（正式版）DB37∕T 3112-2018 《猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术》

ICS65.020.30DB37/T3112—2018猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术2018-03-02实施2018-03-02实施IDB37/T3112—2018本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：李俊、时建立、彭喆、吴晓燕、张玲玲、郑书轩、徐绍建、孙文博、于江、丛晓燕、韩红、吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。DB37/T3112—2018猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术本标准规定了猪伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)检测技术的操作步骤。本标准适用于猪伪狂犬病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1环介导等温扩增技术。嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。十二烷基硫酸钠。无毒型核酸染色剂。4材料及设备4.1主要仪器设备4.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。4.1.220000r/min低温高速离心机。工DB37/T3112—201824.1.4稳流稳压电泳仪。4.1.5水平电泳槽。4.1.6凝胶成像系统。4.1.7紫外透射反射分析仪。4.1.9烧杯(1000mL)。4.1.10电子天平精度为：0.001g。4.2.15mol/LBetaine溶液：配制见附录A.1。4.2.2BstDNAPolymerase(8U/μL)。4.2.40.5×TBE缓冲液：配制见附录A.2。4.2.52%琼脂糖电泳液：配制见附录A.3。4.2.64SGreenPlusNucleicAcidStain。4.2.7DNAMarker2000。4.2.9超纯水：符合GB/T6682,三级。F3:5'-ACGAGCCCCGCTTCCA-3'。B3:5'-AGATGCAGGGCTCGTACA-3'。FIP:5'-AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT-3'。BIP:5'-GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG-3'。采集血清或淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器。5.2.2淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器各1g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1:5倍稀释，取悬液反复冻融3次，5000r/min离心15min,取上清液-20℃保存备用。水浴2h～3h。5.3.2加入200μLTris饱和酚，混匀，4℃12000r/min离心15min。5.3.3取上清液500μL,加入200μLTris饱和酚和200μL三氯甲烷，4℃12000r/min离心DB37/T3112—201835.3.4取上清液400μL,加入200μL三氯甲烷，4℃12000r/min离心15min。5.3.5取上清液300μL,加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min,4℃12000r/min离心15min。5.3.6弃上清液，加入1mL70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。5.4.1环介导等温扩增反应体系配制，按表1中1～8的循序配制。表1环介导等温扩增反应体系(25μL)体系组成体系含量110×ThermoPol2dNTP混合液(10mmol/L)34BIP/FIP(50μmol/L)5Betaine(5mol/L)6DNA7BstDNAPolymerase(8U/μL)8超纯水5.4.2LAMP程序设定表2LAMP反应程序设定温度时间163℃60min25.5.12%琼脂糖凝胶板的制备(见附录A.3)。混合，点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以DNAMarker2000作相对分子质量指示。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物作对照。电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现瀑布样条带，阴性对照孔不出现瀑布样条带，则试验成立。在试验成立条件下，出现瀑布样条带泳道的样品判为阳性(说明样品中含有猪伪狂犬病毒),不出现瀑布样条带泳道的样品为阴性(参见附录A.5)。46.2.2反应管置于紫外透射反射分析仪下，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光，阴性反应管不显现荧光(参见附录A.7)。5DB37/T3112—2018(规范性附录)试剂的配制A.15mol/LBetaine溶液灭菌超纯水A.20.5×TBE缓冲液Na2EDTA.2H207.44g。硼酸55g。灭菌超纯水定容至1L,配成10×TBE缓冲液。0.5×TBE缓冲液60mL。