DB12∕T 1006-2020 茄子黄萎病菌土壤带菌 PCR 检测技术规程

ICS65.020.01DB12TechnicalregulationofPCRdetectionforverticilliumdahliaeinsoil天津市市场监督管理委员会发布IDB12/T1006—2020本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市植物保护研究所。本标准主要起草人：高苇、王勇、杨利娟、贲海燕、张春祥、刘晓琳、姚玉荣、王万立。DB12/T1006—20201茄子黄萎病菌土壤带菌PCR检测技术规程本标准规定了茄子黄萎病菌的PCR检测的仪器和试剂、土壤取样、PCR检测、结果判定、土样及资料保存。本标准适用于土壤中茄子黄萎病菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订版）均适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T36197-2018土壤质量土壤采样技术指南GB/T36199-2018土壤质量土壤采样程序设计指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1茄子黄萎病菌verticilliumwiltofeggplant茄子黄萎病菌大丽轮枝菌（VerticilliumdahliaKleb.）可以侵染多种植物引起一种土传的维管束病害，病菌可在土壤中长期存活，是茄果类作物生产中危害最为严重的土传病害。茄子黄萎病菌的基本信息参见附录A。3.2微菌核verticilliumwiltofeggplant茄子黄萎病菌生长过程中，一条或多条菌丝体膨大、细胞壁增厚后，多向芽殖而形成的多细胞结构，该结构为肉眼可见的黑色菌丝颗粒。3.3土壤带菌soil-borne土壤中携带能够诱发侵染植株发病的病原菌。4仪器和试剂4.1主要仪器涡旋振荡仪、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、聚合酶链式反应仪（PCR仪）、水浴锅、电子天平（感量0.1g和0.1mg）、电泳仪、凝胶成像仪。4.2主要试剂DB12/T1006—20202水饱和酚、三氯甲烷、液氮、异丙醇、无水乙醇、DNA荧光染料（GelRed）、Tris-HCl等。DNA分子量标准（DNAMarker，能够区分100bp～1000bp的DNA片段）。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）抽提液：2%CTAB，100mmol/LTris·Cl（pH8.020mmol/LEDTA（pH8.01.4mol/L氯化钠。PCR反应混合物：2×MasterMix:TaqDNA聚合酶，2×PCR反应缓冲液，dNTP混合物等。10×TAE电泳缓冲液：242gTris-base，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）加蒸馏水至1000mL，使用时稀释10倍。除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682要求。5待测土壤取样土壤采样按照GB/T36199-2018和GB/T36197-2018的有关要求进行，每块栽培地（面积667m2左右）按照“S”采样法设置15个采样点，使用不锈钢土壤取样器采集0～40cm耕层土样，将所有采样点土壤混匀后放入采样袋中。6检测与鉴定6.1土壤样品预处理将采集的土壤样品送回实验室后，打开采样袋在室内自然风干（自然风干时间不能超过24h），然后采用2mm孔径的土壤筛过滤土壤，过滤后的土样进行检测。6.2样品总DNA的提取每个样品设置3个重复3个平行，每个重复称取1g土样，放入灭菌的研钵中，加入液氮充分研磨。向研钵中加入4mL预热的CTAB抽提液，倒入15mL灭菌离心管中，反复震荡混合后，65℃水浴30min，4℃14000g离心10min，保留上清液。取上清液，加入等体积水饱和酚，充分混匀后，4℃14000g离心10min。取上清液，加入等体积的三氯甲烷:异戊醇（24:1），4℃14000g离心10min。继续三氯甲烷:异戊醇（24:1）抽提，直至有机相和水相之间无蛋白层为止。吸取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇混匀，4℃14000g离心10min，可见DNA沉淀。弃去上清液，70％冷乙醇，漂洗DNA沉淀2次～3次，充分风干后溶解于适量去离子水中。6.3PCR检测将得到的土壤DNA样品进行10倍、100倍和1000倍梯度稀释，取DNA原液和稀释后的各梯度DNA溶液各1μL，加入到PCR反应体系中进行扩增反应。同时，设置阴性对照和阳性对照（阴性对照为不含茄子黄萎病菌1g土壤提取的DNA，阳性对照为含茄子黄萎病菌1g土壤提取的DNA），空白对照为未加入DNA模板。具体PCR检测方法见附录B。7结果判定7.1阳性对照经PCR扩增反应后出现334bp大小的条带，而阴性对照和空白对照不出现任何条带，试验结果成立，反之不成立。DB12/T1006—202037.2在试验结果成立的前提下，土壤样品DNA扩增出与阳性对照一致的334bp条带，则说明土壤中存在茄子黄萎病菌，否则则说明不存在黄萎病菌。8土样及资料保存检测判定完成后，土壤样品保存方法按照GB/T36197-2018有关要求执行。检测判定过程及有关数据、表格要进行详细记录并归档保存。DB12/T1006—20204（资料性附录）茄子黄萎病菌的分类地位、病原特征及发病症状A.1病原及其分类地位从梗菌科（Moniliaceae），轮枝菌属（Verticillium）。已报道的茄子黄萎病的病原菌为黑白轮枝菌（V.albo-atrum）和大丽轮枝菌（V.dahliae）。而我国国内对于茄子黄萎病的病原鉴定结果均为大丽A.2病原特征茄子黄萎病病原大丽轮枝菌（V.dahliae寄主范围广泛，可以危害茄子、棉花、草莓、马铃薯、辣椒等多200多种农作物，其形成的微菌核在无寄主的土壤中可存活10年以上，是主要的初侵染源。A.3症状及危害茄子黄萎病在茄子整个生长期均有发生，在门茄坐果时表现出症状，盛果期最为严重。茄子黄萎病发病时，下部叶片叶脉间或叶缘产生淡黄色斑点，逐渐发展到半边叶片或整个叶片变黄，发病严重导致病叶大量脱落。茄子黄萎病多数从一边开始发病，另外半边正常，俗称“半边疯”。解剖病株可发现根、茎、分枝以及叶柄等部位维管束变成褐色。茄子黄萎病田间症状如图A.1所示。图A.1茄子黄萎病田间症状DB12/T1006—20205（规范性附录）茄子黄萎病病原PCR检测方法B.1茄子黄萎病病原特异性引物Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’引物序列：Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’该特异引物扩增序列信息：上游引物Vd-ITS1-45-F1ccggtccatcagtctctctgtttataccaacgatacttctgagtgttcttagcgaactat61taaaacttttaacaacggatctcttggctctagcatcgatgaagaacgcagcgaaacgcg121atatgtagtgtgaattgcagaattcaggaatcatcgaatctttgaacgcacatggcgcct181tccagtatcctgggaggcatgcctgtccgagcgtcgtttcaaccctcgagccccagtggc241ccggtgttggggatctacgtctgtaggcccttaaaagcagtggcggacccgcgtggccct301tcctatgcgtagtagttacagctcgcatcggagt下游引物Vd-ITS1-379-RB.2PCR扩增按下列组分制备PCR反应体系50μL，反应同时阴性对照和空白对照，具体反应体系见表B.1。将下列B.1PCR反应体系中各组分加入PCR反应管中，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。表B.1PCR反应体系体积(μL）EeraldAmpMaxPCRMasterMix（2×MasterMixCodeRR320）1