PEG-UHC家兔皮下刺激实验

17/17论文题目PEG-UHC家兔皮下刺激实验摘要目的评价PEG-UHC制剂对家兔皮下组织的局部刺激性，并为临床用药提供参考。方法实验设PEG-UHC制剂浓度为4mg/ml；同时在自身腰背部对侧设一个溶媒对照组。每组6只动物，采用自身腰背部左右区域对比法。皮下注射，1ml/区域，连续给药5天，每天一次。实验期间每天观察PEG-UHC制剂对家兔皮下组织的刺激反应并进行刺激反应评分。于末次给药72小时后和恢复14天进行计划解剖。摘取给药部位进行病理组织学检查。结果溶媒对照组和给药组，给药期和恢复期所有动物未见任何临床表现；注射部位肉眼观察均未见任何刺激反应。溶媒对照组和给药组所有动物解剖肉眼观察均未见明显异常；病理组织学检查也未见明显改变。结论在本实验条件下，家兔连续5天皮下注射4mg/mlPEG-UHC制剂未见明显刺激性。PEG-UHC家兔皮下刺激实验，连续给药5天，溶媒对照组和PEG-UHC4mg/ml组均可见真皮层和肌层轻微结缔组织细胞增多，（或）伴炎细胞浸润。恢复14天后，上述变化大部分恢复。【关键词】聚乙二醇尿酸酶（PEG-UHC）；家兔；刺激性

目录TOC\o"1-2"\h\z\u1前言 11.1本文研究背景 21.2国内外研究现状 31.3研究目的和意义 52实验材料和方法 62.1实验材料 62.2实验方法 73结果和结论 93.1注射部位肉眼观察 93.2肉眼形态学观察 103.3病理组织学 103.4结论 104讨论 11参考文献 13附录 14前言1.1本文研究背景尿酸酶分解嘌呤代谢最终产物尿酸，生成水溶性更强，更易分解的尿囊素。当尿酸在血液中沉积，引起肾衰竭以及痛风等疾病。尿酸酶针对禁忌常规治疗和常规疗法无效的患者，能快速降低血液中尿酸盐的含量。但作为外源蛋白有较高抗原性，影响了尿酸酶的活性。需要在尿酸酶分子表面结合一种水溶性高聚物，从而降低尿酸酶的抗原性，延长它在体内的半衰期。蛋白质PEG修饰技术在过去的20年中得到了快速发展，已有多篇文献报道了经PEG修饰的蛋白质药物降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期，并用于临床治疗各种疾病。1.2国内外研究现状蛋白质和肽类分子的化学修饰已经成为生物技术与生物医学领域的研究热点，而聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)是应用最为广泛的大分子修饰剂之一，聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)是由乙二醇单体聚合而成的以羟基结尾的线性或分支状聚醚高分子化合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性，能改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快被消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。PEG是经美国食品药品管理局(FDA)批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。蛋白PEG修饰技术由Davis在20世纪70年代首先进行了开拓性研究。1991年，第1种用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG，腺苷脱氨酶获得FDA批准上市，用于治疗儿童免疫缺陷症，目前已经有多种PEG修饰蛋白药物上市。我国有许多科研人员正在开展PEG修饰蛋白药物的研究工作，并取得了有应用价值的成果。研究发现聚乙二醇及其衍生物具有下述的优良性能而在化学修饰中应用最多，(1)PEG具有两亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于绝大多数的有机溶剂。(2)PEG无毒，免疫原性低，其生物相容性也已经通过美国FDA认证。(3)PEG的分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大。(4)PEG可以将它的许多优良性质赋予修饰后的生物分子。1.3研究目的和意义本研究通过评价PEG-UHC制剂对家兔皮下组织的局部刺激性，为临床用药提供参考。材料和方法2.1

材料：受试药物：PEG-UHC（代号），由重庆富进生物医药有限公司提供，批号20120403溶媒对照：PEG-UHC溶媒（代号），由重庆富进生物医药有限公司提供，批号20121101实验动物：普通级新西兰白兔，体重约2.5kg，年龄约4月龄，6只雄性，上海生旺实验动物养殖有限公司。麻醉药品：戊巴比妥钠溶液（浓度为60mg/ml）；戊巴比妥钠粉剂，由上海试制二厂生产，批号820219病理标本：所有标本经10%中性缓冲福尔马林液固定，不同浓度乙醇脱水，石蜡包埋，常规切片，HE染色，显微镜下进行病理组织学诊断。制片仪器：组织脱水机，组织包埋机，石蜡切片机，烤片机，自动染色机，盖片机，显微镜等实验仪器，均采购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司。2.2

方法：此实验参照SFDA（中国）2005年3月颁布的《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》进行实验设计。家兔是刺激实验首选动物，有较多的背景资料，被管理机构认可。本品临床拟用皮下注射，因此本实验的给药途径采用皮下注射。实验每组6只动物，采用自身腰背部左右区域对比法。每天一次，连续给药5天，停药观察72小时，解剖部分动物。再留下2只动物，继续观察14天。给药期每天给药前和给药后各进行一次注射部位肉眼观察；非给药期每天一次。详细动物数和给药方案见表1。按照表2进行分级。适应期、给药期及恢复期动物的实验和饲养条件符合国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）和上海药物所动物管理委员会（IACUC）政策。表1给药方案动物编号腰背部区域-左侧腰背部区域-右侧受试物浓度(mg/ml)受试物给药期7，8，9，10PEG-UHC4PEG-UHC溶媒恢复期11，12PEG-UHC4PEG-UHC溶媒表2皮下刺激反应肉眼观察分级刺激反应评分无刺激无变化-极轻度刺激轻微充血，可见小红点±轻度刺激有充血，范围在0.5cm以下+中度刺激红肿、充血，范围在1.0cm左右++重度刺激红肿，充血，发绀，范围1.0cm以上+++严重度刺激红肿，充血，发绀，硬变，光泽消失++++取检疫合格的6只健康的雄性新西兰兔，进行PEG-UHC家兔皮下刺激实验（应用动物对应表进行识别）。操作如下：D1-D5：给药前先对给药部位进行剃毛，再进行临床观察，消毒后在兔左侧腰背部区域用合适的注射器皮下注射浓度为4mg/ml的PEG-UHC，作为给药组；同时在右侧腰背部区域用合适的注射器皮下注射PEG-UHC溶媒，作为溶媒对照组。每次每只给药体积为1ml。在给药后两小时左右进行临床观察。D6-D8：末次给药后24/48/72小时左右进行临床观察。所有动物两侧腰背部注射部位区域肉眼观察。D8观察后对给药期的4只动物进行安乐死并解剖。rD1-rD14：与末次给药后相近时间点进行临床观察。恢复期动物两侧腰背部注射部位区域肉眼观察。rD14观察后对恢复期的2只动物进行安乐死并解剖。解剖方案按表3执行，采用腹腔注射过量戊巴比妥钠进行安乐死。解剖时肉眼观察动物给药部位（腰背部区域），并摘取给药部位皮肤（含皮下组织及肌肉），进行病理组织学检查。固定于10%中性缓冲福尔马林液中。组织经固定后，按照相应的SOPs进行取材、脱水、包埋、切片和H.E染色。最后对所有动物给药部位包括皮肤、皮下组织及肌肉进行病理诊断。表3PEG-UHC家兔皮下刺激实验解剖方案给药期限解剖日期动物编号腰背部区域-左侧腰背部区域-右侧受试物浓度（mg/ml）受试物给药期D87、8、9、10PEG-UHC4PEG-UHC溶媒恢复期rD1411、12PEG-UHC4PEG-UHC溶媒注：首次给药日期定义为实验第一天（D1）；停药72小时后一天定义为恢复期第一天（rD1）结果和结论

3.1注射部位肉眼观察注射部位肉眼观察刺激反应个体表可见附表1PEG-UHC溶媒组，给药期和恢复期所有动物注射部位肉眼观察均未见任何刺激反应。PEG-UHC4mg/ml组，给药期和恢复期所有动物注射部位肉眼观察均未见任何刺激反应。3.2肉眼形态学观察肉眼形态学观察结果个体表可见表4表4肉眼形态学观察结果个体表动物编号：7给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：给药期浓度：/解剖肉眼观察未见异常动物编号：8给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：给药期浓度：/解剖肉眼观察未见异常动物编号：9给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：给药期浓度：/解剖肉眼观察未见异常动物编号：10给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：给药期浓度：/解剖肉眼观察未见异常动物编号：7给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：给药期浓度：4mg/ml解剖肉眼观察未见异常动物编号：8给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：给药期浓度：4mg/ml解剖肉眼观察未见异常动物编号：9给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：给药期浓度：4mg/ml解剖肉眼观察未见异常动物编号：10给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：给药期浓度：4mg/ml解剖肉眼观察未见异常动物编号：11给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：恢复期浓度：/解剖肉眼观察未见异常动物编号：12给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：恢复期浓度：/解剖肉眼观察未见异常动物编号：11给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：恢复期浓度：4mg/ml解剖肉眼观察未见异常动物编号：12给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：恢复期浓度：4mg/ml解剖肉眼观察未见异常小结：给药期和恢复期所有动物未见明显解剖肉眼观察异常。3.3病理组织学病理组织学观察结果汇总表和个体表可见表5、表6表5病理组织学观察结果汇总表性别给药期限雄性给药期恢复期mg/ml/4/4给药部位（腰背部）右侧左侧右侧左侧数量4422皮下注射部位表皮层结痂+0100真皮层炎细胞浸润+1200真皮层结缔组织细胞增多+1101++0100肌层结缔组织细胞增多+1101++0100肌层炎细胞浸润+0100肌层色素沉淀+0001肌层，肌纤维变性++1000注：病理分级：+：轻微；++轻度；+++：中度；++++：重度；数字如1、2等为发生动物例数；/-不适用。表6病理组织学观察结果个体表动物编号：7给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：给药期浓度：/病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位-动物编号：8给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：给药期浓度：/病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位真皮浅层炎细胞浸润(粒细胞)，局灶性+真皮浅层结缔组织细胞增多，局灶性+动物编号：9给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：给药期浓度：/病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位肌层（筋膜）结缔组织细胞增多，局灶性+动物编号：10给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：给药期浓度：/病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位肌层，肌纤维变性，局灶性++动物编号：7给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：给药期浓度：4mg/ml病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位表皮层结痂，局灶性+真皮深层结缔组织细胞增多，多灶性++真皮深层炎细胞浸润（粒细胞）+动物编号：8给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：给药期浓度：4mg/ml病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位真皮浅层炎细胞浸润（粒细胞），局灶性+肌层结缔组织细胞增多，多灶性+动物编号：9给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：给药期浓度：4mg/ml病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位-动物编号：10给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：给药期浓度：4mg/ml病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位肌层（筋膜）结缔组织细胞增多，局灶性++肌层（筋膜）炎细胞浸润（浆细胞）+动物编号：11给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：恢复期浓度：/病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位-动物编号：12给药部位：腰背部-右侧受试物：PEG-UHC溶媒性别：♂给药期限：恢复期浓度：/病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位-动物编号：11给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：恢复期浓度：4mg/ml病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位真皮深层结缔组织细胞增多，局灶性+动物编号：12给药部位：腰背部-左侧受试物：PEG-UHC性别：♂给药期限：恢复期浓度：4mg/ml病理组织学检查组织/脏器病理组织学改变程度皮下注射部位肌层（筋膜）结缔组织细胞增多，局灶性+肌层（筋膜）色素沉淀+注：-：未见异常；+：轻微；++轻度；+++：中度；++++：重度小结：依据注射部位的解剖学结构，对表皮、真皮、皮下和肌层及相关的组织进行了病理组织学观察。给药期，溶媒对照组和给药组在真皮层和肌层均可见：结缔组织细胞轻微增多，（或）伴少量炎细胞浸润。给药组个别动物结缔组织细胞数量增多程度稍重。恢复14天后，PEG-UHC4mg/ml组大部分恢复。3.4结论在本实验条件下，家兔连续5天皮下注射4mg/mlPEG-UHC制剂，停药观察72小时，恢复14天，期间观察均未见明显刺激性。给药期动物病理结果均可见真皮层和肌层有轻微结缔组织细胞增多，（或）伴炎细胞浸润。恢复14天后，上述变化大部分恢复。讨论刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的不可逆炎症反应，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。刺激性试验通过观察动物的血管、肌肉、皮肤、粘膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应，来考察药物有无局部刺激性。家兔皮肤对刺激反应敏感，其反应近似于人。常选用家兔皮肤进行毒物对皮肤局部作用的研究。方案要求“连续给药5天，停药观察72小时，解剖部分动物”，但实际末次给药日（2012/12/28）给药时间范围“16:03~16:22”，给药期解剖日（2012/12/31）临床观察和注射部位观察结束时间分别为9:48和9:52，末次给药后临床观察时间不足72小时。偏离了实验方案。但给药期的观察（临床观察和注射部位观察）以及解剖时的肉眼形态学观察，都未发现任何改变。因此，该偏离不会对实验结果造成影响。除此之外，在整个实验过程中，未出现其他影响研究可靠性和造成研究工作偏离实验方案的异常情况。参考文献[1]姜忠义,许松伟,王艳强.蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学[J].有机化学,2003,23(12):1340.[2]印春华,张敏.蛋白质和多肽类药物的PEG结合物.一种新型给药系统[J].中国药学杂志,2001,36(5)；292.[3]姜忠义,许松伟,高蓉.生物分子化学修饰用聚乙二醇衍生物的合成及应用[J].高分子通报,2002,(1):34-40.[4]董惠钧,姜俊云,郑立军,等.蛋白药物聚乙二醇修饰技术研究进展[J].中国生化药物杂志,2009,30(3):199-203.[5]施新猷主编.医学动物实验方法.北京:人民卫生出版社,1986:217[6]加拿大动物管理委员会编.实验动物管理与使用指南[M].军事医学科学院实验动物中心译.北京:原子能出版社,l993:302-303.[7]李根平.邵军石,李学勇,等.实验动物管理与使用手册[M].北京:中国农业大学出版社,2010:324-326.[8]《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》,[H]GBT4-1,SFDA,2005年3月[9]国家食品药品监督管理局.化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[S].2005.[10]国家食品药品监督管理局.药物非临床质量管理规范[S].2003.[11]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].第3版,北京:人民卫生出版社.2002.[12]国家药品监督管理局注册司.新药毒理学研究指导原则[S].1999.205～7.[13]中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南药学、药理学、毒理学[