CN114705854B 一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其制备方法与应用 （东北农业大学）

FluorescenceAptasensorBasedonMaBeads/GoldNanoparticles/DNA-SilverNanoclustersforDet一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其明提供了一种适体生物传感器，其检测原理为SMBs_cDNA2复合物、适配体Apt2和AuNPs_cDNA3探针建立的夹心结构SMBs_Apt2_AuNPs荧光猝灭系统中的AuNPs与AgNCs发生FRET以猝灭AgNCs的连接桥梁的Apt2结合，SMBs_Apt2_AuNPs系统被破坏，在上清液中悬浮的AuNPs_cDNA3探针和结用于实时检测食品及食品加工过程中的沙门氏菌污染，尤其是乳制品生产中的沙门氏菌的污2传感器包括由SMBs_cDNA2复合物、适配体Apt2和AuNPs_cDNA3探针建立的夹心结构SMBs_Apt2_AuNPs，和被用作荧光信号的以DNA为模板合成的银纳米簇DNA_AgNCs；所述SMBs_cDNA2复合物由链霉亲和素磁珠与生物素修饰的核酸链cDNA2连接，cDNA2的核苷酸序列如模板的核苷酸序列如SEQIDNO.在上清液中悬浮的AuNPs_cDNA3探针和结合Apt2的沙门氏菌通过磁分离被去除，从而导致入等体积的cDNA2溶液孵育，去除上清，经1xB&W缓冲液洗涤后，重悬于P复合物和15μgAuNPs_cDNA3探针在100μLPBS溶液中混合，并在37℃条件下孵育120min，磁分离去除上清，再用PBS溶液洗涤三次获得SMBs_Apt2_AuNPs系统；向含有0.5~53S3、将5μL~100μL浓度为0.1μmol/L~5μmol/L的DNA_AgNCs添加到溶液中并孵育28.权利要求1中所述适体生物传感器在实时检测食品或食品加工过程中沙门氏菌污染4一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其制备[0003]沙门氏菌(S.typhimurium)作为常见的食死亡。沙门氏菌已经被WHO列为具有严重危害和中等危害的食物传播性病原菌。有研究表5有更稳定光学特性及低毒的荧光标记物对于应用荧光适体传感器检测食源性致病菌是十中存在的问题，本发明提供了一种快速检测沙门氏菌的适体生物传感器，包括由SMBs_磁珠与生物素修饰的核酸链cDNA2连接，cDNA2的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述[0011](1)制备SMBs_cDNA2复合物：SMBs经1×B&W缓冲液洗涤后，重悬于2×B&W缓冲液[0013](3)制备SMBs_Apt2_AuNPs系统及合成DNA_AgNCs：将Apt2、SMBs_cDNA2复合物和[0014]进一步地限定，步骤(1)所述SMBs的用量为0.6℃孵育0.1_2h，分多次缓慢加入含有2mol/LNaCl的磷酸缓冲液B进行老化，直至溶液中2O2HPO4[0018]进一步地限定，磷酸缓冲液B的制备：称取10mL0.1M磷酸缓冲酸缓冲液A后的孵育温度为50℃,孵育时间为1h；所述老化结束的时间为NaCl浓度达到物和5～50μLAuNPs_cDNA3探针在100μLPBS溶液中混合，并在25～45℃条件下孵育60~加入1～20μL浓度为0.002～10mmol/L的AgNO3溶液，并在黑暗中于0～25℃孵育5～50min，[0022]S1、将SMBs_Apt2_AuNPs系统加入到样品中，并在25℃~45℃条件下，孵育60~[0026]进一步地限定，S1所述的样品的体积为20_800μL，孵育温度为37℃,孵育时间为[0027]本发明还提供了上述适体生物传感器在实时检测食品或食品加工过程中沙门氏心结构SMBs_Apt2_AuNPs荧光猝灭系统能够在没有沙门氏菌的情况下保持完整性，系统中的AuNPs与AgNCs发生荧光共振能量转移(FRET)以猝灭AgNCs的荧光；在有沙门氏菌的情况7[0031]2)本发明基于DNA_AgNCs构建荧光适体生物传感器，解决现有荧光信号分子由于[0036]图2为AuNPs_cDNA3探针制备过程中NaCl终浓度的优化结果图，图中1_4的NaCl终8加入等体积的2μmol/LcDNA2溶液，然后在37℃下振荡孵育60min。去除上清后，将SMBs_[0066]将2.5nmol/LApt2，40μgSMBs_cDNA2复合物和20μLAuNPs_cDNA3探针在100μLPBS溶液中混合，然后在37℃条件下孵育120min来制备荧光猝灭系统。磁分离去除上清液9~750nm的发射光谱)。优化结果如图5所示，F0和F分别代表鼠伤寒沙门氏菌用的DNA浓度即可作为制备的DNA_AgNCs的仪检测DNA_AgNCs的荧光光谱(激发波长为576nm，以2nm的间隔扫描601～750nm的发射光6。[0087]以鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028作为实验的标准菌株，将该菌按照2％的[0089]实施例1中获得的SMBs_Apt2_AuNPs系统与200μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在37添加到溶液中并孵育10min，通过多功能酶标仪检测DNA_AgNCs的荧光光谱(激发波长为[0091]选择SMBs_Apt2_AuNPs系统与沙门氏菌孵育时间分别为30min、60min、90min和氏菌添加之前和之后在643nm呈现出峰值的荧光强度。当反应达到一定时间后，荧光比值(1_F0/F)不发生明显变化时，将此时间确定为最佳。因此由图10可知，最佳孵育时间为鼠伤寒沙门氏菌添加之前和之后在643nm呈现出峰值的荧光强度，荧光比值(1_F0/F)与鼠[0097]将12种常见的食源性致病菌和鼠伤寒沙门氏菌(菌株信息见表1)分别接种至LB液菌液终浓度范围为7.6×101到7.6×10[0104]取1mL人工污染牛奶样品，通过8000×g离心5min(4℃)去除牛奶中的蛋白质和脂[0109]向牛奶样品中加入已知浓度的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，按照上述([0110]结果表明，荧光比值(1_F0/F)与鼠伤寒沙门氏菌浓度范围为7.6×103至7.6×106CFU/mL的对数之间存在良好的线性关系(R2＝0.9754)。线性回归方程为y＝0.1105x–