DB43∕T 3250-2025 基于高通量测序的农作物基因分型检测技术规程

ICS07.080

CCSB21

43

湖南省地方标准

DB43/T3250—2025

基于高通量测序的农作物基因分型检测

技术规程

Codeofpracticeforcropgenotyping-high-throughputsequencingmethod

2025-07-18发布2025-10-18实施

湖南省市场监督管理局发布

DB43/T3250—2025

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4样本质量控制.......................................................................1

通用要求.......................................................................1

叶片样本取样、保存及运输.......................................................2

种子样本取样、保存及运输.......................................................2

DNA提取........................................................................3

DNA质控........................................................................3

5高通量测序.........................................................................4

步骤...........................................................................4

联合探针锚定测序法.............................................................4

边合成边测序法测序.............................................................6

6测序数据质控及基因分型检测.........................................................7

测序数据质量分析及过滤.........................................................7

基因分型.......................................................................7

附录A（资料性）DNA完整性检测凝胶电泳图.............................................9

附录B（资料性）FASTQ格式文件示例图................................................10

I

DB43/T3250—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由湖南省农业农村厅提出。

本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：华智生物技术有限公司、袁隆平农业高科技股份有限公司、湖南师范大学生命科

学学院、湖南农业大学农学院、湖南省农业科学院作物科学研究所、深圳华大智造科技股份有限公司、

湖南华智智造科技有限公司。

本文件主要起草人：黄刚、田冰川、杨远柱、梁满中、唐顺学、严明理、康雷、彭欢欢、谭司苡、

李为国、方妙全、李乐、许美娟、肖湘谊、王俊领、黄祖军、罗超伟、尹立新、唐宜、戴倩。

II

DB43/T3250—2025

基于高通量测序的农作物基因分型检测

技术规程

1范围

本文件规定了基于高通量测序的农作物基因分型检测的样本质量控制、高通量测序、测序数据质控

及基因分型检测。

本文件适用于基于高通量测序的农作物基因分型。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T30989高通量基因测序技术规程

GB/T33767.14-2023信息技术生物特征样本质量第14部分：DNA数据

GB/T35537高通量基因测序结果评价要求

GB/T35890-2018高通量测序数据序列格式规范

GB/T37864生物样本库质量和能力通用要求

GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则

3术语和定义

GB/T30989界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

基因型genotype

个体在一个或多个基因座上的等位基因组合。

基因分型genotyping

通过检测及分析个体脱氧核糖核酸（DNA）序列来确定其基因型的技术。

4样本质量控制

通用要求

4.1.1DNA

用于高通量测序的DNA根据GB/T35537中碱基测序准确率的要求进行质量控制，DNA同时满足

完整性和浓度要求才是合格样本。

4.1.2样本

1

DB43/T3250—2025

农作物样本及相关数据的使用遵守区域、国家和国际的伦理规范。农作物样本的取样、前处理过程、

保存、销毁、运输等操作符合GB/T37864的规定。

4.1.3水和试剂

本文件所使用的水均为一级水，符合GB/T6682规定的一级水要求。除非另有说明，在分析中仅使

用分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂用

0.22μm膜过滤除菌，酶溶液避免反复冻融。

叶片样本取样、保存及运输

4.2.1取样

农作物叶片样本取样要求如下：

a)在田间采集无病虫斑、无发黄枯萎、无霉变、无污染物的新鲜叶片样本后，将叶片样本装入有

编号的塑料自封袋、牛皮纸袋、圆底微量离心管（EP管）或96孔深孔板中；

b)EP管与自封袋要将口密封以防样本泄露或污染；

c)牛皮纸袋口折叠3次进行封口以防样本泄露或污染；

d)96孔深孔板用硬滤纸板覆盖，用橡皮筋扎紧以防叶片样本泄露或污染。

4.2.2保存及运输

本文推荐简单处理法、干燥处理法及冷冻处理法，其它能保障叶片样本在保存及运输中DNA不降

解的方法均可适用。

4.2.2.1简单处理法

样本保存运送时间小于1d，样本放入泡沫箱后加入蓝冰袋运送到实验室。

4.2.2.2干燥处理法

样本保存运送时间大于1d但小于1w，根据水份含量高低分两种处理方法如下：

a)水份含量较低的样本，用二氧化硅硅胶将叶片干燥变脆后，密封保存或运送；

b)水份含量较高的样本，用真空冷冻干燥机将叶片冷冻干燥变脆后，密封保存或运送。

4.2.2.3冷冻处理法

样本保存运送时间大于1w但不超过6m，样本用液氮速冻后存入-80℃冰箱保存。样本装入有足

量干冰的泡沫箱进行长距离运输。

种子样本取样、保存及运输

4.3.1取样

选取无病虫斑、无霉变、无污染的种子去净泥土或灰尘，装入有编号的塑料自封袋、牛皮纸袋、圆

底EP管或96孔深孔板中。

4.3.2保存

千粒重小于50g的种子样本，不少于4g或不低于60粒。千粒重大于50g的种子样本，不少于10

g或不低于20粒。

2

DB43/T3250—2025

4.3.3运输

干燥的种子打包后常温快递运输，未经干燥的种子打包后低温运输。

DNA提取

本文推荐采用CetyltrimethylammoniumBromide法或离心柱提取法提取DNA，其它能满足高通量

测序文库构建要求的提取方法均可适用，DNA质量符合GB/T37874的要求。

4.4.1CTAB磁珠提取法

4.4.1.1样本干燥

农作物叶片样本DNA提取宜采用本方法，取30mg组织装入EP管或96孔深孔板，真空冷冻干燥

12h以上。

4.4.1.2样本研磨

EP管或96孔深孔板中加入钢珠，盖上硅胶膜，置于自动化研磨仪中进行研磨。

4.4.1.3DNA提取

用CTAB试剂裂解组织并离心获得上清溶液，然后加入磁珠进行DNA纯化，用doubledistilledwater

溶解，获得高质量的基因组DNA。

4.4.2离心柱提取法

4.4.2.1样本干燥

农作物种子、肉质块根、高油高脂类组织DNA提取宜采用本方法，取新鲜组织100mg、干组织30

mg装EP管或96孔深孔板中，真空冷冻干燥12h以上。

4.4.2.2样本研磨

EP管或96孔深孔板中加入钢珠，盖上硅胶膜，置于自动化研磨仪中进行研磨。

4.4.2.3DNA提取

用含β-巯基乙醇和Rnase的裂解液37℃孵育30min，进行组织裂解。加入蛋白酶K后，水浴2h~3

h。加入氯仿并混匀后离心，吸取上层水相至新的管孔中，加入等体积缓冲液后，转入离心柱，进行2

次漂洗后，用TE进行溶解，获得高质量的基因组DNA。

DNA质控

DNA进行完整性和浓度质控，两项质控均达标才是合格DNA。

4.5.1DNA完整性质控

本文件推荐用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳法对DNA进行完整性质控，其它能满足DNA完整性质控

的方法均可适用。基因组DNA完整性判断标准：

a)凝胶电泳主带单一，在15kb以上条带清晰，无严重降解;

b)如主带不清晰呈弥散状，则为严重降解样本；

c)完整性检测图谱见附录A图A.1。

3

DB43/T3250—2025

4.5.2DNA浓度质控

本文推荐用荧光染料法进行DNA浓度测定，其它能满足DNA定量的方法均可适用。DNA浓度不

低于20ng/μL。

5高通量测序

步骤

5.1.1文库构建及质控

质控合格DNA进行片段化后连上接头，PolymeraseChainReaction扩增后进行文库片段选择，获得

常规测序文库；进行靶向测序文库构建还需用探针对常规测序文库进行杂交捕获和PCR扩增，获取靶

向测序文库。

5.1.2测序信号收集

以测序文库为模板，在测序反应体系的作用下，游离核苷酸与文库模板进行配对、结合及延伸，核

苷酸所带荧光基团发出荧光，通过高清摄像头拍摄照片，收集保存荧光信号，完成测序反应。

5.1.3碱基识别

对测序反应中拍摄的照片、图像进行处理分析，将荧光信号转变为碱基序列信息，得到测序原始数

据，输出FastQuality格式数据文件。

联合探针锚定测序法

5.2.1测序文库制备及质控

5.2.1.1DNA片段化

机械打断法或酶切打断法将DNA片段化。

5.2.1.2文库构建

片段化DNA经接头连接、纯化、PCR扩增及片段选择，获得两端接头、中间有待测DNA片段的

文库，两端接头主要包括扩增及测序引物互补序列、标签序列。

5.2.1.3文库质控

测序文库浓度、片段大小检测：文库浓度≥10ng/μL，文库片段大小主峰在450bp~600bp为合格文

库。

5.2.2测序文库环化及DNB制备

5.2.2.1解链

双链的DNA测序文库进行95℃高温变性解链成单链。

5.2.2.2环化

加入夹板引物及T4连接酶反应体系进行环化反应。

4

DB43/T3250—2025

5.2.2.3消化

环化反应结束后加入核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ进行消化，去除未环化线性DNA文库，纯化后

获得环化产物。

5.2.2.4DNB制备

环化产物经RCA扩增制备成DNANanoBalls，获得测序模板。

5.2.3DNB加载

将准备好的DNB加载到测序载片中。

5.2.4碱基循环测序

5.2.4.1测序引物与测序模板结合

测序引物与测序模板的接头序列互补配对。

5.2.4.2生化反应

依次加入带特定荧光标记的四种脱氧核糖核苷酸，通过DNA聚合酶的作用，使得测序引物3’-末

端进行单脱氧核糖核苷酸结合及延伸，荧光标记被切除激发出荧光信号。

5.2.4.3荧光信号采集

CCD照相机对测序载片拍照，采集并保存单次延伸的荧光信号，四种脱氧核糖核苷酸的延伸反应

和信号采集结束后，完成一轮测序。

5.2.4.4循环测序

重复5.2.4.2和5.2.4.3的步骤，直至将所有信号采集完成。

5.2.4.5双端测序

进行双端测序时，Read1端测序完成后，MDA聚合酶链置换反应，重复5.2.4.2、5.2.4.3和5.2.4.4

的步骤，进行Read2端测序，直至将所有信号采集完成。单端测序不需要进行此步骤。

5.2.4.6标签序列测序

标签序列的测序引物与测序模板中的标签序列上游序列互补配对，重复5.2.4.2、5.2.4.3和5.2.4.4

步骤，直至将标签序列信号采集完成。

5.2.4.7碱基识别

信号分析软件对采集得到的荧光信号图片进行处理和分析，将荧光信号转换成碱基序列。碱基序列

以FASTQ格式的文件进行存储，FASTQ格式中每一条测序序列用4行信息表示，符合GB/T35890中

6.1的要求，FASTQ格式文件示例如附录B图B.1。

5.2.4.8数据拆分

根据标签序列将混合测序样本数据进行拆分。

5.2.4.9测序报告生成

5

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生成测序芯片数据产出率、产出有效Reads数、数据质量值、测序读长等参数的报告。

边合成边测序法测序

5.3.1测序文库制备及质控

5.3.1.1DNA片段化

机械打断法或酶切打断法将DNA片段化。

5.3.1.2文库构建

片段化DNA经接头连接、纯化、PCR扩增及片段选择，获得两端接头、中间有待测DNA片段的

文库，两端接头主要包括扩增及测序引物互补序列、标签序列。

5.3.1.3文库质控

测序文库浓度、片段大小检测：文库浓度≥10ng/μL，文库片段大小主峰在450bp~600bp为合格文

库。

5.3.2测序文库加载到测序载片

测序文库加载到测序载片，通过桥式PCR，测序文库在测序载片上进行簇生成，获得测序模板。

5.3.3碱基循环测序

5.3.3.1测序引物与测序模板结合

测序引物与测序模板的接头序列互补配对。

5.3.3.2生化反应

依次加入带特定荧光标记的四种脱氧核糖核苷酸，通过DNA聚合酶的作用，使得测序引物3’-末

端进行单脱氧核糖核苷酸结合及延伸，荧光标记被切除激发出荧光信号。

5.3.3.3荧光信号采集

CCD照相机对测序载片拍照，采集并保存单次延伸的荧光信号，四种脱氧核糖核苷酸的单碱基延

伸反应和信号采集结束后，完成一轮测序。

5.3.3.4循环测序

重复5.3.3.2和5.3.3.3的步骤，直至将所有信号采集完成。

5.3.3.5双端测序

进行双端测序时，Read1端测序完成，将测序产生的新序列从测序模板上洗脱，通过桥式PCR扩

增获得测序模板的互补链，然后切除掉测序模板，以互补链为新的测序模板，重复5.3.3.2、5.3.3.3和

5.3.3.4步骤，测序获得Read2。

5.3.3.6标签序列测序

标签序列的测序引物与测序模板中的标签序列上游序列互补配对。重复5.3.3.2、5.3.3.3和5.3.3.4

步骤，直至将标签序列信号采集完成。

6

DB43/T3250—2025

5.3.3.7碱基识别

信号分析软件对采集得到的荧光信号图片进行处理和分析，将荧光信号转换成碱基序列。碱基序列

以FASTQ格式的文件进行存储，FASTQ格式中每一条测序序列用4行信息表示，符合GB/T35890-

2018中6.1的要求，FASTQ格式文件示例如附录B图B.1。

5.3.3.8数据拆分

根据标签序列将混合测序样本数据进行拆分。

5.3.3.9测序报告生成

生成测序芯片数据产出率、产出有效Reads数、数据质量值、测序读长等参数的报告。

6测序数据质控及基因分型检测

测序数据质量分析及过滤

6.1.1测序数据质量分析

根据GB/T33767.14-2023中6.1.1的规定，用生物信息分析软件对测序数据进行质量分析。

6.1.2测序数据过滤

删除不符合质量要求的数据，获得纯净数据，纯净数据的文件仍是FASTQ格式，符合GB/T35890-

2018中6.1的要求，且不包含测序建库接头序列。

注：接头序列是一段已知的短核苷酸序列，用于连接未知的目标测序片段。

基因分型

6.2.1序列比对

6.2.1.1参考基因组比对

用生信分析软件，将纯净数据比对到参考基因组，确定测序Reads在染色体上的位置。

6.2.1.2比对结果质量评估

比对过程中每个短序列分配一个比对质量值表示映射质量分数，来表明比对过程的可信度。

6.2.1.3比对结果统计

通过比对到参考基因组次数和范围来计算测序深度和覆盖度。

6.2.1.4比对结果输出

数据比对结果输出为SAM/BAM文件格式。

注1：比对质量值：比对到错误位置的概率的整数映射，用来衡量比对正确的概率，通常以数字值直接表示。

注2：SAM/BAM格式：基于文本的储存核酸序列及其测序质量和序列比对相关的信息，其头部为注释信息，主体部

分以行表示序列且每行以制表符分隔的标准格式，BAM格式是SAM格式的二进制压缩格式。

6.2.2个体变异检测

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基于序列比对结果，用生信分析工具确定个体基因组中的SNPs、InDel和SVs等变异，输出GVCF

文件。

6.2.3群体变异检测

在群体研究中，用生信分析工具整合突变群体的变异信息，主要是SNPs信息，输出VCF文件。

6.2.4基因型检测

6.2.4.1文件格式转换

分型软件将VCF文件转换成基因分型数据文件，分型数据文件中包含但不限于样本编号、SNP名

称和基因型。

6.2.4.2基因型判定

农作物基因型的鉴定按照“二八”原则进行杂合基因型判定：当基因座出现两种不同的基因型时，如

低频率的基因型占比≥20%（即高频率的基因型占比≤80%）才被判定为真实的杂合基因型。否则，如低

频率的基因型占比＜20%（即高频率的基因型占比＞80%）则被判定为无效杂合基因型，该基因座将被

判定为高频率基因型的纯合型。

6.2.4.3基因型表示

基因型以ACGT中的两型组合表示，未得到基因型或无法明确判定基因型的记为“NA”。

6.2.4.4基因型质控

按照GB/T33767.14-2023中6.1、6.2、6.3的要求，对基因型数据进行质量判断，统计分析基因型

数据的准确性、完备性和可溯性，基因分型数据准确率不低于98%。

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A

A

附录A

（资料性）

DNA完整性检测凝胶电泳图

凝胶电泳检测基因组