疮痂病链霉菌中调控蛋白SCAB

摘要引发植物块茎疮痂病的主要病原菌之一是疮痂链霉菌，深入剖析其致病机制对病害防控意义重大，本研究以在疮痂链霉菌中有关键调控作用的蛋白SCAB_82331为核心研究对象，目的是探寻其在菌体生长发育及致病过程里的调控作用，研究流程首先采用PCR技术，PCR过程用特异性引物精准的扩增出SCAB_82331基因片段，顺利获得完整的编码序列。采取纯化回收手段，将靶基因克隆到大肠杆菌载体pET28a上，成功获得重组质粒pET28a_SCAB_82331，重组质粒成功转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，利用IPTG诱导蛋白合成，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。直观查看融合蛋白的表达情形，并凭借镍柱亲和层析法对目标蛋白进行分离与提纯。借助EMSA（凝胶迁移阻滞实验）来研究SCAB_82331蛋白和靶点DNA结合特性，本研究成果为全面理解SCAB_82331蛋白的调控机制提供了关键数据，或许能揭开它在疮痂链霉菌致病过程中的作用机理，为后续开拓新型生物防治策略和抗病育种技术铺就理论道路，于植物病害防控领域而言有重要的学术及实践意义。关键词：疮痂病链霉菌；调控蛋白SCAB_82331；蛋白表达与纯化；EMSA分析ABSTRACTOneofthemainpathogensofplanttuberscabisStreptomycesscabiosus,andin-depthanalysisofitspathogenicmechanismisofgreatsignificancetodiseasepreventionandcontrol.ThisstudytookSCAB_82331,aproteinthatplaysakeyroleintheregulationofStreptomycesscabiosus,asthecoreobjectofthestudy,withtheaimofexploringitsregulatoryroleinthegrowthanddevelopmentofthefungusanditspathogenicity,andtheresearchprocessfirstlyadoptedthePCRtechnique,andthefragmentofSCAB_82331genewaspreciselyamplifiedbythespecificprimers.ThefirststepoftheresearchprocesswastousePCRtechnology,thePCRprocessusedspecificprimerstoaccuratelyamplifytheSCAB_82331genefragment,andsuccessfullyobtainedthecompletecodingsequence.Afterpurificationandrecovery,thetargetgenewasclonedintotheE.colivectorpET28a,andtherecombinantplasmidpET28a_SCAB_82331wassuccessfullyobtained.AftertherecombinantplasmidwassuccessfullytransformedintoE.coliBL21(DE3)receptorcells,theproteinsynthesiswasinducedbyIPTG,andsodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresiswasusedtovisualisetheexpressionofthefusionprotein.Theexpressionofthefusionproteinwasvisualised,andthetargetproteinwasisolatedandpurifiedbyvirtueofnickelcolumnaffinitychromatography.WiththehelpofEMSA(gelmigrationblockingassay)tostudythebindingcharacteristicsofSCAB_82331proteinandtargetDNA,thepresentresultsprovidekeydataforthecomprehensiveunderstandingoftheregulatorymechanismofSCAB_82331protein,whichmayunveilthemechanismofitsroleinthepathogenicityofStreptomycesscabiei,andpavethetheoreticalwayforthesubsequentdevelopmentofnovelbiocontrolstrategiesanddisease-resistantbreedingtechniques,whichhasagreatpotentialforplantdiseasepreventionandcontrolinthefieldofplantdiseasecontrol.Itisofgreatacademicandpracticalsignificanceinthefieldofplantdiseasepreventionandcontrol.Keywords:：Streptomycesscabrosus;regulatoryproteinSCAB_82331;proteinexpressionandpurification;EMSAanalysi目录TOC\o"1-2"\h\u24537摘要 320234ABSTRACT 38415目录 53219第一章绪论 6101211.1研究背景 6305621.2研究目的与研究意义 6135311.3国内外研究现状 72010第二章材料与方法 7300292.1实验材料 880802.2实验方法 85918第三章结果与分析 1389303.1SCAB_82331基因扩增结果 13266263.2蛋白表达载体pET28a-SCAB_82331的构建 13246553.3蛋白试表达以及SDS分析 14239503.4EMSA分析 1515306第四章讨论 16178824.1实验结果分析 1613634.2研究的不足与展望 162587第五章结论 1723961参考文献 18第一章绪论1.1研究背景作为植物病害原体，疮痂病链霉菌影响重大，归类为植物病原性放线菌，该菌主要侵染马铃薯、甜菜、萝卜及胡萝卜等块茎类农作物，马铃薯疮痂病的研究覆盖度最高REF_Ref15946\r\h[1]REF_Ref15975\r\h[2]，经报道的马铃薯疮痂病菌种类逾20种，典型菌种Streptomycesscabies，同时存在S.acidiscabies和S.iscabies等REF_Ref15998\r\h[3],借由皮孔裂隙、伤口或新生块茎侵入组织，其致病机制涉及Thaxtomins环二肽的生成，病害表现为块茎外皮产生痂状病斑，局部隆起或凹陷，导致马铃薯品质大幅下降，造成销售价格下滑，给马铃薯种植者造成经济重创REF_Ref16034\r\h[4]，胡萝卜、甜菜和防风草等主根作物同样易受此病菌侵染REF_Ref16057\r\h[5]REF_Ref16077\r\h[6]，对作物产量构成重大威胁。马铃薯疮痂病菌中最普遍的是疮痂病链霉菌，极大地降低了马铃薯的品质，造成其市场价值变弱，给农民造成了极大的经济损失，此病菌还可侵害胡萝卜、甜菜以及防风草等主根农作物，给农作物造成了严重后果。它的致病性与次级代谢产物thaxtomins的生物合成关联性强，这类蛋白一般是结合靶基因启动子区域从而调控代谢途径和形态发育REF_Ref16096\r\h[7]，Lrp家族蛋白SCAB_Lrp能够调控thaxtomins合成和其病原性REF_Ref16119\r\h[8]，SCAB_82331是疮痂病链霉菌里的另一潜在调控蛋白，其功能到现在还未明晰。而调控蛋白82331对其相关的生长发育，代谢调节以及致病过程中大概有关键性影响，可针对这类蛋白开展的研究不多，本研究采用分子克隆、蛋白表达与纯化技术，结合采用EMSA实验，目标是搞明白SCAB_82331的DNA结合特性，为深入探索其在病原菌中的调控网络提供基础数据支撑，全面深入研究该蛋白的功能，针对疮痂链霉菌引发病害的机理，对开发新型的治疗策略助益显著。1.2研究目的与研究意义本研究采用现代分子生物学相关技术手段，成功达成了疮痂链霉菌中关键调控蛋白SCAB_82331的可控制表达和功能解析，采用构建高效表达系统，采用蛋白质纯化技术，收获了高纯度、带有生物活性的SCAB_82331蛋白，基于这个基础，综合采用电泳迁移率变动实验、表面等离子共振等先进技术方法，系统钻研了该蛋白和潜在靶点DNA的特异性结合性质，弄明白其结合位点序列特征及结合亲和力等关键参数。经由基因敲除和互补实验，结合表型观察加上转录组分析，初步阐释了SCAB_82331蛋白对疮痂链霉菌生长发育及致病过程的调控功能，从理论角度看，本研究率先揭示了SCAB_82331蛋白的分子特性与作用机制，为深入探究疮痂链霉菌的致病分子机制提供了新的理论凭据。研究发现不但充实了对放线菌转录调控网络的认识，也能为微生物与植物互作的研究提供重要的参考借鉴，从应用这个层面看，本研究发觉，SCAB_82331蛋白作为疮痂链霉菌致病过程的关键调控因子，有很大的药物靶点开发潜力，依照该蛋白的结构、功能上的特性设计的特异性抑制剂或干扰手段，或许会发展成新型生物农药，为马铃薯等作物疮痂病的绿色防治提供有创新意义的方案。目前人类已经对疮痂病链霉菌菌种有了相对完整的了解，疮痂病链霉菌基因组的测序也已经趋于完善REF_Ref16145\r\h[9],现今的分子技术，也将协助我们更透彻、全面地认识疮痂病链霉菌致病性的具体调节机制，采用多学科交叉的科研策略，也为类似病原微生物功能基因研究提供了可借鉴的技术法子，也为后续开展基于病原菌关键调控因子相关的新型农药研发筑牢根基，随着研究朝着更深发展，SCAB_82331蛋白的结构跟功能的关系、调控网络以及其在病害发生期间的作用机制等科学问题会有更全面的说明，进而促进相关应用研究的迅速发展。1.3国内外研究现状国内外针对疮痂链霉菌实施的研究工作，主要集中在致病相关基因的功能范畴之内，在针对致病因子研究的范畴内，thaxtomin类毒素的生物合成途径及其在致病阶段中的核心作用已较明白REF_Ref16165\r\h[10]，部分关键致病基因（如txtA、txtR、nec1等）功能相关的分析，同样给疮痂链霉菌的致病机制带来了关键线索REF_Ref16184\r\h[11]，从蛋白表达与分析技术角度说，PCR、EMSA（电泳迁移率变动实验）、His标签蛋白纯化等技术已大量投入到细菌调控蛋白的功能研究里REF_Ref16201\r\h[12]。这些技术在疮痂链霉菌调控蛋白研究当中的综合应用未形成系统化体系，国内研究在病原菌分离鉴定以及部分致病基因功能分析等方面获一定进展，但在调控蛋白功能解析这方面依旧存在较大空白，尤其是蛋白与DNA之间的相互作用、调控网络构建这类关键科学问题亟待深入挖掘。SCAB_82331蛋白的研究目前仍在初始阶段，此蛋白的结构特征、DNA结合特性及其调控机制还没阐明，需综合不同学科的手段，全面解析该蛋白的功能，以填充疮痂链霉菌调控机制研究存在的空白，以给新型病害防控策略的开发提供理论指引。第二章材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株与载体疮痂病链霉菌，大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，大肠杆菌蛋白表达载体pET28a2.1.2主要试剂PCR相关试剂（高保真DNA聚合酶，dNTPs等），限制性内切酶，T4DNA连接酶，IPTG，SDS电泳试剂，镍柱亲和层析相关试剂，EMSA实验试剂等2.1.3仪器设备PCR仪，离心机，恒温摇床，电泳仪，蛋白质纯化系统，凝胶成像系统等2.2实验方法2.2.1SCAB_82331基因的扩增实验采用疮痂病链霉菌的基因组DNA作为PCR模板，针对SCAB_82331基因的报道序列设计扩增引物，运用PCR方法扩增出SCAB_82331全基因序列，结合高保真DNA聚合酶特点优化反应条件及体系，进行梯度PCR。以获得引物的最适退火温度，按比例扩大PCR体系，琼脂糖凝胶电泳检测产物，将其基因序列复制，使用DNAsist软件，将序列复制到空格处，点击Analyze，选择Restrictionmapping，选取疮痂病链霉菌的基因组DNA作为模板，着手扩增SCAB_82331基因。首先，依据已经公布的SCAB_82331基因序列，设计特异性引物。这些引物就像是精确的导航，能够引导PCR技术准确地扩增出SCAB_82331的完整基因。采用梯度PCR技术，得到产物之后，用琼脂糖凝胶电泳进行检测REF_Ref26316\r\h[14]。为了初步了解扩增情况，先随机抽取两个试样，每个试样取3μL进行检测。同时，将该基因序列复制出来，打开DNAsist软件，把序列粘贴到软件的空格处，点击“Analyze”按钮，然后选择“Restrictionmapping”功能，分析基因序列。2.2.2重组质粒的构建构建蛋白表达载体pET28a-SCAB_Lrp。将得到的基因片段和载体进行双酶切，它们各自与相应的酶充分混匀，在操作过程中要特别注意避免产生气泡。完成酶切处理后，回收纯化后的酶切产物，随后实施DNA片段的连接反应，形成重组质粒pET28a-SCAB_82331，形成重组质粒后，利用BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞体系实施转化，借助氨苄青霉素抗性表型筛选阳性转化体，采用酶切分析与测序鉴定。通过这两步操作，确保构建的重组质粒pET28a-SCAB_82331是正确的。（1）酶切与连接①目的基因SCAB_82331与载体pET28a的酶切将胶回收获得的目的基因及载体分别进行双酶切。将试剂分别混匀，避免气泡产生，然后置于37℃水浴锅1.5-2h。酶切后，回收片段。②目的基因SCAB_82331与载体pET28a的连接把回收的目的载体和基因按比例加入同一连接体系，让载体与片段摩尔浓度比在1:3-1:10之间。将各种试剂分别混匀，避免产生气泡，放入PCR仪，22℃反应2小时，之后4℃保存备用。转化在完成连接反应后，将两管连接产物合并，使用移液器轻柔吹打使其充分混合均匀。实验准备阶段，需提前启动制冰机，同时开启超净工作台的紫外灯进行灭菌处理，照射时长设定为30分钟。取出DH5α感受态细胞，将其放置于冰面上，静置5分钟待细胞温度平衡后，向其中加入20μL连接产物，采用缓慢吸放的方式将两者混合均匀，随后继续在冰上进行25分钟的冰浴孵育。随后，向离心管内加入不含抗生素的LB培养基，放入摇床，设置转速为220r/min，进行30-60分钟的预培养，使细胞恢复生长活性，为后续转化实验奠定基础。将菌液涂布在含Kan抗生素的固体LB培养基上，37℃培养箱培养过夜。挑克隆以DH5α/pET28a＋SCAB_Lrp为例，用紫外照射超净台后，取出平板，挑取菌落接种，置于37℃摇床。（4）提质粒（5）酶切验证20μL体系：10×FastDigestGreenBuffer2μL质粒15μLNdeI1μLHindIII1μLddH2O1μL将上述体系混合，置于37℃水浴锅1h后进行琼脂糖凝胶电泳，条带符合理论依据的为阳性菌株。（6）测序将与目的基因序列相同的菌种保菌（吸取2mL菌液于菌种管中，离心弃去上清液，标记为DH5/pET28a-SCAB_Lrp,置于-20℃保存）2.2.3蛋白试表达及SDS分析（1）转化把经过鉴定的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，取出感受态细胞，剩下的质粒转化进感受态细胞，于冰中放置25分钟，热激处理，迅速放回冰上维持2分钟。接着向体系中加入300μl无抗LB培养液，37℃摇床振荡孵育，采用220转/分转速进行30-60分钟预培养，将细菌悬液涂布于添加卡那霉素的LB平板上，采用37℃培养箱实施培养，培养过程中跟踪菌落生长状态，培养14小时左右出现可见单菌落。（2）挑取克隆使用无菌接种环从固体培养基表面挑选形态良好的单菌落，将其接种至装有含卡那霉素（Kan）抗性的LB液体培养基的无菌试管中，并在试管上清晰标注实验相关信息。将接种后的试管置于恒温摇床内，在37℃条件下，振荡培养过夜。当菌液在37℃振荡培养测定OD600值进行判断，加入IPTG诱导目标蛋白的表达。同时，选取等量未添加IPTG的菌液作为空白对照，以排除非特异性表达干扰。在设定的诱导温度与时间条件下继续培养，待诱导结束后，通过离心收集菌体，用于后续分析实验。（3）菌液PCR将培养好的菌液置于超净工作台中，从各试管里分别吸取50μL菌液至离心管，将离心管放在沸水中煮10分钟，使模板DNA释放出来。之后，从煮过的菌液中分别吸取2μL作为PCR模板。（4）SDS_PAGE检测蛋白表达情况菌体进行超声破碎，离心收集上清和沉淀，SDS_PAGE电泳结束后，使用考马斯亮蓝染色，脱色后观察并分析蛋白表达情况。分别吸取诱导前和诱导后菌液1.5mL离心管中,加入蛋白。水浴锅提前半小时加热，离心管盖子打开方便水蒸气蒸发；将胶板取下，组装好，上样，先100v半小时，待压成一条水平直线，将电压调到150v继续，直至蓝色Loading跑到胶板最下边，或恰好跑出胶板，停止。（5）考马斯亮蓝染色与脱色取下胶板，放入考马斯亮蓝染色盒，染色，置于脱色盒中，轻轻加入自来水，防止胶被冲破，重复6-8次，直至胶变透明；取出脱色好的PAGE胶，置于凝胶成像系统。2.2.4蛋白纯化把培养完成的菌液转移到50mL离心管内，置于低温的环境里，按照6000r/min的转速离心10min，结束后弃去上清。离心操作开展期间，运用离心力让菌体在管底沉降，离心这一步结束后，小心倒出离心管中的上清液，该操作可有效去掉菌液中的液体培养基成分。往离心管里注入咪唑溶液，使咪唑溶液与菌体充分接触混合均匀，再次把离心管放入4℃的环境中，通过离心弃掉上清液，把该洗涤步骤再重复一次，目的是彻底清除菌液里所残留的含抗生素培养基，抗生素的存在有可能干扰后续蛋白纯化进程，经由这个洗涤步骤可降低其对实验结果所造成的干扰。完成对菌液的洗涤后，给离心管内添加20mL5mM咪唑溶液，通过功率为300W的超声仪对菌液实施破碎处理，把工作模式设成超声2秒、中断6秒，该超声破碎过程大约需持续80分钟，过程中要时刻留意菌液状态，当菌液显现出透亮模样时，证实细胞已充分破碎，目标蛋白释放到溶液里面去，超声破碎的原理为借助超声波的空化效应，引起细胞结构的毁坏，实现胞内蛋白的释放，但需留意管制超声参数，防止超声过度造成蛋白出现变性结果。从4℃冰箱中取出镍柱，将其固定于铁架台上，缓慢放出柱内20%的乙醇保存液。乙醇保存液用于维持镍柱在非使用状态下的稳定性，使用前需将其去除。超声破碎，使细胞碎片等杂质沉淀于管底，吸取上清液作为待纯化的蛋白溶液。使用针管吸取上清液，去除针头后，在针管头部加装水系滤膜，对蛋白溶液进行过滤处理，以去除溶液中可能存在的较大颗粒杂质，避免其堵塞镍柱。将过滤后的蛋白溶液缓慢加入预处理好的镍柱中，使蛋白溶液充分与镍柱内的镍离子结合。将咪唑溶液按照浓度由低到高的顺序，依次用10mL上述咪唑溶液对镍柱进行洗脱。随着咪唑浓度升高，与镍离子结合能力弱的杂蛋白先被洗脱，而目标蛋白在较高浓度咪唑下被洗脱。从而实现蛋白的分离纯化。最后，加入10mL500mM咪唑溶液，收集前3管洗脱液，这些洗脱液中富含目标蛋白。将收集到的洗脱液置于冰盒中暂存，并及时转移至4℃冰箱保存，以维持蛋白的稳定性，防止蛋白降解。2.2.5EMSA实验分析蛋白与靶点DNA的结合情况（1）设计并获得探针首先，利用琼脂糖凝胶电泳来检测PCR结果。一个20μL的反应体系，其具体的成分和用量如下：金牌MIX要加170μL，DMSO加17μL，F引物加7μL，R引物加7μL，T加14μL。把这些试剂按照上述用量配制成混合液后，再分装到10支200μL的离心管里，给每支离心管标上号，然后依次放进PCR仪中进行反应。反应结束后，再次用琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果。根据实验的实际需求，可以扩大反应体系，然后通过电泳和胶回收的操作，最终得到需要的探针。把得到的探针进行定量后，放在-20℃的冰箱里保存，以备后续实验使用。（2）制TAE胶H2O：5.5mLA液（29：1coolaber)：2.0mL1.5MTris-HCl(pH=8)：2.5mLAPS(0.1g+900μL水）：50μLTEMED:10μL将这些试剂依次加入小烧杯后，要小心地把它们混匀，注意避免产生气泡。混匀后，用移液枪吸取混合液，慢慢地加到提前安装好的玻璃胶板之间，然后轻轻地插入梳子。之后把胶板放在40℃的烘箱里放置20分钟。（3）20μL结合体系配制10×bindingbuffer2μL2μL2μL500mM咪唑16μL0μL0μLDNA探针PRS37305-31016μL0μL0μL纯化蛋白scab-SCAB_Lrp0μL6μL16μL把上述试剂按照对应的用量依次加到PCR小管中，然后缓缓地吹打混匀，注意防止产生气泡。之后把小管放在30℃的培养箱里20分钟。往每管中加入4μL的6×DNALoading，再次吹打混匀。把配制好的样品依次加入到胶孔内，盖上盖子，电泳25分钟。电泳结束后，取下胶板，把跑好的胶轻轻地放入含有核酸染料的染色液中，染色5分钟，第三章结果与分析3.1SCAB_82331基因扩增结果表1PCR扩增采用琼脂糖凝胶电泳做分析，PCR扩增产物呈现出特异性条带，SCAB_82331基因片段大小近似为492bp，跟预期的片段长度相一致，且条带清晰，未察觉到明显的非特异性扩增条带，由上述实验结果可知，本研究成功实现了对SCAB_82331基因全长序列的有效扩增，为后续基因功能研究以及相关实验搭建了可靠根基3.2蛋白表达载体pET28a-SCAB_82331的构建表2SCAB_82331转pET-28a菌表3SCAB_82331测序表4pET-82331经过HindⅢ和NdeⅠ双酶切验证图对重组质粒pET28a-SCAB_82331开展双酶切操作后，所得到的载体片段与目的基因片段和预期情况相符。为进一步验证重组质粒的准确性，对其进行了测序。将测序得到的结果与已公开的SCAB_82331基因序列仔细比对，发现二者完全吻合。综合酶切鉴定和测序比对的结果，可以确凿地证明重组质粒pET28a-SCAB_82331构建成功。3.3蛋白试表达以及SDS分析SDS-PAGE电泳分析结果呈现，在诱导组的电泳图谱中，于预期分子量对应的位置清晰可见明显的蛋白条带，未诱导组并无相应条带。这一鲜明对比充分表明，IPTG已成功诱导SCAB_82331融合蛋白实现表达，意味着SCAB_82331蛋白初步表达达成预期。针对经镍柱亲和层析纯化处理后的蛋白样品，采用SDS-PAGE进行检测。结果显示，在预期位置出现了单一且较为纯净的蛋白条带，同时杂蛋白条带显著减少。由此可见，借助镍柱亲和层析技术，SCAB_82331蛋白得到了成功纯化，其纯度足以满足后续相关实验的要求。蛋白质试表达SCAB_82331蛋白纯化的SDS分析3.4EMSA分析EMSA实验显示，纯化后的SCAB_82331蛋白能和用生物素标记的靶点DNA探针结合，在凝胶上能看到滞后条带。往里面加入没标记的竞争DNA后，滞后条带的颜色变浅了，这表明蛋白和靶点DNA的结合是有针对性的。蛋白SCAB_82331能够与探针p823331结合，随着蛋白量的增加，结合作用更加明显，这个结果表明SCAB_Lrp3能够直接调控自身基因的转录。SCAB_82331与探针p82331结合的EMSA分析第四章讨论4.1实验结果分析本研究成功实现了疮痂病链霉菌中调控蛋白SCAB_82331的表达和纯化，并通过EMSA实验初步证明了该蛋白与靶点DNA的结合特性。推测SCAB_82331可能通过调控下游基因表达参与thaxtomins合成或病原菌的形态发育。同Lrp家族其他成员（像SACE_Lrp）对比而言，SCAB_82331的结合位点或许存在独特的特点，要进一步借助启动子突变或基因敲除对其功能进行验证，本实验形成的“基因克隆-蛋白纯化-功能验证”技术操作路线，可为其他细菌调控蛋白的研究作参考，在基因扩增这一阶段，高保真PCR技术保证了基因序列的精准度；重组质粒的成功构建为后续蛋白表达筑牢基础。确定蛋白表达形式可辅助选择恰当的纯化策略，不管是呈现可溶性表达还是包涵体形式表达，都采用相应的途径达成了蛋白纯化，EMSA实验结果表明，在体外SCAB_82331蛋白能够特异性结合靶点DNA，这提示其在疮痂病链霉菌体内也许通过跟特定DNA序列结合，调节相关基因的表达水平，进而影响病原菌的生长态势和致病进程。蛋白SCAB_82331能够与探针p823331结合，随着蛋白量的增加，结合作用更加明显，这个结果表明SCAB_Lrp3能够直接调控自身基因的转录。4.2研究的不足与展望本研究仅初步探寻了SCAB_82331蛋白和靶点DNA的结合情况，尚未深入钻研其在体内的调控网络与具体功能机制，在之后开展的研究里面，可经由构建基因敲除突变体，结合转录组学跟蛋白质组学技术，全面分析SCAB_82331蛋白调控的下游基因和信号通路，本研究仅仅在体外证实了蛋白与DNA的结合现象，未来能借助体内实验对其功能做进一步验证，可试着凭借该蛋白的结构与功能特点，研制新型的抑制剂与激活剂，给马铃薯疮痂病等病害的防治提供全新的策略与手段。第五章结论本研究依靠PCR、重组质粒构建、蛋白表达纯化以及EMSA等技术达成目标，顺利达成了疮痂病链霉菌中调控蛋白SCAB_82331的表达和纯化进程，并初步验证了该蛋白与靶点DNA能特异性结合，系统剖析了疮痂病链霉菌中SCAB_82331蛋白的表达特性和它的DNA结合功能，研究成果为深入研究SCAB_82331蛋白在疮痂病链霉菌生长发育及致病机制里的功能提供了基础资料，为疮痂病链霉菌相关研究挖掘了新方向，也能为生物制药专业在微生物蛋白功能研究和新型生物防治策略的开拓方面提供技术参考和研究思路，之后可凭借转录组学及遗传操作深入考察其调控网络，为推出疮痂病防控策略提供理论指引。参考文献罗山,巩晨,赵庆云,等.云南省马铃薯疮痂链霉菌种群分布及环境相关因子分析[J].南方农业学报,2021,52(5):9.杨冰,平原,杜春梅.马铃薯疮痂病的致病机制及防治研究进展[J].中国报,2021,37(18):131-137HiltunenLH,KelloniemiJ,ValkonenJPT,etal.RepeatedapplicationsofanonpathogenicStreptomycesstrainenhancedevelopmentofsuppressivenesstopotatocommonscab[J].PlantDisease,2017,101(1):224-232.Santos-CervantesME,Felix-GastelumR,Herrera-RodríguezG,etal.Characterization,pathogenicityandchemicalcontrolofStreptomycesacidiscabiesassociatedtopotatocommon53scab[J].AmericanJournalofPotatoResearch,2017,94(1):14-25.Eguchi,T.,etal.,Structurerevisionof