临床分子生物学检验技术题库

临床分子生物学检验技术题库1.分子诊断学在医学中的主要应用有哪些？分子诊断技术的不断发展，使分子诊断从传统的DNA诊断概念发展到更全面的核酸和蛋白质诊断的新概念；分子诊断的内容也从早期的单一疾病诊断发展到对疾病的易感性判断及提供临床用药指导等医学领域。目前分子诊断的主要应用包括：1.感染性疾病分子诊断病原微生物导致的感染性疾病仍然是严重威胁人类健康的一个重要方面。以前对于这些病原体多采用微生物学、免疫学和血液学相关手段进行检测，但是这些方法不易早期诊断，并受灵敏度和特异性的限制。分子生物学技术不仅可以对微生物感染进行准确的病因学诊断，还可以对感染性病原体进行基因分型和耐药性监测，所以逐渐在人类感染性疾病的临床诊断、流行病学调查、微生物分类分型研究中显示出它独特的功能。2.遗传性疾病的分子诊断目前已发现的人类遗传性疾病达数千种之多，主要分为两大类：符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病和不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病（又称多因素性疾病）。传统的遗传性疾病的诊断方法以疾病的表型病变为依据，而表型则易受外界环境的影响，在一定程度上影响了诊断的准确性和可靠性。遗传性疾病的分子诊断是通过分析患者的DNA、RNA、染色体、蛋白质和某些代谢产物来揭示与该遗传病发生相关的基因、基因型、基因的突变、基因的单倍体型和染色体核型等生物学标记，与传统疾病诊断方法相比，具有更准确可靠和早期诊断的优势，有利于在临床上对遗传型疾病进行早期预防、早期诊断和早期治疗，从而达到减少或控制相关遗传病的发作、减轻症状和改善患者预后的目的。3.肿瘤的分子诊断肿瘤标志在诊断肿瘤、检测肿瘤复发与转移、判断疗效和预后以及人群普查等方面都有较大的实用价值。肿瘤标志分为基因型标志和基因表型标志。基因型标志是指基因本身突变和表达异常，能反映癌前启动阶段的变化；基因表型标志是指基因表达产物异常，表现为其所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原、异位蛋白等，一般出现较晚。因此，寻找特异性肿瘤基因型标志进行肿瘤基因诊断，对于肿瘤的早期发现和诊断，以及肿瘤的预防和治疗具有至关重要的意义。4.个体化医疗个体化医疗是指针对可能影响患者治疗效果的个体因素（基因）和环境因素，做出适合不同患者的最佳处理和治疗方案。分子诊断学在个体化医疗中发挥了重要角色，包括药物基因组学、药物蛋白质组学以及药物代谢组学。目前，广泛应用于个体化医疗方面的分子诊断技术主要有PCR及其延伸技术如单链构象多态性（SSCP）、RT-PCR、PCR-ELISA组合等，此外还包括蛋白质组学诊断技术、细胞遗传学技术、单核苷酸多态性（SNP）基因分型等。5.其它分子诊断还被运用到耐药性的分子诊断、疗效监控、卫生防疫等方面。分子诊断还有一个重要的应用方向是对多基因疾病的易感性判断和诊断，如糖尿病、心血管疾病、乳腺癌、自身免疫性疾病等一些由遗传因素和环境因素共同作用所致的疾病。名词解释1.基因:DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是合成有功能蛋白质或RNA所必需的全部DNA序列（除部分病毒RNA），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核苷酸序列，还包括为保证转录所必需的调控序列。2.C值：基因组大小称为C值，不同生物C值相差很大，C值与物种进化程度不成比例称为C值矛盾。3.C值矛盾：在某些结构与功能相似的同一类生物，甚至亲缘关系非常接近的物种之间，C值有时相差数十倍甚至上百倍，这种生物的进化程度与基因组大小不完全成比例的现象称为C值矛盾（Cvalueparadox，又称C值悖论）。4.自私DNA：一般认为，绝大多数高度重复序列没有特殊功能，但却占据了大量的基因组空间，因此又被称为自私DNA（selfishDNA）。5.多基因家族：一些有编码功能的重复序列称为多基因家族（multigenefamily），是指起源相同，序列相似，功能相关的一组基因。多基因家族分为两类：一类是基因簇（genecluster），基因家族成员位置相对集中，位于某一染色体的特定区域。另一类是基因家族成员在整个染色体上散在分布，甚至位于不同染色体上。6.假基因：基因家族中有的成员因突变而失活，不能表达出有活性的产物，称为假基因（pseudogene）。常规假基因（conventionalpseudogene）：有的假基因由于突变在基因编码区出现一个终止密码子，从而表达出截断蛋白（truncatedprotein）产物，称为常规假基因（conventionalpseudogene）加工假基因（processedpseudogene）：有的假基因来自基因的转录产物，即基因转录后加工成熟的RNA经逆转录生成互补DNA（complementaryDNA，cDNA），后者再整合到基因组中成为假基因，这类假基因称为加工假基因（processedpseudogene）7.人类基因组计划（HGP）：人类基因组计划(HGP)是旨在测出人类基因组30亿碱基对的核苷酸序列，发现所有人类基因并确定它们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，发展基因组学新技术，探讨人类基因组研究的社会、法律与伦理等问题的一个国际性研究项目。8.SNP：单核甘酸多态性，SNP是指单个核苷酸变异而形成的DNA分子多态。9.重叠基因（overlappinggene）：是指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA序列，即某段DNA序列成为两个或两个以上基因共有的组成部分。基因组：是由GENes(基因)和chromosOMEs(染色体)组合而成，指生物体全套遗传信息，包括所有的基因和基因间区域。基因组学：基因组学是研究生物基因组的组成、组内各基因的结构、功能及表达调控的科学，包括基因组核苷酸序列测定、基因组作图、基因定位及基因功能分析等。基因组学可以分为结构基因组学（structuralgenomics）和功能基因组学（functionalgenomics），前者以全基因组核苷酸序列测定为目标，后者根据结构基因组学提供的信息，借助计算机分析以高通量、大规模的实验方法，系统地对基因功能进行诠释。单一序列（uniquesequence）：又称非重复序列，指在基因组中只有1个或少数几个拷贝的序列，大多数真核生物基因为单一序列。人类基因组多样性（humangenomediversity）：同一人种或不同人种基因组均存在或多或少的差异，这种差异即为人类基因组多样性（humangenomediversity）结构基因：结构基因指能编码蛋白质或RNA的基因。调控基因：基因组中有些核苷酸区域本身并不进行转录，但可以对其邻近的结构基因的表达起控制作用，那些起调控作用的非编码序列也称为调控基因。操纵子（operon）：操纵基因与其控制下的结构基因共同组成的功能单位又称为操纵子（operon）。断裂基因：断裂基因是指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。重叠基因：重叠基因是指基因的开放阅读框（OpenReadingFrame,ORF）存在一个或多个核苷酸重叠的基因。转座因子（transposableelement）：跳跃基因又称为转座因子（transposableelement），基因在染色体上的位置不固定，能由一条染色体跳到另外一条染色体上。转座因子：能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列称为转座因子或可转座元件。染色体外基因组：真核生物线粒体和叶绿体中携带遗传物质，能自行复制和表达，称为细胞器基因组或染色体外基因组。多顺反子（polycistron）：操纵子中常常有一至多个功能相关的结构基因串连在一起，受同一个调控区调控，转录在同一个mRNA分子中，称为多顺反子（polycistron）质粒：质粒是独立于染色体外能自主复制的核酸分子，属染色体外基因组。质粒与致病菌的毒力及耐药性有关，又是基因克隆和表达常用的载体，具有重要的研究和应用价值。共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）：绝大多数细菌来源的质粒是双链环状DNA分子，每条链上的核苷酸通过共价键彼此头尾相连，这种结构称为共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）松弛型质粒（relaxedplasmid）：以RNA为调节因子的质粒的复制不需任何自身编码的蛋白质，完全由宿主细胞提供的寿命较长的酶及其它蛋白质因子来完成，这些质粒的复制不受宿主细胞的严格控制，以所谓的“松弛”方式进行，称为松弛型质粒（relaxedplasmid）严紧型质粒（stringentplasmid）：蛋白质调节因子（如RepA）不仅对质粒的复制具有正调控作用，还能负反馈调节其自身的表达，因此一旦蛋白合成受抑制，质粒的复制也受抑制，称为“严紧”型复制，携带与蛋白质调节因子相互作用的复制子的质粒称为严紧型质粒（stringentplasmid）消除（curing）：受环境因素影响导致质粒丢失的过程称为消除（curing）质粒的不相容性（incompatibility）：两种不同质粒如果利用同一复制和维持机制，会在复制和随后向子代细胞分配的过程中相互竞争，因而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失，这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）解离（resolve，res）序列：在转座酶与解离酶基因之间有一段富含AT的特殊序列，称为解离（resolve，res）序列，这是TnA族Tn特有的序列，是解离酶的作用位点接合型Tn：是在革兰氏阳性细菌中发现的一类可以在不同种、属间通过接合进行转移的Tn。两端有偶联序列（couplingsequence）、DR或IR序列。保守转座（conservativetransposition）：转座因子从供体位点上切离，直接插入受体位点，这种方式又称保守转座（conservativetransposition）或“切黏”机制（“cutandpaste”mechanism）末端冗余（terminalredundancy）：末端正向重复序列又称末端冗余（terminalredundancy），是指病毒双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸序列。末端反向重复序列（invertedterminalrepeat，ITR）：是指病毒基因组两端的反向互补重复序列。分段基因组（segmentedgenome）：是指病毒基因组由几条不同的核酸分子组成，多见于+RNA病毒、-RNA病毒及双链RNA病毒。二、简答题：简述核小体的基本组成。染色质的基本组成单位是核小体（nuleosome），由直径为10nm×6nm的组蛋白核心和盘绕在周围的DNA构成。核心为组蛋白八聚体，由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子组成。DNA以左手螺旋在组蛋白核心上缠绕1.8圈，长140bp～150bp（与物种有关）。核心颗粒之间由50bp～70bp的DNA与组蛋白H1构成的连接区组成，与核心颗粒共同构成染色质念珠状细丝。什么是加工假基因？其结构特点是？有的假基因来自基因的转录产物，即基因转录后加工成熟的RNA经逆转录生成互补DNA（complementaryDNA，cDNA），后者再整合到基因组中成为假基因，这类假基因称为加工假基因（processedpseudogene），其结构特点是：缺失内含子，两侧有重复序列，5＇和3＇端与mRNA相似。由于互补DNA的整合位点是随机的，因此加工假基因通常是散在分布。1、简述真核生物基因组的结构和功能特点。(1)、真核生物细胞核基因组的结构与功能特点①．细胞核基因组由染色体DNA组成真核生物细胞核基因组以染色质或染色体的形式存在，两者是同一种物质在不同细胞时期的不同形态。染色体的数目是生物物种的特征性标志之一，同一物种的染色体数目相同，这对物种遗传的稳定性有重要意义，同时，染色质结构也影响基因表达；②．真核生物的断裂基因真核生物的基因大多数都是断裂基因。断裂基因中有内含子序列，将外显子分割开，外显子和内含子交替出现，相间排列。断裂基因为基因的选择性剪接提供了结构基础。选择性剪接是基因表达调控的一种重要方式，通过不同的剪接可以使同一个基因产生多种蛋白质。③．真核生物的重复序列大量重复序列的存在是真核生物基因组的一个显著特征。不同生物的重复序列占基因组的20%～60%，大多数没有编码功能，被称为垃圾DNA。基因组DNA序列分为4种类型：单一序列、轻度重复序列、中度重复序列、高度重复序列。(2)、真核生物细胞器基因组的结构与功能特点1．真核生物线粒体和叶绿体中携带遗传物质，能自行复制和表达，称为细胞器基因组或染色体外基因组。细胞器基因组多数是环状单链DNA，某些低等真核生物的线粒体基因组是线状DNA分子；②．细胞器基因组与核基因组除了功能上存在差异外，还具有自身的一些特点：a//母系遗传。b//线粒体DNA损伤后不易修复，主要是缺乏损伤修复系统，与衰老及某些疾病有关。c//遗传密码与通用遗传密码有差别。2．简述原核生物基因组的一般特点。①基因组相对较小，通常为一条环状双链DNA（doublestrandedDNA，dsDNA）分子。DNA与支架蛋白和RNA结合在一起形成一个较为致密的区域，称为类核（nucleoid）。②基因组的功能单位是操纵子结构。操纵子中常常有一至多个功能相关的结构基因串连在一起，受同一个调控区调控，转录在同一个mRNA分子中，称为多顺反子（polycistron）。③除18s、28s、5srRNA及tRNA基因外，原核生物的结构基因均为单拷贝基因。④基因组中几乎没有重复序列，基因间也几乎没有间隔，基因内没有内含子（古细菌除外）⑤DNA分子中有各种功能区，如复制起始区OriC、复制终止区TerC、转录起始区和终止区等，这些区域往往有反向重复序列，能形成特殊的结构。病毒基因组与原核和真核生物基因组相比病毒基因组很小，严紧、高效的组织形式使病毒基因组能够在宿主细胞内完成复制和繁殖过程，甚至能导致人类严重疾病的发生。（一）帽子和poly（A）尾结构5＇端的帽子结构能防止病毒基因组RNA或其mRNA被宿主细胞内的核酸外切酶降解，对RNA有保护作用。帽子结构还能与核糖体或翻译起始因子结合，参与蛋白质的翻译过程。帽子结构直接影响病毒的感染性，缺乏帽子结构则病毒的感染能力将下降甚至丧失。与帽子结构功能类似，poly（A）尾对病毒RNA也有保护作用，并与病毒的感染性有关。（二）粘性末端对于双链DNA病毒而言，基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分，称为粘性末端。在连接酶的作用下，病毒基因组双链DNA借助粘性末端能连接形成环状、二联体或多联体结构。病毒的基因组DNA如果经外切核酸酶切割也可能产生粘性末端，同样能使病毒基因组环化或形成多联体。（三）末端正向重复序列末端正向重复序列又称末端冗余（terminalredundancy），是指病毒双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸序列。疱疹病毒、T4及T7噬菌体基因组都有末端正向重复序列。（四）末端反向重复序列末端反向重复序列（invertedterminalrepeat，ITR）是指病毒基因组两端的反向互补重复序列。由于ITR能互补配对形成局部双链，单链DNA或RNA分子能够通过ITR形成锅柄样结构（panhandlestructure）（五）重叠基因重叠基因（overlappinggene）是指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA序列，即某段DNA序列成为两个或两个以上基因共有的组成部分。病毒的重叠基因符合遗传节约（geneticeconomy）的原则，增加了病毒基因组携带遗传信息的容量，使有限的基因组序列编码更多的蛋白质。（六）分段基因组分段基因组（segmentedgenome）是指病毒基因组由几条不同的核酸分子组成，多见于+RNA病毒、-RNA病毒及双链RNA病毒。分段基因组有的包装在同一病毒颗粒中，有的包装在不同的病毒颗粒中，后者见于植物病毒。有分段基因组的病毒一般感染效率较低，因为只有全部基因组核酸片段存在时，病毒才具有感染能力。由于分段基因组易发生重组，故病毒容易变异。（七）LTR逆转录病毒（retrovirus）基因组RNA在逆转录后生成的双链DNA中，两端有LTR结构。LTR在结构与功能上与上述重复序列不同。LTR中的重复序列只占一部分，另外还包括单一序列。5＇端的LTR包含许多基因表达调控序列，是一组真核生物增强子和启动子元件，而3＇端的LTR具有转录终止的作用。另外，逆转录病毒基因组利用LTR中的重复序列形成环状结构，在整合酶作用下整合入宿主细胞基因组，因此逆转录病毒可引起宿主细胞基因突变。病毒基因组的大部分序列是编码序列，非编码序列及基因间隔区很少，重叠基因的存在使病毒基因的利用率更高。但少数真核生物病毒如腺病毒、乳多空病毒、细小病毒及逆转录病毒的基因组也存在内含子结构，因此这些病毒的mRNA也涉及转录后加工过程。3、简要介绍质粒并举例说明其在分子生物学中的用途。答：1、介绍：质粒Plasmid:质粒是一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。质粒的结构：质粒是双链环状结构的DNA分子，没有游离的末端，每条链上的核苷酸通过共价键彼此头尾相连，这种结构称为共价闭合环状DNA（cccDNA）。质粒DNA通常同时存在于三种结构：超螺旋结构、线性DNA结构和环状DNA.。质粒的复制：质粒能自主复制，是能独立复制的复制子，复制子是一个复制单位，包括DNA复制起点及其相关的调控元件。质粒DNA的复制起点是一段特定的DNA片段，长约数百bp，能够与质粒自身或宿主细胞编码的酶或蛋白质因子结合，启动质粒的复制，并控制质粒在宿主中的拷贝数。按质粒的复制的调控及其拷贝数可分为两类：严紧控制型质粒和松弛控制型质粒。质粒的稳定性和与不相容性：①质粒在宿主细胞内稳定地存在而不丢失称为质粒的稳定性。影响质粒稳定性的稳定性因素有两种：宿主细胞分裂时质粒能否均衡的分配到子代细胞。和质粒分子自身结构的稳定性。②质粒的不相容性：两个不同的质粒因利用同一复制和维持机制，在复制和随后向子代细胞分配的过程中会发生竞争，从而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失，这种现象称为质粒的不相容性。2、在分子生物学中的用途：质粒对宿主细胞的生存一般不是必需的，但质粒带有某些特殊的不同于宿主细胞的遗传信息，其存在赋予宿主细胞一些新的遗传形状，某些情况下有利于细胞的生长。质粒DNA编码多种蛋白质，有的与质粒自身的复制和稳定性有关，有的控制控制宿主细胞的各种性状，如：各种抗性、代谢能力、致病性、接合转移酶等。根据宿主的表型可以识别质粒的存在，这一性质广泛应用于重组菌的筛选和鉴定。同时，质粒的不相容性常用于质粒的分类，基因工程中以质粒为载体进行基因克隆也是利用了质粒的不相容原理1.为什么要投入巨大的人力物力进行基因组学研究和测定生物基因组全序列？基因组序列包含生物体的全部遗传信息，基因组全序列测定是全方位认识生命的必由之路和首要任务。人类基因组计划、各种模式生物基因组计划、病原体基因组计划以及具有重要经济价值的动植物基因组计划必将对人类社会的发展与进步产生广泛而深远的影响。主要体现在以下几个方面：1．基因组计划改变了生命科学研究的模式。2．基因组计划为生命科学研究开辟了新方向、新方法。基因组计划促进了生物信息学(bioinformatics)的发展3．基因组计划大大加快了生命科学研究的步伐。4．基因组学研究促进了医学各个方面的发展和进步。5．基因组学冲击着人类文明。2.人类DNA分子多态性的产生有以下哪几种方式？①重复序列单元的拷贝数变异，主要是微卫星DNA（microsatelliteDNA）多态性；②转座因子导致的分子多态，如Alu序列多态性；③单个核苷酸的变异，即SNP。3.真核生物中广泛分布的内含子究竟有什么样的功能？基因中间的内含子在RNA转录物水平上被切除，不参与该基因在蛋白水平上的表达，但近年的研究发现一些内含子具有自我剪接能力，且能够编码蛋白质。内含子有I型和II型之分，I型内含子编码成熟酶和核酸内切酶，参与其自身在同源等位基因之间的转移，即归巢（homing）；II型内含子编码的蛋白具有核酸内切酶和逆转录酶活性，这些活性都与II型内含子归巢相关。内含子上的碱基突变也能影响RNA剪接过程而阻止其成熟。不同物种的同源基因内含子的差异远大于外显子，某些含相同外显子的基因其内含子明显不同。在生物进化过程中，内含子与外显子可能以相同的频率突变，但内含子的突变不足以影响生物体的生存从而得以更多保留。除归巢外，内含子还存在转位和丢失现象，能够作为一种可转移遗传因子在生物进化中发挥一定的作用。线粒体基因组的一些自身特点。细胞器基因组与核基因组除了功能上存在差异外，还具有自身的一些特点：①母系遗传。由于父系的线粒体基因组在精卵结合时一般不能进入卵细胞，子代线粒体基因组全部来自母亲，不存在基因的重组。②线粒体DNA损伤后不易修复，主要是缺乏损伤修复系统，与衰老及某些疾病有关。③遗传密码与通用遗传密码有差别，如UGA（终止密码子）编码Trp，AGA/AGG（Arg）为终止密码子，AUA（Ile）为起始密码子并编码Met。影响质粒稳定性的因素？质粒在宿主细胞内能稳定存在不被丢失称为质粒的稳定性。影响质粒稳定性的因素有两种：①宿主细胞分裂时质粒能否均衡地分配到子代细胞。质粒的均衡分配由质粒DNA上的特殊序列与宿主细胞膜上的特殊蛋白相互作用来介导，这些蛋白有分配因子（partitionfactor，par）和质粒稳定蛋白（proteinofstabilityofplasmid，sop）等。②质粒自身分子结构的稳定性。如果质粒不能均衡地分配，或质粒分子发生突变，丢失某些性状，宿主细胞经过几代繁殖后质粒将被丢失。质粒的稳定性也受环境的影响，如高温培养、紫外线照射、某些化学试剂及中草药等均可干扰质粒的稳定性，甚至使质粒丢失。在病毒中，5’端的帽子结构有什么作用？5＇端的帽子结构能防止病毒基因组RNA或其mRNA被宿主细胞内的核酸外切酶降解，对RNA有保护作用。帽子结构还能与核糖体或翻译起始因子结合，参与蛋白质的翻译过程。帽子结构直接影响病毒的感染性，缺乏帽子结构则病毒的感染能力将下降甚至丧失。与帽子结构功能类似，poly（A）尾对病毒RNA也有保护作用，并与病毒的感染性有关。一、细菌质粒控制的性状案例1.抗性（1）抗生素抗性氨基糖甙类、β-内酰胺类、大环内酯类及磺胺等（2）重金属抗性汞离子及有机汞制剂、镍、钴、银、铬、铅、锑及铋等（3）阳离子抗性砷酸盐、亚砷酸盐、铬酸盐及硼酸盐等（4）其它抗性紫外线，X射线，细菌素，质粒控制的修饰系统等2.代谢能力（1）简单糖类的代谢乳糖、蔗糖及绵籽糖等（2）卤化物的代谢2，4-二氯甲苯（3）复杂碳化合物的代谢甲苯、萘、樟脑、苯胺、烟碱及烷烃等（4）蛋白质代谢明胶及酪蛋白等（5）其他代谢色素生成，产硫化氢，胞外DNA酶等3.致病性（1）毒素大肠杆菌肠毒素、炭疽杆菌外毒素、破伤风杆菌神经毒素及鼠疫菌素等（2）侵袭力菌毛、夹膜、黏附因子及血浆凝固酶等4.质粒的复制和稳定性质粒的拷贝数，质粒的寄主范围，质粒的不相容性等5.结合转移性伞毛的合成，表面排斥，致育性抑制，对信息素的反应和抑制等二、复制型转座子案例复制型转座转座因子在转座的过程中能够复制，转座的结果是供体与受体都有一个拷贝的转座因子（图2-13A）。复制型转座需要转座酶和解离酶参与，转座酶的作用是交错切割转座因子两端的一条链，解离酶的作用是切割转座因子的res位点，使两个拷贝的转座因子进行重组。这种类型的转座涉及供体转座因子与受体插入位点的切割连接、转座因子的复制与重组。Tn3、Tn916通过这种方式转座。一、名词解释：1、核酸分子杂交：是利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。分子杂交可以发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在RNA链与DNA链之间形成。2、cDNA：cDNA(complementaryDNA)是指与mRNA互补的DNA分子。它是以mRNA为模板，遵循碱基互补配对原则，由逆转录酶催化合成的。3、探针：探针（probe）广义上指的是能特异性与特定靶分子发生相互作用，并能被某些方法所检测的分子，例如抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、受体-配体等，均可看作是探针与靶分子间的相互作用。4、Southern印迹杂交：是指经凝胶电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维素膜），然后用标记的探针DNA分子检测靶DNA的一种方法。5、Northern印迹杂交：是指将待测RNA（主要是mRNA）从凝胶转印到固相支持物上，与标记的DNA探针进行杂交的印迹技术。此项技术的原理和基本过程与Southern印迹杂交相对应，故被称为Northern印迹杂交。6、斑点杂交：斑点杂交与狭缝杂交的原理和操作流程相同，都是将待检的DNA、RNA或细胞直接点到膜上，烘烤固定，只是印迹分别呈圆形或狭缝状。一张膜上可同时检测多个样品，由于不需电泳和转膜，整个过程简便、快速。常用作核酸定性、半定量分析和杂交条件的优化。斑点印迹杂交（dotblot）ASO技术的检测形式，如将PCR产物不经电泳分离直接点在膜上，使杂交信号成圆点状，即斑点印迹杂交。狭缝印迹杂交（slotblot）用一种特殊的装置把PCR产物通过狭缝点加到膜上，使杂交信号成为很细窄的条带，这种检测形式即狭缝印迹杂交。7、荧光原位杂交：在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性的分子标记技术。其基本原理是将核酸探针用特殊的非放射性标记物标记，然后直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性识别结合，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。8、融解温度(meltingtemperature,Tm)：DNA变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中DNA变性一半所需要的温度称为融解温度(meltingtemperature,Tm)，DNA的Tm值一般在82°C~95°C之间。二，简答题：1、核酸杂交的基本原理？其基本原理是利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。分子杂交可以发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在RNA链与DNA链之间形成。2、核酸探针有哪几种基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针等种类。3、列举核酸分子杂交技术并试述其原理。①、Southern印迹杂交是指经凝胶电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维素膜），然后用标记的探针DNA分子检测靶DNA的一种方法。1975年由英国爱丁堡大学的Southern建立，主要应用于基因组DNA的定性及定量分析、DNA图谱分析、基因变异、限制性片段长度多态性分析及疾病诊断等。Southern印迹杂交基本过程包括：限制性核酸内切酶消化待测DNA―琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段―DNA变性并转印到固相支持物上―预杂交―与特异DNA探针杂交―杂交信号的检测及结果分析。②、Northern印迹杂交是指将待测RNA（主要是mRNA）从凝胶转印到固相支持物上，与标记的DNA探针进行杂交的印迹技术。此项技术的原理和基本过程与Southern印迹杂交相对应，但也有几点不同：1.RNA极易被环境中存在的RNA酶所降解，在操作过程中需尽可能避免RNA酶的污染；2.RNA需在变性剂(甲醛、乙二醛、甲基氢氧化汞)的存在下进行凝胶电泳分离，保持其单链线性状态，防止RNA分子形成二级结构。不能用碱变性，因为碱会水解RNA分子中的2'-OH；3.印迹前将含变性剂的凝胶用水浸泡除去后再印迹、杂交。③、斑点杂交与狭缝杂交的原理和操作流程相同，都是将待检的DNA、RNA或细胞直接点到膜上，烘烤固定，只是印迹分别呈圆形或狭缝状。一张膜上可同时检测多个样品，由于不需电泳和转膜，整个过程简便、快速。常用作核酸定性、半定量分析和杂交条件的优化。但其不足是不能判断核酸片段的大小，且特异性不高。④、原位杂交是以标记的核酸探针分子与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其检测的方法。原位杂交技术不仅具有高度的特异性和灵敏度，还能精确定位1、核酸探针的标记方法。为了检测杂交结果，必须用一定的标记物对探针分子进行标记。标记物可分为放射性核素和非放射性核素两大类。目前最常用的探针标记物是放射性核素，其灵敏度和特异性极高，但存在半衰期短、检测时间长和污染环境等不足。非放射性核素标记物稳定、安全、经济、检测时间短但灵敏度较低。理想的探针标记物应具有以下特征：1.高灵敏度；2.标记物与探针结合后，不影响碱基配对的特异性、杂交体的稳定性及其Tm值；3.检测方法应高度灵敏、特异、假阳性率低；4.标记物与探针结合后稳定、保存时间长；5.标记物对环境无污染、对人体无损伤、价格低廉。（一）放射性核素标记1.放射性核素标记物的类型常用于标记核酸探针的放射性核素有32P、35S、3H、125I、131I等。根据各种核素的物理性质、标记方法和检测手段选择合适的核素作为标记物。2.放射性核素的标记放射性核素探针通常采用体外标记法，包括化学法和酶法。化学法指的是利用标记物分子和探针分子上活性基团间的化学反应，将标记物结合到探针分子上的标记方法，如125I标记和光敏生物素标记等。酶法则是预先将标记物标记在核苷酸分子上，经过酶促反应将标记好的核苷酸分子或标记基团掺入或交换到探针分子中的方法。采用酶法标记放射性核素探针的方法有切口平移法、随机引物法、末端标记法、PCR标记法和体外转录法等。（二）非放射性核素标记虽然放射性核素标记探针灵敏度高、特异性好、方法简便，但存在着检测时间长、半衰期短、价格昂贵以及污染环境等缺点,使核酸分子杂交技术的推广应用受到一定程度的限制。为此，人们一直在寻找安全可靠的非放射性标记物。1.非放射性标记物的类型目前用于核酸分子杂交的非放射性标记物有生物素（biotin）、地高辛（Digoxigenin）、光敏生物素（photo-biotin）、荧光素（异硫氰酸荧光素、罗丹明）等。2.非放射性标记和检测方法非放射性标记核酸探针的方法采用体外标记法中的化学法或酶法，其中化学法操作简单、价格低廉，是目前较为常用的标记方法。（1）生物素标记生物素是最先被用于核酸标记的非放射性标记物，它是一种小分子水溶性维生素，也是一种半抗原，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。（2）光敏生物素标记此法操作简便、快速稳定，灵敏度可达pg水平，可直接将生物素标记在核酸探针上。目前使用的光敏生物素试剂主要有两种：光生物素和补骨脂素生物素，它们都是由对光敏感基团、连接臂和生物素结合而成的一类标记物（3）地高辛标记地高辛是一种半抗原。将地高辛标记在dUTP上形成dig-11-dUTP，通过切口平移法或随机引物法，在DNA聚合酶的作用下将dig-11-dUTP掺入到核酸分子中，从而获得带有地高辛标记的DNA探针。利用地高辛可获得地高辛抗体，通过偶联有荧光素或酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗体对探针进行检测。地高辛标记探针与生物素标记探针相比，由于地高辛仅存在于洋地黄植物中，没有组织、细胞中内源性地高辛的干扰，杂交结果本底低，敏感性高。可应用于Southern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交和原位杂交。（4）酶标记ALP或辣根过氧化物酶(herseradishperoxidase，HRP)可通过化学法直接标记到DNA探针上，生成酶标DNA分子。目前最常用的是HRP-对苯醌-聚乙烯亚胺酶标DNA体系，HRP-对苯醌-聚乙烯亚胺在戊二醛作用下与变性的DNA共价结合，使HRP与DNA连接在一起，生成HRP标记的DNA探针。（5）荧光素标记常用的荧光素主要有异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）和罗丹明（rhodamine），可将荧光素标记在dUTP上形成荧光染料-11-dUTP，在相应酶的作用下，掺入到DNA探针分子中，通过紫外线激发产生荧光进行检测，这种标记荧光的方法称为直接法。如果先将生物素或地高辛等半抗原连结在探针分子上，然后用偶联有荧光素的相应半抗原的抗体进行检测，这种标记荧光的方法称为间接法。无论用那种方法标记的荧光素核酸探针都应避光低温保存。杂交（hybridization）：将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交。变性（denaturation）：在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，形成无规则线团，这一过程称作变性。融解温度（meltingtemperatureTm）：在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的中点被称作融解温度。复性（renaturation）：变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。退火（annealing）：将反应体系的温度降低至寡核苷酸（引物）的熔点温度以下（40°C～70°C），以便使引物能与模板DNA序列互补结合，形成杂交链。成核作用（nucleation）：两条核酸单链随机碰撞形成暂时局部双链，如果局部双链周围碱基不能配对，则迅速解离，重新碰撞直到找到正确的互补序列。拉链作用（zippering）：在成核的基础上，两条单链的其余部分碱基迅速互补配对，就像“拉链”那样形成完整的双链分子。Cot1/2：表示单链DNA的起始浓度与复性一半所需时间之积，与复性速率成反比。核酸分子杂交（molecularhybridization）：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体（hybrid）的过程。杂交分子：不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子。利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。探针（probe）：探针是用放射性核素或非放射性物质标记的一段单链或双链核苷酸，可依碱基配对规律与具有互补序列的待测核酸进行杂交，以探测它们的同源程度。广义的探针：所有能与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并可以被检测的分子。核酸探针则特指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能由其标记被特异性检测的核酸分子。cDNA（complementaryDNA）：探针是与mRNA互补的DNA分子，是由RNA经过逆转录酶催化产生的逆转录产物。生物素（Biotin）：生物素是一种水溶性维生素，又称为维生素H。其分子中的戊酸羟基经化学修饰活化后可携带多种活性基团，能与核苷酸或核酸等多种物质发生偶联，从而使这些物质作上生物素标记。抗生物素蛋白（avidin）又称亲合素、卵白素等，是一种从卵清中提取的碱性的四聚体糖蛋白，与生物素分子有极高的亲和力，具有专一、迅速及稳定的特点。DNA加尾（DNAtailing）标记：将末端转移酶（terminaltransferase）和含标记报告基团的dNTP（常常为dATP）与待标记的DNA一起孵育，可以得到标记的均一多聚核苷酸尾巴。增强的化学发光（enhancedchemiluminescence,ECL）辣根过氧化物酶水解发光氨为3-氨基-邻苯二甲酸盐，并在428nm处发射荧光，但如果在这种情况下存在一种特殊的化合物，发射光的强度就会增加1000倍，使其发出的光线更易于被检测，也使反应的敏感性增加，这一过程即增强的化学发光。异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）：有两种异构体，异构体I型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。碱性磷酸酶（alkalinephosphataseALP或AKP）：属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高。HRP由多个同功酶组成，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ（德文ReinheitZahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）：分离自感染了噬菌体T4的大肠杆菌细胞，可将ATP中γ磷酸基转移到具有5’端羟基的DNA或RNA分子上的酶。小牛肠碱性磷酸酶（CalfIntestinalAlkalinePhosphatase，CIP）：来源于小牛肠粘膜的碱性磷酸酶，具有以下功能：切除DNA，RNA，rNTPs及dNTPs的5’末端磷酸基团，防止克隆载体的自环化连接，蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。限制性内切酶（restrictionendonuclease）：一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。I型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而II型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Klenow片段（Klenowfragment）：E.coliDNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5’-3’聚合酶和3’-5’外切酶活性，但缺少完整酶的5’-3’外切酶活性。逆转录酶（Reversetranscripatase）：是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构，真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。噬菌体（Phage）即细菌病毒。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，作为病毒的一种，噬菌体具有病毒特有的一些特性。噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是在细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。M13噬菌体：是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。磷酸钙-DNA共沉淀(calciumphosphate-DNAcoprecipitation)：分子生物学中特指将外源DNA转入真核细胞的一种方法。将氯化钙、DNA和磷酸缓冲液混合，形成吸附DNA的不溶性羟磷灰石细微颗粒附着在细胞表面，通过胞饮进入细胞。原生质体融合(protoplastfusion)：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。操纵子（operon）结构：原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。结构基因同其上游的调控区（包括调节基因、启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号，共同组成了一个基因表达单位，即操纵子结构。沉默子（silencer）：是参与基因表达负调控的一种元件，是在研究T淋巴细胞的T抗原受体(TCR)基因表达调控时发现的。沉默子的DNA序列被调控蛋白结合后阻断了转录起始复合物的形成或活化，使基因表达活性关闭。内质网（endoplasmicreticulum；ER）：真核细胞细胞质内广泛分布的由膜构成的扁囊、小管或小泡连接形成的连续的三维网状膜系统。分为糙面内质网和光面内质网两种。ADP核糖基化作用（ADPribosylation）：ADP核糖基化作用是组蛋白修饰方式之一，通过两种机制影响染色体的结构与功能：改变组蛋白的电荷，从而改变组蛋白与DNA结合的特性；能够产生蛋白识别模块（proteinrecognitionmodules）的结合表面，从而能募集专一蛋白复合物到它们的表面起作用。ADP核糖基化作用是较为精细的基因表达方式之一。名词解释1.DNA重组：是指将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组DNA。2.分子克隆：分子克隆是指按照人的意愿，在体外将目的DNA与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。3.基因工程：将基因进行克隆，并利用克隆的基因在受体细胞内复制、转录和翻译表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和个体的特性所用的方法及相关工作统称为基因工程。4.限制性核酸内切酶，是DNA重组技术中重要的工具酶之一，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。5.回文结构（palindromestructure）双链DNA分子中按对称轴排列的反向互补序列，并在此序列内特异切割DNA，切割后的DNA片段产生粘性末端和平末端两类切口。6.粘性末端：限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。7.同工异源酶（isoschizomer）：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。8.同尾酶（isocaudarner）：有些限制性内切酶识别序列不同，可产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶。9.星号活力：限制性内切酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，酶的特异性降低，这种现象称为星号活力。10.平末端（bluntend）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。11.逆转录作用：依赖RNA的DNA聚合酶活性，以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录作用。12.转化作用：将重组的DNA分子引入细菌(原核细胞),使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化作用。13.糖基化作用是指一段可被糖基转移酶识别的特定的氨基酸短序列(Asn-X-Ser/Thr)，当其上的氨基酸同糖侧链结合时，就会使蛋白质的结构发生深刻的变化，形成糖蛋白。这种过程叫做糖基化作用。问答题1.限制性内切酶分为哪几大类，各有什么特点？答:限制性内切酶分为三大类，各自己的特点如下：I类能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。II类识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。III类识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。2.大肠杆菌DNA聚合酶I，具有哪些活性和用途？答：大肠杆菌DNA聚合酶I具有3'--5'外切活性和5'--3'的聚合酶活性以及5'--3'的外切活性。用途：①利用E.coliDNA聚合酶的5'--3'外切核酸酶活性，可用切口平移法标记DNA，所有DNA聚合酶中只有此酶有此反应；②用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性；③对3'突出端的DNA作末端标记（交换或置换反应）。3.何谓限制性内切酶？此类酶在分子生物学研究中有何用途？答：是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。I型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而II型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。限制酶的应用：①DNA重组；②分子杂交受体体段DNA；③DNA序列分析；④制备DNA指针；⑤基因定位；⑥DNA甲基化碱基的识别和切割。4.DNA修饰酶主要有哪些，各有什么作用？答：DNA修饰酶主要有以下几种：（1）碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基团。（2）polynucleotidekinase:来自于T4侵染的大肠杆菌，在5'端增加磷酸基团。（3）末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3'端增加一个或多个脱氧核苷酸。（4）Topoisomerase改变共价闭合