.1被动包载

被动包载的方法相对简单，不需要添加额外的活性物质，它主要通过外泌体与药物孵化，药物沿着浓度梯度与外泌体融合或者细胞分泌载药外泌体，但这两种方法的包封率都相对较低，主要应用于小分子和低细胞毒性的化学药物[87]。5.2主动包载

主动包载技术为外泌体中的药物包封提供了一种更可控的方法。主动加载方法主要有4种类型：电穿孔法、挤出法、超声法、反复冻融法。5.2.1电穿孔法：电穿孔法[88]是短暂的电脉冲在悬浮在导电溶液中的外泌体膜质膜上，产生可恢复的微小瞬时孔，允许药物或核酸通过这些微孔扩散进入外泌体内部。例如，用CAP-Green荧光蛋白(GFP)Lamp2b质粒稳定转染树突状细胞，获得cap-外泌体，可特异性整合到软骨细胞中。然后通过电穿孔将荧光cy标记miRNA-14装入CAPexosomes。cap-外泌体通过靶向软骨细胞将miRNA-140传递到深层软骨区域[89]。该法操作简便，广泛应用于包载小干扰RNA(siRNA)或微小核糖核酸(microRNA或miRNA)中，它也有引起RNA沉淀或细胞外囊泡聚集的风险，从而降低药物装载效率。5.2.2挤出法：挤出法[90]是通过外力的作用，将外泌体与药物的混合物装入孔径为100～400nm的多孔膜，脂质挤出机在挤压过程中实现药物包载。采用挤压技术使CXCR4+外泌体与脂质体融合，负载antagomir-188纳米颗粒，诱导成骨分化标志基因的表达，从而抑制脂肪形成和促进骨髓间质干细胞成骨。该法装载药物效率很高，所得到的外泌体可以直径均匀统一，但该法的机械力是否会改变外泌体膜的性质尚不清楚。5.2.3超声法：超声法[91]是将外泌体与小分子或蛋白质药物混合，然后通过均质探头超声破坏外泌体膜的完整性，从而实现药物的包载。在先前的研究中，通过同时包封组织特异性miRNA激活的工程化mRNA，并通过超声靶向微泡破坏提高靶向递送效率，从而减少脱靶效应[92]。超声技术在药物负载、药物缓释等方面有着显著优势，但同时也会引起药物在胞外的积聚，进而对药物的表面结构造成一定的干扰。5.2.4反复冻融法：反复冻融法[93]是先在室温下将药物与外泌体一起孵育一段时间，再在-80℃或液氮条件下迅速冷冻。在缓慢解冻过程中，暴露的脂质会重新融合并包裹周围的药物，而