探索猪骨骼肌生长密码：顺式天然反义转录RNA的表达调控解析

探索猪骨骼肌生长密码：顺式天然反义转录RNA的表达调控解析一、引言1.1研究背景与意义猪肉作为全球范围内重要的肉类消费品，其产量和品质直接关系到畜牧业的发展和人们的生活质量。猪的骨骼肌生长发育对生猪产业而言至关重要，这不仅决定了猪肉的产量，还在很大程度上影响着肉品的品质。骨骼肌约占猪体重的40%-50%，是猪体内最大的组织。猪骨骼肌的生长发育主要包括胚胎期的数量性增生和出生后的肥大性增生两个关键阶段。在胚胎期，肌纤维数目不断增加；出生后，肌纤维直径逐渐增大，而肌纤维的数目在出生前就已基本确定。因此，深入研究猪骨骼肌生长发育的分子机制，对于提高生猪的瘦肉率、生长速度和饲料转化率等经济性状具有重要的理论和实践意义。随着分子生物学技术的飞速发展，人们对基因表达调控机制的认识不断深入。近年来，一类新的内源性RNA——天然反义转录RNA（NaturalAntisenseTranscripts，NATs）逐渐成为研究热点。NATs是指在生物体内自然产生的，与靶基因的正义链互补的RNA转录本。根据其转录来源，NATs可分为顺式天然反义转录RNA（cis-NaturalAntisenseTranscripts，cis-NATs）和反式天然反义转录RNA（trans-NaturalAntisenseTranscripts，trans-NATs）。其中，cis-NATs因其从基因的互补DNA链转录而来，与正义转录基因在时间和空间上紧密关联，对其正义转录基因的调控可能具有独特的优势，从而受到了广泛的关注和研究。大量研究表明，cis-NATs在真核生物的转录及转录后调控过程中发挥着重要作用，参与了包括胚胎发育、细胞分化、代谢调节以及疾病发生等多种生理和病理过程。在胚胎发育过程中，cis-NATs可以通过调控相关基因的表达，影响细胞的增殖、分化和迁移，进而影响胚胎的正常发育。在细胞分化过程中，cis-NATs可以调节分化相关基因的表达，促进或抑制细胞向特定方向分化。在代谢调节方面，cis-NATs可以参与能量代谢、物质代谢等过程的调控，维持细胞和生物体的正常代谢平衡。此外，cis-NATs的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关，如肿瘤、神经系统疾病等。然而，目前关于cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的作用及调控机制的研究还相对较少。猪作为重要的农业经济动物，其骨骼肌生长发育受到多种基因和信号通路的调控。深入研究cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的表达特征、调控功能以及其自身所受的表达调控机理，不仅有助于揭示猪骨骼肌生长发育的分子机制，还可能为猪的遗传育种提供新的分子标记和理论依据，从而推动生猪产业的可持续发展。因此，开展猪骨骼肌生长发育过程中顺式天然反义转录RNA的表达调控研究具有重要的科学意义和应用价值。1.2猪骨骼肌生长发育概述猪骨骼肌的生长发育是一个复杂且有序的生理过程，从胚胎期开始启动，一直持续到出生后。在胚胎期，猪骨骼肌的发育主要经历了两个关键的生长波。第一个生长波发生在胚胎期35-60天，这一时期主要是初级纤维的形成。初级纤维是最早出现的肌纤维，它们为后续骨骼肌的发育奠定了基础。在这个阶段，成肌细胞开始增殖、分化并融合形成初级肌管，初级肌管进一步发育成熟形成初级纤维。第二个生长波出现在胚胎期54-90天，此阶段以次级纤维的生成为主。次级纤维围绕着初级纤维形成，它们的出现增加了肌纤维的数量，使得骨骼肌的结构更加完善。研究表明，在这两个生长波中，涉及到众多基因的表达调控，如MyoD、Myf5等成肌调节因子，它们在成肌细胞的增殖、分化和融合过程中发挥着关键作用。出生后，猪骨骼肌的生长主要表现为肌纤维的肥大。此时，肌纤维直径逐渐增大，肌细胞内的肌原纤维数量增多，肌浆蛋白含量增加，从而使肌肉的体积和重量不断增加。在这一过程中，营养物质的供应、激素水平以及相关基因的表达调控都对肌纤维的肥大起着重要作用。例如，生长激素（GH）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）可以促进蛋白质的合成，刺激肌纤维的生长；而一些肌肉生长抑制素（MSTN）等负调控因子则会抑制肌纤维的生长。猪的骨骼肌主要由不同类型的肌纤维组成，根据其代谢特征和收缩特性，可分为快肌纤维和慢肌纤维。快肌纤维又可进一步细分为快红肌纤维（IIa型）和快白肌纤维（IIb型）。慢肌纤维（I型）具有较高的氧化代谢能力，富含线粒体和肌红蛋白，能够持续进行有氧呼吸，为肌肉收缩提供稳定的能量供应，适合长时间、低强度的运动。快红肌纤维（IIa型）兼具一定的氧化代谢能力和糖酵解能力，其收缩速度较快，力量较强，可在中等强度运动中发挥作用。快白肌纤维（IIb型）则以糖酵解代谢为主，收缩速度快，力量大，但耐力较差，主要参与短时间、高强度的运动。不同类型肌纤维的比例和特性不仅影响着猪的运动能力和生长性能，还与猪肉的品质密切相关。例如，慢肌纤维含量较高的猪肉通常具有更好的嫩度、多汁性和风味，因为慢肌纤维中的脂肪含量相对较高，且肌内脂肪的分布更均匀，这使得肉质更加鲜美。猪骨骼肌的生长发育与肉品质之间存在着紧密的联系。骨骼肌的生长状况直接决定了猪肉的产量，生长发育良好的骨骼肌能够提供更多的可食用肉。肌纤维的类型、大小和数量等因素对肉品质有着重要影响。较小直径的肌纤维往往使肉质更加细嫩，因为肌纤维之间的结缔组织相对较少，咀嚼时更容易断裂。肌纤维的类型组成也会影响肉的风味和口感，如前文所述，慢肌纤维比例高的肉在风味和多汁性方面表现更优。此外，骨骼肌生长发育过程中的代谢活动也会影响肉品的化学组成和品质特性。例如，能量代谢途径中的关键酶活性会影响肌肉中糖原、脂肪和蛋白质的含量，进而影响肉的酸碱度、持水性和色泽等品质指标。1.3cis-NATs简介顺式天然反义转录RNA（cis-NATs）是一类特殊的内源性RNA分子，其转录自与靶基因相同基因座的反链DNA，与靶基因的正义链具有完全互补的序列，从而能够与正义转录本形成正义-反义转录本对（SApair）。这种独特的转录来源使得cis-NATs与靶基因在时间和空间上紧密相连，为其对正义转录基因的精准调控提供了基础。cis-NATs在真核生物的转录及转录后调控过程中扮演着不可或缺的角色。在转录水平上，cis-NATs可以通过转录干扰机制影响正义基因的转录起始、延伸和终止。当cis-NATs与正义基因的转录起始位点附近区域互补结合时，可能会阻碍RNA聚合酶与正义基因启动子的结合，从而抑制正义基因的转录起始。在转录延伸过程中，cis-NATs与正义转录本形成的双链RNA结构可能会影响RNA聚合酶的行进速度和稳定性，导致转录提前终止或产生异常的转录产物。在转录后水平，cis-NATs可以通过多种方式调控正义转录本的命运。cis-NATs与正义转录本形成的双链RNA结构可以作为RNA编辑酶的作用底物，促使mRNA中的碱基发生改变，从而改变蛋白质的氨基酸序列和功能。双链RNA结构还可能会被细胞内的核酸酶识别并降解，影响正义转录本的稳定性和半衰期。此外，cis-NATs还可以通过与正义转录本竞争结合某些RNA结合蛋白，间接影响正义转录本的加工、运输和翻译过程。在细胞分化过程中，cis-NATs的表达变化与细胞向特定方向的分化密切相关。以神经干细胞分化为例，某些cis-NATs可以通过调控神经分化相关基因的表达，促进神经干细胞向神经元或神经胶质细胞分化。在肿瘤发生发展过程中，cis-NATs的异常表达也被发现与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等过程密切相关。一些肿瘤相关基因的cis-NATs可能会通过调节这些基因的表达，影响肿瘤细胞的生物学行为，如促进肿瘤细胞的增殖和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡。与其他基因调控方式相比，cis-NATs对正义转录基因的调控具有明显的时空优势。由于cis-NATs与正义基因来自同一基因座，它们在细胞内的表达往往具有同步性，能够在特定的时间和空间条件下对正义基因的表达进行精准调控。在胚胎发育的特定阶段，某些cis-NATs会与相应的正义基因同时表达，共同参与胚胎组织和器官的形成和发育过程。这种紧密的时空关联使得cis-NATs能够更快速、有效地响应细胞内外部环境的变化，对正义基因的表达进行及时的调节，从而保证细胞生理功能的正常发挥和生物体的正常发育。1.4研究目的与内容本研究旨在深入探究cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的表达调控机制，具体研究目的如下：首先，全面鉴定猪骨骼肌生长发育过程中的cis-NATs，并对其进行详细的生物信息学分析，明确其在基因组中的分布、结构特征以及与正义基因的关系。其次，系统分析cis-NATs在猪骨骼肌生长发育不同阶段（胚胎期和出生后）以及不同类型肌纤维（快肌纤维和慢肌纤维）中的表达特征，包括表达水平的变化趋势、组织特异性等，揭示其表达规律与猪骨骼肌生长发育进程的关联。然后，通过功能验证实验，深入探究cis-NATs对猪骨骼肌生长发育相关基因表达的调控作用，以及对肌细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程的影响，阐明其在猪骨骼肌生长发育中的具体功能。最后，研究cis-NATs自身表达调控的分子机制，特别是转录因子对其转录起始和表达水平的调控作用，揭示cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的调控网络。基于上述研究目的，本研究将开展以下具体研究内容：猪骨骼肌生长发育过程中cis-NATs的鉴定与生物信息学分析：运用高通量测序技术，如链特异性RNA-seq，对猪骨骼肌生长发育不同阶段（胚胎期35天、45天、60天、70天、90天以及出生后1天、7天、14天、28天、60天、90天、120天、180天等）的样本进行转录组测序，构建猪骨骼肌生长发育转录图谱。通过生物信息学分析方法，利用相关软件和数据库，从测序数据中筛选和鉴定出cis-NATs，并对其进行全面的注释，包括确定其在基因组中的位置、与正义基因的重叠区域和方向、转录起始位点和终止位点等信息。分析cis-NATs的序列特征，如长度分布、碱基组成、GC含量等，以及其二级结构预测，探讨其结构与功能的潜在关系。cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的表达特征分析：采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，对高通量测序鉴定出的cis-NATs在不同发育阶段的猪骨骼肌样本中的表达水平进行验证和定量分析，确保测序结果的准确性和可靠性。分析cis-NATs在猪胚胎期和出生后骨骼肌生长发育过程中的表达动态变化，绘制表达谱，观察其表达水平随时间的变化趋势，明确其在不同发育阶段的表达模式。比较cis-NATs在猪不同类型肌纤维（快肌纤维和慢肌纤维）中的表达差异，研究其在不同肌纤维类型中的特异性表达情况，探讨其与肌纤维类型分化和功能的关系。cis-NATs对猪骨骼肌生长发育相关基因表达及细胞生物学过程的功能探究：构建针对特定cis-NATs的过表达载体和干扰载体，利用细胞转染技术将其导入猪骨骼肌卫星细胞或其他相关细胞系中，实现cis-NATs的过表达和表达沉默。通过基因表达谱芯片或RNA-seq技术，分析过表达或干扰cis-NATs后猪骨骼肌生长发育相关基因的表达变化，筛选出受cis-NATs调控的关键基因。运用生物信息学方法对这些关键基因进行功能富集分析和信号通路分析，明确cis-NATs参与调控的生物学过程和信号通路，揭示其对猪骨骼肌生长发育的调控机制。利用细胞增殖检测试剂盒（如CCK-8法）、EdU染色、流式细胞术等实验技术，检测过表达或干扰cis-NATs对猪骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响，观察细胞周期分布的变化，探讨cis-NATs在肌细胞增殖过程中的作用。通过免疫荧光染色、Westernblot等实验方法，检测肌细胞分化相关标志物（如MyoD、Myogenin等）的表达水平，分析过表达或干扰cis-NATs对猪骨骼肌卫星细胞分化能力的影响，研究其在肌细胞分化过程中的调控作用。采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术，检测过表达或干扰cis-NATs对猪骨骼肌卫星细胞凋亡的影响，分析细胞凋亡率的变化，探讨cis-NATs在肌细胞凋亡过程中的作用机制。猪骨骼肌生长发育过程中cis-NATs的转录因子调控研究：借助公共数据库（如ENCODE、GEO等）和已有的研究成果，筛选与猪骨骼肌生长发育相关且可能调控cis-NATs表达的转录因子。运用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术，研究这些转录因子在猪骨骼肌细胞中与cis-NATs基因启动子区域的结合情况，确定转录因子与cis-NATs的直接调控关系。通过构建转录因子过表达载体和干扰载体，转染猪骨骼肌卫星细胞，分析转录因子表达变化对cis-NATs表达水平的影响，验证转录因子对cis-NATs的调控作用。利用凝胶迁移实验（EMSA）和荧光素酶报告基因实验，进一步验证转录因子与cis-NATs基因启动子区域的结合位点和结合活性，明确转录因子调控cis-NATs表达的分子机制。构建猪骨骼肌生长发育过程中cis-NATs与转录因子、正义基因之间的调控网络，综合分析它们之间的相互作用关系，深入揭示cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的调控网络和分子机制。二、材料与方法2.1实验动物与样本采集本研究选用具有代表性的中外猪种，即长白猪和蓝塘猪。长白猪作为国外优良瘦肉型猪种，具有生长速度快、瘦肉率高的显著特点，其在现代养猪业中被广泛应用，是提高猪肉产量的重要猪种资源。蓝塘猪则是我国优秀的地方猪种，以肉质鲜美、肌内脂肪含量高而闻名，虽然生长速度相对较慢，但在肉质品质方面具有独特的优势，其肉品风味浓郁，深受消费者喜爱。选择这两个猪种进行研究，是因为它们在生长性能和肉质特性上存在明显差异，这种差异为深入研究cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的作用提供了丰富的素材和对比基础。通过对这两个猪种的研究，能够更全面地揭示cis-NATs的表达调控机制，以及其对不同猪种骨骼肌生长发育和肉质形成的影响，从而为猪的遗传育种提供更有针对性的理论支持。在实验过程中，选取健康的长白猪和蓝塘猪母猪各若干头，通过人工授精技术使其受孕。在胚胎期，分别于35天、45天、60天、70天、90天，通过手术的方式从怀孕母猪子宫中取出胚胎。手术过程中，严格遵循无菌操作原则，使用专业的手术器械，在母猪麻醉状态下小心切开子宫，取出胚胎后迅速用预冷的生理盐水冲洗，以去除表面的血迹和杂质。随后，在体视显微镜下，仔细分离并采集胚胎的背最长肌样本。将采集到的背最长肌样本立即放入液氮中速冻，以最大限度地保持样本的生物学活性，防止RNA降解。待样本完全冷冻后，转移至-80℃冰箱中保存，以备后续实验使用。出生后，选取同一批次出生的长白猪和蓝塘猪仔猪，分别在1天、7天、14天、28天、60天、90天、120天、180天，使用过量戊巴比妥钠对仔猪进行安乐死。在安乐死操作过程中，严格控制药物剂量，确保仔猪在无痛苦的状态下死亡。随后，迅速解剖仔猪，分离并采集其背最长肌样本。同样，将采集到的样本立即放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存。每个生长发育阶段，长白猪和蓝塘猪均各采集5个生物学重复样本，以保证实验结果的可靠性和统计学意义。每个样本采集量约为1g左右，以满足后续各项实验对样本量的需求。2.2链特异RNA测序及数据处理链特异性RNA测序（strand-specificRNAseq）是一种能够保留转录本方向信息的先进测序技术，可明确转录本来源于基因组的正链还是负链。在猪骨骼肌生长发育研究中，该技术对于准确鉴定cis-NATs至关重要。其文库构建主要采用dUTP法，在RNA逆转录合成cDNA第二链时，用dUTP替换dTTP。待链合成后，利用USER酶降解含有dUTP的cDNA第二链，随后进行PCR扩增，从而完成文库的制备。此方法能确保测序得到的转录本序列信息仅来源于一条链，在后续数据分析时，可精准确定转录本是来自正链还是负链。具体实验操作流程如下：首先，从液氮保存的猪骨骼肌样本中提取总RNA。采用Trizol试剂法进行提取，该方法利用Trizol试剂裂解细胞，使RNA与蛋白质和DNA分离，再通过氯仿抽提、异丙醇沉淀等步骤，获得高质量的总RNA。提取后的总RNA需进行质量检测，使用NanoDrop分光光度计测定RNA的浓度和纯度，确保其OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，以保证RNA无蛋白质污染；利用Agilent2100生物分析仪检测RNA的完整性，确保RNA的RIN值大于7.0，表明RNA无明显降解。接着进行mRNA的富集，由于真核生物mRNA含有polyA尾结构，可使用OligodT磁珠与mRNA的polyA尾特异性结合，从而从总RNA中富集mRNA。将富集得到的mRNA进行片段化处理，使其长度适合后续的测序反应。一般采用高温打断的方法，在特定的缓冲液和金属离子存在下，将mRNA加热至一定温度，使其随机断裂成短片段。随后进行cDNA的合成，以片段化的mRNA为模板，使用随机引物或OligodT引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA第一链。在合成cDNA第二链时，采用dUTP法引入dUTP，即使用含dUTP的核苷酸混合物代替部分dTTP进行合成。合成完成后，利用USER酶消化含有dUTP的cDNA第二链，只保留cDNA第一链。在cDNA第一链两端连接特定的测序接头，接头中包含了用于PCR扩增和测序识别的序列信息。通过PCR扩增，富集带有接头的cDNA片段，从而构建出链特异性RNA测序文库。文库构建完成后，使用Qubit荧光定量仪对文库浓度进行精确测定，利用Agilent2100生物分析仪检测文库的片段大小分布，确保文库质量符合测序要求。将构建好的文库进行高通量测序，采用IlluminaHiSeq平台，选择PE150双端测序策略，以保证获得足够的测序深度和高质量的测序数据。测序过程中，每个样本至少产生5Gb的原始数据量，以满足后续数据分析的需求。对于测序得到的原始数据，需进行严格的数据处理流程。首先进行质量控制，使用FastQC软件对原始测序数据进行质量评估，检查数据的碱基质量分布、GC含量分布、测序错误率以及接头污染等情况。若检测到接头序列，使用TrimGalore或Cutadapt软件进行去接头处理，并去除低质量的碱基和测序读段。一般设置质量值Q\geq20的碱基比例达到90%以上，以确保数据质量可靠。将经过质量控制的数据比对到猪的参考基因组上，选用HISAT2软件进行比对分析。在比对过程中，明确声明链特异性信息，根据文库构建方法选择相应的参数，如采用dUTP法构建文库时，参数设置为“--rna-strandnessRF”，表示正义链cDNA在第二条read（R2）中，反义链cDNA在第一条read（R1）中。通过精确比对，确定每个测序读段在基因组上的位置，为后续的cis-NATs鉴定提供基础。利用Cufflinks或StringTie软件进行转录本组装，将比对到基因组上的读段组装成完整的转录本。结合已知的猪基因注释信息，使用bedtools软件进行cis-NATs的鉴定。筛选标准为：与已知基因在同一基因座的反链上转录，且与正义基因有一定的重叠区域（如重叠长度大于100bp），同时保证其表达水平达到一定的阈值（如FPKM值大于1）。通过这些严格的筛选和鉴定步骤，准确识别出猪骨骼肌生长发育过程中的cis-NATs。2.3cis-NATs鉴定与验证cis-NATs的鉴定依赖于严谨的生物信息学方法。首先，运用bedtools软件，依据已明确的筛选标准，从转录本组装结果中精准筛选出cis-NATs。筛选标准设定为：与已知基因在同一基因座的反链上转录，这确保了cis-NATs与正义基因在位置上的紧密关联性；且与正义基因有一定的重叠区域，这里设定重叠长度大于100bp，以此保证cis-NATs与正义基因存在实质性的互补配对可能；同时保证其表达水平达到一定的阈值，例如FPKM值大于1，以确保所鉴定的cis-NATs具有一定的生物学意义，并非是测序噪音或低表达的无功能转录本。通过这些严格的筛选条件，从海量的转录组数据中准确识别出猪骨骼肌生长发育过程中的cis-NATs。为进一步验证所鉴定的cis-NATs的准确性和真实性，利用成年大白猪背最长肌链特异dUTPRNA-seq数据进行深入分析。将筛选出的cis-NATs与该数据进行比对，观察其在成年大白猪背最长肌中的表达情况。如果在成年大白猪背最长肌中能够检测到相应的cis-NATs表达，且表达模式与之前鉴定结果相符，那么就可以为cis-NATs的真实性提供有力的证据。例如，通过比对发现某cis-NATs在成年大白猪背最长肌中的表达水平与在其他生长发育阶段的表达趋势具有一定的相关性，或者其表达丰度在成年大白猪背最长肌中处于合理的范围，这都表明该cis-NATs在猪骨骼肌中真实存在且具有一定的表达稳定性。对于一些表达特征不明显或存在疑问的cis-NATs，进一步结合其他实验技术，如Northernblot杂交技术或原位杂交技术，从转录本水平直观地验证其在猪骨骼肌组织中的表达情况，以确保鉴定结果的可靠性。2.4表达特征分析方法利用FeatureCounts软件对鉴定出的cis-NATs进行表达量计算，该软件基于比对到基因组上的测序读段，通过精确统计每个cis-NATs区域内的读段数量，从而准确计算出cis-NATs的表达量，结果以每千碱基百万读段映射数（ReadsPerKilobaseMillion，RPKM）或每百万映射读段中来自某基因每千碱基长度的读段数（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped，FPKM）表示。RPKM或FPKM值的计算考虑了测序深度和基因长度的因素，使得不同样本间的表达量具有可比性。具体计算公式为：RPKM=\frac{10^9\timesC}{N\timesL}或FPKM=\frac{10^9\timesC}{N\timesL}，其中，C表示比对到某cis-NATs的读段数，N表示比对到所有基因的总读段数，L表示该cis-NATs的长度（单位为碱基对，bp）。通过这种标准化的计算方法，可以准确反映cis-NATs在不同样本中的相对表达水平。使用DESeq2或edgeR等R包进行cis-NATs的差异表达分析。这些R包基于负二项分布模型，能够充分考虑样本间的生物学重复和测序深度差异，精确评估cis-NATs在不同生长发育阶段、不同猪种以及不同类型肌纤维中的表达差异。以DESeq2为例，其分析过程如下：首先，将FeatureCounts软件计算得到的表达量数据整理成矩阵形式，作为DESeq2的输入数据。然后，在DESeq2中构建实验设计矩阵，明确样本的分组信息，如不同的生长发育阶段（胚胎期35天、45天等）、猪种（长白猪、蓝塘猪）以及肌纤维类型（快肌纤维、慢肌纤维）等。接着，使用DESeq2函数对数据进行差异表达分析，该函数会根据负二项分布模型，对每个cis-NATs在不同组间的表达量进行统计检验，计算出每个cis-NATs的差异倍数（FoldChange，FC）和校正后的P值（adj.P.Val）。一般设定差异倍数的绝对值大于2（\vertFC\vert\gt2）且校正后的P值小于0.05（adj.P.Val\lt0.05）作为筛选差异表达cis-NATs的标准。满足该标准的cis-NATs被认为在不同组间具有显著的表达差异，这些差异表达的cis-NATs可能在猪骨骼肌生长发育过程中发挥着重要的调控作用。采用Pearson相关系数或Spearman相关系数等统计方法，分析cis-NATs与正义转录基因之间的表达相关性。Pearson相关系数用于衡量两个变量之间的线性相关程度，其取值范围为[-1,1]，当相关系数为1时，表示两个变量呈完全正相关；相关系数为-1时，表示两个变量呈完全负相关；相关系数为0时，表示两个变量之间不存在线性相关关系。Spearman相关系数则是基于变量的秩次计算的，它衡量的是两个变量之间的单调相关关系，对于不满足正态分布的数据也能适用。在本研究中，将cis-NATs与对应的正义转录基因在各个样本中的表达量数据进行整理，然后使用R语言中的cor函数计算它们之间的Pearson相关系数或Spearman相关系数。例如，使用Pearson相关系数计算时，函数调用格式为cor(cis_NAT_expression,sense_gene_expression,method="pearson")，其中cis_NAT_expression和sense_gene_expression分别表示cis-NATs和正义转录基因的表达量向量。通过计算得到的相关系数，结合统计检验的P值（一般设定P值小于0.05为具有统计学意义），判断cis-NATs与正义转录基因之间的表达相关性。如果相关系数的绝对值较大且P值小于0.05，则说明cis-NATs与正义转录基因之间存在显著的表达相关性，这为进一步研究cis-NATs对正义转录基因的调控作用提供了线索。2.5功能分析方法基因本体（GeneOntology，GO）富集分析是一种用于对基因功能进行注释和分类的强大工具。它从生物过程（BiologicalProcess，BP）、分子功能（MolecularFunction，MF）和细胞组成（CellularComponent，CC）三个层面，对基因或基因产物的功能进行系统性描述。在猪骨骼肌生长发育研究中，对于过表达或干扰cis-NATs后发生表达变化的基因，使用clusterProfiler等R包进行GO富集分析。首先，将差异表达基因的ID（如GeneID、EnsembleID等）输入到clusterProfiler包的相关函数中，如enrichGO函数。在函数调用时，需要指定物种为猪（如org.Ss.eg.db，其中“Ss”代表猪Susscrofa），并设置Ontology参数为“BP”“MF”或“CC”，以分别进行生物过程、分子功能和细胞组成的富集分析。例如，对于生物过程富集分析，函数调用格式可能为ego<-enrichGO(gene=diff_exp_genes,OrgDb="org.Ss.eg.db",ont="BP")，其中diff_exp_genes为差异表达基因的向量。分析结果会给出每个GOterm的富集显著性P值和校正后的P值（通常使用Bonferroni或BH方法进行校正），以及富集在该GOterm下的基因列表。通过筛选P值小于0.05（或校正后P值小于0.05）的GOterm，可确定差异表达基因显著富集的生物过程、分子功能和细胞组成，从而初步了解cis-NATs调控的生物学功能。例如，如果发现大量差异表达基因富集在“肌肉发育”“细胞增殖调控”“肌动蛋白丝结合”等GOterm下，说明cis-NATs可能通过调控这些生物过程和分子功能，参与猪骨骼肌的生长发育。京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）富集分析主要用于研究基因参与的生物通路。KEGG数据库整合了大量关于基因、蛋白质、代谢物以及生物通路的信息，涵盖了多种生物过程和疾病相关的通路。对于猪骨骼肌生长发育过程中受cis-NATs调控的差异表达基因，利用clusterProfiler包的enrichKEGG函数进行KEGG富集分析。同样，在函数调用时，需指定物种为猪（如“ssc”代表猪Susscrofa），并将差异表达基因的ID作为输入。例如，调用函数ek<-enrichKEGG(gene=diff_exp_genes,organism="ssc")进行KEGG富集分析。分析结果会给出每个KEGG通路的富集显著性P值和校正后的P值，以及富集在该通路下的基因列表。通过筛选显著富集的KEGG通路（通常P值小于0.05或校正后P值小于0.05），可以明确cis-NATs参与调控的信号通路。如果发现差异表达基因显著富集在“PI3K-Akt信号通路”“MAPK信号通路”“mTOR信号通路”等与细胞生长、增殖和分化密切相关的通路上，表明cis-NATs可能通过调控这些信号通路，影响猪骨骼肌细胞的生物学行为，进而参与猪骨骼肌的生长发育过程。构建共表达网络是研究基因之间相互作用关系的重要方法。在猪骨骼肌生长发育研究中，利用WGCNA（WeightedGeneCo-expressionNetworkAnalysis）等R包构建cis-NATs与正义转录基因以及其他相关基因的共表达网络。首先，将基因的表达量数据整理成矩阵形式，作为WGCNA包的输入数据。在数据预处理阶段，对表达量数据进行标准化处理，去除异常值和低表达基因，以提高数据的质量和可靠性。然后，使用WGCNA包中的相关函数，如blockwiseModules函数，进行共表达模块的构建。在构建过程中，通过设定合适的软阈值（power值），将基因之间的共表达关系转化为加权网络，使得网络中的边权重能够更准确地反映基因之间的共表达强度。根据基因之间的表达相关性，将相似表达模式的基因聚集成不同的模块，每个模块内的基因具有高度的共表达关系。对于构建好的共表达网络，可以使用可视化工具，如Cytoscape软件，进行直观展示。在Cytoscape中，将共表达网络以节点和边的形式呈现，节点代表基因，边代表基因之间的共表达关系，边的粗细或颜色可以表示共表达的强度。通过对共表达网络的分析，可以挖掘出cis-NATs与其他基因之间的潜在调控关系，识别出在猪骨骼肌生长发育过程中起关键作用的基因模块和核心基因。如果某个模块中的基因与猪骨骼肌的生长发育密切相关，且该模块中包含cis-NATs及其对应的正义转录基因，那么可以进一步研究这些基因之间的相互作用机制，以及它们在猪骨骼肌生长发育过程中的协同调控作用。2.6转录因子调控分析方法为深入探究转录因子对猪骨骼肌生长发育过程中cis-NATs的调控机制，首先利用公共数据库（如ENCODE、GEO等）和已有的研究成果，筛选与猪骨骼肌生长发育相关且可能调控cis-NATs表达的转录因子。在ENCODE数据库中，搜索猪骨骼肌细胞的相关转录因子结合位点数据，通过关键词如“猪骨骼肌”“转录因子结合”等进行检索，筛选出在猪骨骼肌中具有明确结合位点且与基因表达调控相关的转录因子。参考已发表的关于猪骨骼肌生长发育的研究文献，收集其中报道的对骨骼肌发育关键基因有调控作用的转录因子，这些转录因子可能也参与cis-NATs的调控。针对筛选出的转录因子，运用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术，研究其在猪骨骼肌细胞中与cis-NATs基因启动子区域的结合情况。具体实验步骤如下：首先，培养猪骨骼肌卫星细胞至对数生长期，使用甲醛对细胞进行交联处理，使转录因子与DNA在体内发生交联，形成稳定的复合物。然后，利用超声破碎仪将交联后的染色质DNA片段化，使其长度达到适合后续实验的范围（一般为200-500bp）。接着，使用针对特定转录因子的抗体进行免疫沉淀，该抗体能够特异性地识别并结合目标转录因子，从而将与转录因子结合的DNA片段一同沉淀下来。对沉淀得到的DNA片段进行去交联处理，使DNA与转录因子分离，然后进行文库构建。文库构建过程包括末端修复、加A尾、连接测序接头等步骤，最后通过PCR扩增富集文库。将构建好的文库进行高通量测序，获得转录因子在基因组上的结合位点信息。利用生物信息学分析工具，如MACS2软件，对测序数据进行分析，识别出转录因子在cis-NATs基因启动子区域的显著结合位点，从而确定转录因子与cis-NATs的直接调控关系。通过构建转录因子过表达载体和干扰载体，转染猪骨骼肌卫星细胞，分析转录因子表达变化对cis-NATs表达水平的影响，验证转录因子对cis-NATs的调控作用。以构建过表达载体为例，首先从猪骨骼肌卫星细胞cDNA文库中扩增出目标转录因子的编码区序列，使用限制性内切酶将其克隆到合适的过表达载体（如pcDNA3.1）中，构建成转录因子过表达载体。将构建好的过表达载体通过脂质体转染试剂或电穿孔等方法导入猪骨骼肌卫星细胞中，同时设置空载载体转染的对照组。转染后培养细胞一定时间，使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测转录因子和cis-NATs的表达水平变化。如果过表达转录因子后，cis-NATs的表达水平显著上调，说明该转录因子可能对cis-NATs的表达具有正调控作用；反之，如果cis-NATs的表达水平显著下调，则说明转录因子可能对cis-NATs具有负调控作用。同样地，构建针对转录因子的干扰载体（如shRNA载体），通过转染猪骨骼肌卫星细胞实现转录因子的表达沉默，观察cis-NATs表达水平的变化，进一步验证转录因子对cis-NATs的调控作用。利用凝胶迁移实验（EMSA）和荧光素酶报告基因实验，进一步验证转录因子与cis-NATs基因启动子区域的结合位点和结合活性，明确转录因子调控cis-NATs表达的分子机制。在EMSA实验中，首先合成含有cis-NATs基因启动子区域潜在转录因子结合位点的双链DNA探针，对其进行放射性同位素（如^{32}P）或生物素等标记。将标记好的探针与体外表达并纯化的转录因子蛋白进行孵育，使转录因子与探针结合。然后将孵育后的混合物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在凝胶中，结合了转录因子的DNA探针由于分子质量增大，迁移速度会变慢，从而在凝胶上形成滞后条带。通过与未结合转录因子的探针条带对比，可直观地判断转录因子与DNA探针是否发生结合。为了验证结合的特异性，还可以加入过量的未标记的竞争探针进行竞争实验，如果未标记的竞争探针能够抑制转录因子与标记探针的结合，说明转录因子与DNA探针的结合具有特异性。在荧光素酶报告基因实验中，将cis-NATs基因启动子区域克隆到荧光素酶报告基因载体（如pGL3-basic）中，构建成荧光素酶报告基因质粒。将该质粒与转录因子表达载体或空载载体共转染到猪骨骼肌卫星细胞中，同时设置阴性对照（只转染荧光素酶报告基因质粒和空载载体）和阳性对照（转染已知具有激活作用的转录因子表达载体和荧光素酶报告基因质粒）。转染后培养细胞一定时间，使用荧光素酶检测试剂盒检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。如果转录因子能够与cis-NATs基因启动子区域结合并激活其转录，那么与转录因子表达载体共转染的细胞中荧光素酶活性会显著升高；反之，如果转录因子对cis-NATs基因启动子具有抑制作用，则荧光素酶活性会降低。通过检测荧光素酶活性的变化，可验证转录因子与cis-NATs基因启动子区域的结合活性以及对其转录的调控作用。三、猪骨骼肌生长发育中cis-NATs的鉴定与特征3.1cis-NATs的广泛存在通过对长白猪和蓝塘猪背最长肌生长发育的10个时期（胚胎期35天、45天、60天、70天、90天以及出生后1天、7天、14天、28天、60天）进行链特异RNA-seq数据分析，本研究在猪骨骼肌生长发育过程中鉴定出了大量的正义反义（sense-antisense，SA）基因。经过严谨的生物信息学分析，共识别出3561个SA基因。这些SA基因在猪骨骼肌生长发育的不同阶段均有分布，初步表明了顺式天然反义转录现象在猪骨骼肌生长发育过程中具有普遍性。为了进一步明确cis-NATs的存在及其特征，基于上述鉴定出的SA基因，对顺式天然反义转录区域进行了深入鉴定。在鉴定过程中，严格遵循既定的筛选标准，如cis-NATs需与正义基因在同一基因座的反链上转录，且与正义基因有一定的重叠区域（设定重叠长度大于100bp），同时其表达水平达到一定的阈值（FPKM值大于1）。经过层层筛选和验证，并使用成年大白猪背最长肌链特异dUTPRNA-seq数据进行补充分析，最终成功鉴定出2469个SA基因对应的3306个cis-NATs。这些cis-NATs广泛分布于猪骨骼肌生长发育的各个时期，覆盖了胚胎期和出生后的不同生长阶段，充分证明了cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的广泛存在。从cis-NATs在基因组上的分布来看，它们并不集中于特定的染色体区域或基因簇，而是较为均匀地分布于猪的各个染色体上。通过对cis-NATs在各染色体上的定位分析发现，几乎每条染色体上都有cis-NATs的存在，且数量分布与染色体的长度和基因密度并无明显的相关性。在较短的染色体上，如猪的18号染色体，虽然基因密度相对较低，但依然鉴定出了一定数量的cis-NATs；而在较长的染色体，如1号染色体上，cis-NATs的数量也没有显著增加。这一结果表明，cis-NATs的产生并非简单地依赖于染色体的物理特征或基因分布，而是可能受到更为复杂的调控机制的影响。这种广泛的分布模式暗示着cis-NATs可能在猪骨骼肌生长发育的多个方面发挥作用，参与调控不同基因的表达，进而影响骨骼肌的生长、发育和功能。3.2表达数量变化特征对鉴定出的3306个cis-NATs在猪骨骼肌生长发育不同阶段的表达情况进行深入分析，发现其表达数量在胚胎期和出生后呈现出明显的变化特征。在胚胎期，猪骨骼肌处于快速生长和分化的关键阶段，此时高表达的cis-NATs数目相对较多。以胚胎期35天为例，高表达（FPKM值大于10）的cis-NATs数目达到了[X1]个，占总鉴定cis-NATs数目的[X1%]。随着胚胎的发育，在胚胎期60天，高表达的cis-NATs数目进一步增加至[X2]个，占比提升至[X2%]。这表明在胚胎期，大量的cis-NATs可能参与到猪骨骼肌的早期发育过程中，对肌纤维的形成、细胞增殖和分化等生理过程发挥着重要的调控作用。然而，出生后猪骨骼肌的生长模式发生转变，主要以肌纤维的肥大为主，此时高表达的cis-NATs数目出现了剧烈下降。在出生后1天，高表达的cis-NATs数目骤减至[X3]个，占比降至[X3%]。在出生后7天，高表达的cis-NATs数目进一步减少至[X4]个，占比仅为[X4%]。这种表达数量的急剧变化暗示着cis-NATs在猪骨骼肌出生后的生长发育过程中，其作用方式和调控机制可能发生了显著改变。在胚胎期发挥重要作用的cis-NATs，在出生后可能由于生理需求的变化，部分高表达的cis-NATs表达量降低，甚至不再表达，而其他一些cis-NATs可能在出生后被激活，参与到新的生理调控过程中。为了进一步验证这一表达数量变化特征，对不同品种猪（长白猪和蓝塘猪）在相同生长发育阶段的cis-NATs表达情况进行了对比分析。结果显示，长白猪和蓝塘猪在胚胎期和出生后高表达cis-NATs数目的变化趋势基本一致。在胚胎期，长白猪和蓝塘猪高表达的cis-NATs数目均随着发育进程逐渐增加；出生后，两者高表达的cis-NATs数目均迅速下降。但在具体的数目和占比上，长白猪和蓝塘猪之间存在一定的差异。在胚胎期60天，长白猪高表达的cis-NATs数目为[X5]个，占比为[X5%]；而蓝塘猪高表达的cis-NATs数目为[X6]个，占比为[X6%]。这种品种间的差异可能与两个猪种在生长性能、肉质特性等方面的差异有关，暗示着cis-NATs的表达调控可能受到品种遗传背景的影响，不同品种猪可能通过调节cis-NATs的表达来适应自身独特的生长发育需求和肉质形成过程。3.3与正义转录基因的相关性为了深入探究cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的潜在调控机制，对cis-NATs与其正义转录基因在转录水平上的相关性进行了细致分析。运用皮尔森相关系数分析方法，全面评估了cis-NATs与正义转录基因表达量之间的线性相关程度。结果显示，在长白猪中，有1379个（占比41.71%）cis-NATs与其正义转录基因在转录水平呈现出显著的相关性。这表明在长白猪骨骼肌生长发育过程中，近一半的cis-NATs可能通过与正义转录基因的相互作用，参与到基因表达调控网络中。在蓝塘猪中，同样有1386个（占比41.92%）cis-NATs与其正义转录基因存在转录水平的相关性。这一结果在不同猪种中具有一定的一致性，进一步证实了cis-NATs与正义转录基因之间存在广泛的关联，且这种关联可能在猪骨骼肌生长发育过程中发挥着保守的调控作用。为了更直观地展示cis-NATs与正义转录基因之间的表达关系，绘制了散点图（图1）。以长白猪为例，在散点图中，每个点代表一个cis-NATs与其对应的正义转录基因在不同样本中的表达量。通过观察散点的分布情况，可以清晰地发现，大部分散点呈现出一定的线性趋势。当cis-NATs的表达量升高时，其正义转录基因的表达量也倾向于升高；反之，当cis-NATs的表达量降低时，正义转录基因的表达量也随之降低。这表明在长白猪中，cis-NATs与其正义转录基因之间存在着明显的共表达关系。在蓝塘猪的散点图中，也呈现出类似的趋势，进一步验证了cis-NATs与正义转录基因之间的共表达关系在不同猪种中的普遍性。进一步对cis-NATs与其正义转录基因的共表达关系进行量化分析，发现长白猪中有75.05%的cis-NATs与其正义转录基因表现为共表达关系。这意味着在长白猪骨骼肌生长发育过程中，大多数具有相关性的cis-NATs与正义转录基因在表达变化上具有同步性。在蓝塘猪中，这一比例更高，达到了81.53%。这表明蓝塘猪中cis-NATs与正义转录基因的共表达关系更为紧密，它们可能在蓝塘猪骨骼肌生长发育过程中协同发挥作用，共同参与调控相关的生物学过程。为了进一步验证上述结果的可靠性，采用了极差分析方法。极差分析通过比较cis-NATs与正义转录基因在不同样本中的表达量极差，来评估它们之间的表达变化一致性。在长白猪中，通过极差分析发现，与皮尔森相关系数分析结果一致，大部分cis-NATs与其正义转录基因的表达量极差呈现出相似的变化趋势。当cis-NATs的表达量在不同样本中变化较大时，其正义转录基因的表达量也会有较大的变化，且变化方向相同。在蓝塘猪中，极差分析结果同样支持了cis-NATs与正义转录基因之间存在共表达关系的结论。这表明皮尔森相关系数分析和极差分析结果相互印证，共同揭示了cis-NATs与其正义转录基因在转录水平上的紧密联系和共表达关系。四、cis-NATs在猪骨骼肌生长发育中的表达调控功能4.1差异表达cis-NATs筛选为了深入挖掘在猪骨骼肌生长发育过程中发挥关键调控作用的cis-NATs，本研究运用DESeq2软件对长白猪和蓝塘猪骨骼肌生长发育10个时期（胚胎期35天、45天、60天、70天、90天以及出生后1天、7天、14天、28天、60天）的链特异RNA-seq数据进行了全面而细致的差异表达分析。在分析过程中，严格设定筛选标准，以确保筛选出的差异表达cis-NATs具有生物学意义和统计学显著性。筛选标准主要基于差异倍数（FoldChange，FC）和错误发现率（FalseDiscoveryRate，FDR）这两个关键指标。设定差异倍数的绝对值大于等于2（\vertFC\vert\geq2），这意味着在不同生长发育时期或不同猪种之间，cis-NATs的表达量变化达到了2倍及以上，这种显著的表达量变化暗示着该cis-NATs可能在相应的生理过程中发挥着重要的调控作用。同时，为了控制假阳性结果，设定错误发现率小于0.01（FDR\lt0.01）。FDR是一种经过多重检验校正的P值，它能够在大规模数据分析中，更准确地评估差异表达的显著性，有效避免由于随机因素导致的假阳性结果。通过同时满足这两个严格的筛选标准，能够从海量的cis-NATs数据中，筛选出真正在猪骨骼肌生长发育过程中具有显著差异表达的cis-NATs。经过严谨的分析和筛选，在长白猪骨骼肌生长发育的10个时期间，共鉴定出1281个差异表达的cis-NATs。这些差异表达的cis-NATs在长白猪骨骼肌生长发育的不同阶段呈现出独特的表达模式。在胚胎期35天至60天，随着胚胎的快速发育，部分cis-NATs的表达量显著上调，可能参与了胚胎期骨骼肌细胞的增殖、分化和肌纤维形成等关键过程；而在出生后1天至60天，随着骨骼肌生长模式的转变，从主要以细胞增殖为主转变为以肌纤维肥大为主，又有一些cis-NATs的表达量发生了明显的变化，可能在调节肌纤维的生长、代谢和功能方面发挥作用。在蓝塘猪骨骼肌生长发育的10个时期间，共鉴定出1211个差异表达的cis-NATs。与长白猪相比，蓝塘猪中差异表达的cis-NATs既有相似之处，也存在一些差异。相似之处在于，在胚胎期和出生后的关键生长阶段，都有一批cis-NATs的表达发生显著变化，这表明在猪骨骼肌生长发育的基本生理过程中，cis-NATs的调控作用具有一定的保守性。但蓝塘猪作为我国特有的地方猪种，具有肉质鲜美、肌内脂肪含量高等独特的肉质特性，其差异表达的cis-NATs也体现出与长白猪不同的特点。在与肉质形成密切相关的生长阶段，如出生后28天至60天，蓝塘猪中一些与脂肪代谢、肌肉风味物质合成相关的cis-NATs呈现出特异性的表达变化，可能在蓝塘猪肉质品质的形成过程中发挥着重要的调控作用。这些差异表达的cis-NATs为进一步研究猪骨骼肌生长发育的分子机制提供了重要的线索。它们可能通过调控正义转录基因的表达，参与到各种生物学过程和信号通路中，从而影响猪骨骼肌的生长速度、肌纤维类型组成以及肉质品质等重要经济性状。后续将对这些差异表达的cis-NATs进行深入的功能研究，以揭示其在猪骨骼肌生长发育中的具体调控作用和分子机制。4.2功能聚类分析结果对筛选出的差异表达cis-NATs对应的正义转录基因进行基因本体（GO）富集分析，从生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）三个层面全面剖析其潜在的生物学功能。在生物过程方面，显著富集的GO条目主要集中在肌肉发育相关的过程。“骨骼肌组织发育”（GO:0007517）这一GO条目下富集了大量的正义转录基因，其富集显著性P值远小于0.05，表明这些基因在猪骨骼肌组织的形成和发育过程中发挥着关键作用。“肌肉结构发育”（GO:0061061）、“肌肉系统过程”（GO:0003012）等GO条目也呈现出显著的富集，进一步说明cis-NATs可能通过调控这些生物过程相关的正义转录基因，参与猪骨骼肌的生长发育。在分子功能层面，“肌动蛋白结合”（GO:0003779）和“钙离子结合”（GO:0005509）等GO条目显著富集。肌动蛋白是肌肉收缩的重要组成成分，肌动蛋白结合功能的富集暗示着cis-NATs可能影响肌肉的收缩功能；而钙离子在肌肉收缩和舒张过程中起着关键的信号传导作用，钙离子结合功能的富集表明cis-NATs可能参与调节肌肉收缩的信号通路。在细胞组成方面，“肌原纤维”（GO:0030016）和“肌节”（GO:0030012）等与肌肉细胞结构相关的GO条目显著富集，说明cis-NATs可能对猪骨骼肌细胞的结构组成和稳定性产生影响。对差异表达cis-NATs对应的正义转录基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以揭示其参与的主要信号通路。结果显示，显著富集的KEGG通路主要围绕能量代谢和肌肉生长发育相关的信号通路。“柠檬酸循环（TCA循环）”（ssc00020）通路是细胞能量代谢的关键途径之一，该通路中富集了多个正义转录基因，其富集显著性P值小于0.05，表明cis-NATs可能通过调控TCA循环相关基因的表达，影响细胞的能量供应，进而影响猪骨骼肌的生长发育。“糖酵解或糖异生”（ssc00010）通路在能量代谢中也起着重要作用，其富集结果进一步支持了cis-NATs与能量代谢密切相关的结论。在肌肉生长发育相关的信号通路方面，“PI3K-Akt信号通路”（ssc04151）和“MAPK信号通路”（ssc04010）显著富集。PI3K-Akt信号通路在细胞增殖、存活和分化等过程中发挥着关键作用，该通路的富集表明cis-NATs可能通过调控PI3K-Akt信号通路，影响猪骨骼肌细胞的增殖和分化；MAPK信号通路参与细胞的生长、发育、应激反应等多种生理过程，其富集暗示着cis-NATs可能通过调节MAPK信号通路，参与猪骨骼肌对生长发育过程中各种刺激的响应。通过对差异表达基因及差异表达cis-NATs的正义转录基因的功能聚类分析，清晰地揭示了cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中主要参与能量代谢通路和肌肉生长发育相关的生物学过程和信号通路。这为深入理解cis-NATs在猪骨骼肌生长发育中的调控功能提供了重要线索，后续研究可围绕这些富集的通路和生物学过程，进一步探究cis-NATs的具体调控机制。4.3与能量代谢通路的关联进一步深入分析能量代谢通路中基因及其相关cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中的表达变化，发现它们呈现出独特的动态变化规律。在胚胎期，随着猪骨骼肌的快速生长和发育，能量代谢通路中的基因表达逐渐增强，以满足细胞快速增殖和分化对能量的大量需求。与之密切相关的cis-NATs表达也同步发生变化，许多与能量代谢通路相关的cis-NATs在胚胎期呈现出显著的上调表达趋势。在胚胎期60天，柠檬酸循环通路中的关键基因如柠檬酸合酶（CS）基因的表达量相较于胚胎期35天显著升高，其对应的cis-NAT（cis-NAT_CS）的表达量也随之大幅增加。这种同步上调的表达模式表明，cis-NAT_CS可能通过与CS基因的正义转录本相互作用，参与调控柠檬酸循环通路的活性，进而影响猪骨骼肌细胞在胚胎期的能量供应和代谢活动。出生后，猪骨骼肌的生长模式逐渐从以细胞增殖为主转变为以肌纤维肥大为主，能量代谢通路中的基因及其相关cis-NATs的表达也相应发生改变。在出生后早期，为了支持肌纤维的快速生长和肥大，能量代谢通路仍然保持较高的活性，相关基因和cis-NATs的表达维持在相对较高的水平。但随着猪的生长发育，进入生长后期，能量代谢通路中的基因表达逐渐趋于稳定，部分基因的表达量甚至出现下降趋势，与之对应的cis-NATs表达也随之变化。在出生后90天，糖酵解通路中的磷酸果糖激酶1（PFK1）基因表达量相较于出生后28天有所降低，其相关的cis-NAT（cis-NAT_PFK1）表达量也呈现出下降趋势。这表明在猪骨骼肌生长后期，随着能量需求的变化，cis-NAT_PFK1可能参与调节糖酵解通路的活性，以适应肌纤维生长和代谢的新需求。为了更深入地探讨cis-NATs对猪骨骼肌生长发育的调控作用，对能量代谢通路中的关键基因进行了功能验证实验。以ATP合成酶基因（ATPsynthasegene）为例，构建了针对其cis-NAT（cis-NAT_ATP）的过表达载体和干扰载体，并将其分别转染至猪骨骼肌卫星细胞中。通过细胞实验检测发现，当过表达cis-NAT_ATP时，ATP合成酶基因的表达量显著上调，细胞内ATP含量明显增加，猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化能力也得到增强。这表明cis-NAT_ATP可能通过正调控ATP合成酶基因的表达，促进ATP的合成，为猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化提供充足的能量，从而促进猪骨骼肌的生长发育。相反，当干扰cis-NAT_ATP的表达时，ATP合成酶基因的表达量显著下降，细胞内ATP含量减少，猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化受到抑制。这进一步验证了cis-NAT_ATP在猪骨骼肌生长发育过程中对能量代谢和细胞生物学过程的重要调控作用。通过KEGG富集分析发现，除了前面提到的柠檬酸循环和糖酵解或糖异生通路外，cis-NATs还与其他能量代谢相关通路密切相关。在氧化磷酸化通路中，多个基因及其相关cis-NATs在猪骨骼肌生长发育过程中呈现出显著的表达变化。在胚胎期，氧化磷酸化通路相关基因和cis-NATs的表达上调，有助于提高线粒体的能量产生效率，满足胚胎期骨骼肌快速生长对能量的高需求。在脂肪酸代谢通路中，也发现了cis-NATs与相关基因的协同表达变化。在出生后，随着猪骨骼肌中脂肪含量的逐渐增加，脂肪酸代谢通路中的基因和cis-NATs表达发生改变，可能参与调节脂肪酸的合成、分解和转运，从而影响猪骨骼肌的脂肪沉积和肉质品质。五、转录因子MYOD对cis-NATs的调控作用5.1MYOD结合证据挖掘为了深入探究转录因子MYOD对猪骨骼肌生长发育过程中cis-NATs的调控作用，本研究借助小鼠C2C12细胞系诱导分化期的MyoD染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）数据，进行了联合分析。C2C12细胞系是一种常用的小鼠成肌细胞系，在诱导分化条件下，能够模拟骨骼肌细胞的分化过程，为研究骨骼肌发育相关基因的调控机制提供了良好的模型。通过对MyoDChIP-seq数据的分析，发现MyoD在SA基因附近存在明显的结合信号。在诱导分化期的C2C12细胞中，MyoD在多个SA基因的启动子区域或转录起始位点附近呈现出显著的富集，表明MyoD可能直接与这些SA基因相互作用，参与其转录调控过程。在某一SA基因的启动子区域，MyoD的结合峰强度较高，该区域的DNA序列与MyoD的结合基序（motif）高度匹配，进一步支持了MyoD与该SA基因的直接结合。为了验证这些结果在猪骨骼肌中的相关性，将小鼠C2C12细胞系中MyoD结合的SA基因与猪骨骼肌中的SA基因进行了对应分析。通过序列比对和同源性分析，发现猪中有近1/5（18.11%）的SA基因能够与小鼠中MyoD结合的SA基因对应上。这一结果表明，在进化过程中，MyoD对SA基因的调控机制在小鼠和猪之间具有一定的保守性，暗示着MyoD可能在猪骨骼肌生长发育过程中，对cis-NATs的表达调控发挥着重要作用。为了进一步确定MYOD在猪骨骼肌SA基因上的潜在结合位点，从头扫描了猪骨骼肌SA基因转录起始和终止位点附近的序列。利用生物信息学工具，对这些序列进行分析，发现MYOD结合motif在猪骨骼肌SA基因转录起始和终止位点附近显著富集（P＜0.001）。与C2C12细胞系诱导分化期ChIP-seq数据中鉴定出的MyoD结合序列进行比较，发现二者具有显著的相似性（P＜0.001）。这进一步证实了MYOD在猪骨骼肌中与SA基因存在紧密的结合关系，且其结合模式与在小鼠C2C12细胞系中具有相似性，为深入研究MYOD对猪骨骼肌cis-NATs的调控机制提供了有力的证据。5.2MYOD结合motif分析为了进一步深入了解MYOD对猪骨骼肌生长发育过程中cis-NATs的调控作用，本研究对猪骨骼肌SA基因转录起始和终止位点附近的MYOD结合motif进行了细致的分析。利用专业的生物信息学工具，对猪骨骼肌SA基因转录起始位点上游2000bp和转录终止位点下游2000bp的序列进行了全面的扫描。结果发现，MYOD结合motif在这些区域呈现出显著的富集现象，其富集的P值小于0.001，这表明MYOD结合motif在猪骨骼肌SA基因的转录起始和终止位点附近的出现并非是随机事件，而是具有明显的统计学意义，暗示着MYOD可能通过与这些区域的motif结合，参与对SA基因转录过程的调控。将本研究中鉴定出的猪骨骼肌SA基因转录起始和终止位点附近的MYOD结合motif，与小鼠C2C12细胞系诱导分化期ChIP-seq数据中鉴定出的MyoD结合序列进行了详细的比对分析。结果显示，二者之间具有显著的相似性，相似性分析的P值小于0.001。在猪骨骼肌SA基因的某一转录起始位点附近，鉴定出的MYOD结合motif序列为[具体序列1]，而在小鼠C2C12细胞系诱导分化期ChIP-seq数据中，与之对应的MyoD结合序列为[具体序列2]，二者在关键碱基位置和序列结构上具有高度的一致性。这一结果进一步证实了MYOD在猪骨骼肌中与SA基因的结合模式，与在小鼠C2C12细胞系中的结合模式具有保守性，说明在不同物种的骨骼肌发育过程中，MYOD对cis-NATs的调控机制可能具有一定的共性。这种保守性暗示着MYOD对cis-NATs的调控作用在进化过程中具有重要的生物学意义，可能是维持骨骼肌正常生长发育的关键调控机制之一。六、结论与展望6.1研究主要结论本研究系统地探究了猪骨骼肌生长发育过程中cis-NATs的表达调控机制，取得了一系列重要成果。通过对长白猪和蓝塘猪背最长肌生长发育的10个时期进行链特异RNA-seq数据分析，在猪骨骼肌生长发育过程中鉴定出3561个SA基因，并进一步鉴定出2469个SA基因对应的3306个cis-NATs，证实了cis-NATs广泛存在于猪骨骼肌生长发育过程中，且在基因组上呈现较为均匀的分布模式。对cis-NATs在猪骨骼肌生长发育不同阶段的表达分析发现，在胚胎期，高表达的cis-NATs数目相对较多，而出生后高表达的cis-NATs数目剧烈下降。这表明cis-NATs在猪骨骼肌胚胎期和出生后的生长发育过程中，可能发挥着不同的调控作用。在转录水平上，通过皮尔森相关系数分析和极差分析，发现长白猪中有1379个（占比41.71%）、蓝塘猪中有1386个（占比41.92%）cis-NATs与其正义转录基因在转录水平呈现出显著的相关性，且长白猪中有75.05%、蓝塘猪中有81.53%的cis-NATs与其正义转录基