（正式版）DB37∕T 3005-2017 《猪流行性腹泻病毒分离与R∕T-PCR检测技术》

DB37/T3005—2017猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术2017-09-18实施2017-09-18实施IDB37/T3005—2017本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：吴家强、陈智、陈蕾、赵鹏伟、郭立辉、于江、李俊、杜以军、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。本标准为首次发布。DB37/T3005—2017猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术本标准规定了猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术的要求。本标准适用于猪肠道内容物、排泄物或乳汁样品中猪流行性腹泻病毒的分离与检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法下列缩略语适用于本文件。DEPC水：DEPC(Diethypyrocarbonate)处理并灭菌后的去离子水。DMEM:细胞培养基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)。PEDV:猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus)。双抗：青霉素、链霉素混合液(Penicillin-StreptomycinSolution)。CPE:致细胞病变效应(cellcytopathiceffect)。4仪器与试剂除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》,所用化学试剂应为分析纯。4.1病毒分离需要的仪器与试剂4.1.220000g高速冷冻离心机。4.1.3高压灭菌锅。4.1.437℃二氧化碳细胞箱。4.1.5II级生物安全柜。4.1.6超低温冰箱：可控温至-70℃。4.1.7PBS。4.1.8双抗(100×)(青霉素10000IU/mL,链霉素10000μg/mL)。4.1.10Vero细胞。4.1.11新生胎牛血清。工2DB37/T3005—20174.1.13一次性25cm²细胞培养瓶。4.2RT-PCR检测需要的仪器与试剂4.2.220000g高速冷冻离心机。4.2.3PCR仪。4.2.4高压灭菌锅。4.2.5普通冰箱。4.2.6超低温冰箱：可控温至-70℃。4.2.7PBS。外R5'-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3',PEDV内F5'-GGGCG5'-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3'。5.1样品采集采集腹泻猪的排泄产物0.5g～0.7g或采集乳汁0.5mL～0.7mL。采集小肠肠道内容物1g～1.2g。将样品按1:4的比例加入PBS,混匀并反复冻融2～3次后，以2000r/min,4℃离心5min,取上清，12000r/min4℃离心15min,收取上清，过滤除菌置于-70℃保存备用。的比例添加处理好的上清，同时加入终浓度为5μg/mL的胰酶，37℃吸附1h(注意期间每隔20min轻摇一次)。之后加入终浓度为5μg/mL胰酶的维持液(不含血清)。37℃培养3d,其间逐日观察。传代的细胞培养物反复冻融3次，收取病毒液。用同样的方法盲传3代。每次传代均设不接病毒但含相同胰酶浓度的对照组细胞。鉴定方法详见5.4。5.4病毒RT-PCR检测技术3DB37/T3005—20175.4.1样品RNA的提取冰上静置5min。5.4.1.2加入200μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀，冰上放置5min后，以12000rpm4℃离心15min。5.4.1.3吸取500μL上清转移至新1.5mL离心管中rpm4℃离心15min。5.4.1.4弃去上清，用1mL预冷的75%乙醇轻轻冲洗1.5mL离心管，以12000rpm4℃离心5min。5.4.1.5弃去上清，以7500rpm4℃离心5min,吸取残留液体，在冰盒上静置5min～15min,使5.5第一链cDNA合成5.5.1反转录反应体系反转录反应体系，详见附录B.1将配好的反应体系轻轻混匀，如用0ligo(dT)18(0.1μg/μL),42℃孵育30min。如用Random具体参数详见附录B.2。外PCR反应条件：95℃,5min;94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;30cycle;72℃,进行内PCR反应时，以外PCR产物为模板，进行套式扩增，反应条件与外PCR的反应条件一致。6.1病毒分离检测6.2样品检测阳性对照有420bp条带出现，阴性对照无420bp条带出现，实验没有420bp条带判为阴性。4(资料性附录)试剂的配制A.175%乙醇无水乙醇75mLA.21%琼脂糖凝胶琼脂糖0.6g0.5×TAE缓冲液60mLA.3细胞生长液含10%的胎牛血清和1%双抗的DMEM。A.4胰酶称取10mg溶于10mL去离子水中，充分溶解后0.22μm滤器过滤除菌，分装灭菌的1.5mL离心管，-20℃保存。A.5接种病毒后维持液含1%双抗的(不含血清)。5DB37/T3005—2017(规范性附录)RT-PCR反应体系表B.1反转录反应体系成分12×TSReactionMix成分2RandomPrimer(N19)(0.1μg/μL)成分3EasyScriptTMRTEnzymeMix成分4RNA50ng~5μg成分5DEPC水补至20μL成分12μL