DB35-T 2015-2021 猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡制备及高敏荧光免疫分析操作规程

ICS11.220CCSB4135DB35/T2015—2021猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡制备及高敏荧光免疫分析操作规程ThepreparationofCSFVantibodyhypersensitivefluorescencedetectionreagentcardandoperatingproceduresforhypersensitivefluorescenceimmunoassay2021-09-28发布福建省市场监督管理局发布IDB35/T2015—2021前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 15仪器与试剂 16猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡制备 2 38判定标准 4附录A（规范性）试剂的配制 5附录B（资料性）猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡装配示意图 6DB35/T2015—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福州海关提出并归口。上海德雨航生物科技有限公司、一品一码检测（福建）有限公司。本文件主要起草人：郑腾、张体银、章键、吴俊清、吴冠英、谢向机、张志灯、唐寰宇、林杰、王武军、庄锴、李宋钰、邱金生。DB35/T2015—20211猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡制备及高敏荧光免疫分析操作规程本文件规定了猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡的制备及高敏荧光免疫分析技术免疫分析操作规程。本文件适用于猪瘟病毒抗体水平的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PVC：聚氯乙烯（Polyvinylchloride）5仪器与试剂5.1仪器5.1.1高敏荧光分析仪。5.1.2移液器（0.5μL～10μL和10μL～100μL）。5.1.3恒温培养箱（20℃~25℃和37℃±1℃)。5.1.4离心机（3000r/min和18000r/min）。5.1.5切条机。5.1.6划膜喷金机。2DB35/T2015—20215.2试剂5.2.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682一级水的要求。5.2.2高敏荧光纳米微球。5.2.3N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。5.2.4猪瘟病毒重组E2蛋白。5.2.51%聚乙烯醇。5.2.6牛血清白蛋白（BSA）。5.2.7鸡卵黄抗体（IgY）。5.2.8山羊抗鸡卵黄抗体/免疫球蛋白G抗体（IgY/IgG抗体）。5.2.9碳二亚胺（EDC）。5.2.10硝酸纤维素膜。5.2.112-N-吗啡啉乙磺酸（MES）。5.2.12三羟甲基氨基甲烷（Tris）。6猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡制备6.1检测线和质控线的包被把硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，采用划膜喷金机在硝酸纤维素膜上喷涂已经稀释成0.5mg/mL的山羊抗鸡IgY/IgG抗体形成质控线（C线），喷涂已经稀释成1.0mg/mL的猪瘟病毒重组蛋白E2形成检测线（T线），喷量均为1μL/cm，然后在37℃±1℃的温度下烘制8h。6.2硝酸纤维素膜的处理用封闭液（配制方法按照附录A的A.1规定）封闭硝酸纤维素膜30min，用10mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5，配制方法按照附录A的A.2规定）清洗硝酸纤维素膜30min，室温（20℃~25℃)干燥2h后备用。6.3高敏荧光纳米微球标记鸡IgY将50mg的高敏荧光纳米微球加入到5mL的2-N-吗啡啉乙磺酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.0）中，再加入10mg碳二亚胺和10mgN-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温（20℃~25℃)反应30min后在4℃下，18000r/min离心10min，取离心沉淀物用50mL的0.05mol/L硼酸缓冲液（pH8.2，配制方法按照附录A的A.3规定）重悬，加入2mg透析过的鸡IgY，在室温（20℃~25℃)下搅拌反应24h，在4℃下，18000r/min离心10min，取离心沉淀物加入5mL含0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液封闭，再加入5mL样品稀释液（配制方法按照附录A的A.4规定）保存（2℃~8℃)。6.4高敏荧光纳米微球标记猪瘟病毒重组E2蛋白将50mg的高敏荧光纳米微球加入到5mL的2-N-吗啡啉乙磺酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.0）中，再加入10mg碳二亚胺和10mgN-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温（20℃~25℃)反应30min后在4℃下，18000r/min离心10min，取离心沉淀物用50mL的0.05mol/L硼酸缓冲液（pH8.2，配制方法按照附录A的A.3规定）重悬，加入2mg透析过的猪瘟病毒重组E2蛋白，在室温（20℃~25℃)下DB35/T2015—2021搅拌反应24h，在4℃下，18000r/min离心10min，取离心沉淀物加入5mL含0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液封闭，再加入5mL样品稀释液（配制方法按照附录A的A.4规定）保存（2℃~8℃)。6.5标记物垫的包被和处理将高敏荧光纳米微球标记的鸡IgY和猪瘟病毒重组E2蛋白分别稀释成0.1μg/mL和3μg/mL，采用点膜喷金机器喷涂在标记物垫上，喷量为2.5μL/cm，然后在37℃±1℃的温度下烘制8h。6.6试纸条组装PVC底板上从左到右依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫的右端搭在标记垫的左端上，标记垫的右端搭在硝酸纤维素膜的左端上，吸水垫的左端搭在硝酸纤维素膜的右端上。将组装好的PVC板切成5mm宽试纸条（装配图见附录B）。6.7试剂卡组装将切割好的5mm宽试纸条放于检测卡的下盖内，平摊后将检测卡的上盖扣紧，即可完成猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡（简称试剂卡）的装配。7检测7.1样品采集与处理7.1.1样品的采集应按照GB/T18088或NY/T541中的规定采集动物血液3mL～5mL。7.1.2样品的处理静置后的血液样品在3000r/min下离心3min，分离出的血清量应不少于500μL。7.1.3样品的保存待检血清在2℃~8℃下可保存48h，在-20℃条件下可长期保存。7.2准备7.2.1所有操作均应满足GB19489中的相关要求。7.2.2待检血清和猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡试验前应平衡至室温（20℃~25℃)。7.2.3建立工作目录，选择检测项目标准曲线。写明检测项目和检测批号等信息。7.2.4相应的稀释管和检测试剂卡按待检血清顺序编号标识并有序排列。7.3样品稀释用样品稀释液将待检血清按1:50稀释。7.4加样将平衡至室温的猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡置于干净平坦的台面上，在加样孔内滴加80μL已1:50稀释的待检血清，避光静置15min。DB35/T2015—202147.5上机检测加样15min后，将猪瘟病毒抗体高敏荧光检测试剂卡放入高敏荧光分析仪中检测，即时显示并保存检测结果。应在5min内完成检测。7.6结果计算7.6.1以B代表高敏荧光分析仪检测猪瘟抗体标准品（或质控品）溶液的T/C荧光比值。7.6.2以B0代表高敏荧光分析仪检测稀释液的T/C荧光比值。7.6.3以一组猪瘟病毒抗体标准品的B与B0相减（B-B0）荧光比值的对数为纵坐标，以猪瘟病毒抗体标准品的效价（或含量）的对数为横坐标，线性回归获得“标准品效价（或含量）—T/C荧光比值”相关的“标准曲线”。7.6.4高敏荧光分析仪通过检测试剂卡样本免疫反应的“T”、“C”线的荧光强度，依据“标准曲线”换算样本中猪瘟病毒抗体效价（或含量），即时显示并保存。8判定标准当猪瘟抗体效价＜1:16，猪瘟抗体为阴性。当猪瘟抗体效价≥1:32时，表示猪瘟抗体为阳性。猪瘟抗体效价1:16（含1:32，表示可疑，需要再次进行检测。再次检测效价≥1:16判定为阳性1:16判定为阴性。DB35/T2015—20215试剂的配制A.1封闭液磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯），0.2g；磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O，分析纯），2.9g；氯化钠（NaCl，分析纯），8.0g；氯化钾（KCl，分析纯），0.2g；牛白蛋白，5.0g；聚乙烯醇，10.0g。加水至1000mL，溶解后，调节pH值至7.5，保存于4℃备用。A.210mmol/L磷酸盐缓冲液（10mmol/LPBS，pH7.5）磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯），0.2g；磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O，分析纯），2.9g；氯化钠（NaCl，分析纯），8.0g；氯化钾（KCl，分析纯），0.2g。加水至1000mL，溶解后，调节pH值至7.4，保存于4℃备用。A.30.05mol/L硼酸缓冲液（pH8.2）A.3.10.2mol/L硼酸溶液硼酸12.37g加水至1000mL，溶解混匀。A.3.20.05mol/L硼砂（Na2B4O7）硼砂19.07g加水至1000mL，溶解混匀。A.3.3