（正式版）DB37∕T 2995-2017 《副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术》

DB37/T2995—2017副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术2017-09-18实施2017-09-18实施IDB37/T2995—2017本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：吴家强、于江、郭立辉、张玉玉、杜以军、李俊、陈蕾、陈智、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。本标准为首次发布。DB37/T2995—2017副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术本标准适用于猪血液、组织及细菌培养物中副猪嗜血杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法下列术语和定义适用于本文件。3.1每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。5仪器与试剂除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。5.3荧光定量PCR仪。5.5恒温培养箱。5.6-20℃冰箱。5.7二级生物安全柜。5.8超低温冰箱：可控温至-70℃。5.10一次性无菌5mL注射器。工DB37/T2995—201725.120.2mLPCR薄壁管或八联管。5.14SYBRGreenI核酸染料(含酶)。5.15蛋白酶K(见附录A.1)。5.1610%SDS液(见附录A.2)。5.1770%乙醇(见附录A.3)。5.18引物：P1:5'-ACCAGAAGCAAACCCAGAGC-3',P2:5'-ACACCGCTTGCCATACCCTC-3'。5.19标准阳性对照：HPSinfB基因阳性质粒。5.20标准阴性对照：无菌超纯水。6.1.1活体采样：无菌采集抗凝血。6.1.2病死猪采样：无菌采集心包积液或胸腔积液或肺脏组织。6.1.3细菌培养物：37℃培养24h～48h的细菌培养物。6.2.1组织样品处理：取肺脏组织3g～5g于研钵中，用灭菌剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研6.2.2细菌培养物处理：挑取3～4个细菌单菌落加入100μL灭菌水中，煮沸10min后，再放置-20℃冻结。冻融后，10000r/min离心5min,取上清作为DNA模板，-20℃保存备用。6.3.1取样品500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的SDS溶液25μL,55℃水浴2h～3h。6.3.3取上清于一新的离心管中，加入200μLTris饱和酚和200μL氯仿，10000r/min离心15min。6.3.5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静止20min,10000r/min离心15min,弃上清。6.3.6加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。6.4荧光定量PCR反应体系DB37/T2995—201737.1.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。7.1.2阳性对照Ct值<30,并出现特定扩增曲线，否则，此试验视为无效。Ct值>35,表明样品为阴性。Ct值<30,且出现特定扩增曲线，表明样品中存在HPS。30≤Ct值≤35的样品须重检，结果仍然在该区间，判定为阳性。4DB37/T2995—2017(资料性附录)试剂的配制蛋白酶K灭菌双蒸水5mL十二烷基硫酸钠灭菌双蒸水浓盐酸灭菌双蒸水80mL无水乙醇灭菌双蒸水70mL30mLDB37/T2995—20175(规范性附录)组分反应体