美国药典细菌内毒素试验1995年

美国药典细菌内毒素试验1995年目录

本章节提供—个评估样品内或检品上可能存在的细菌内毒素浓度的方法。试验用的鲎变形细胞溶解物(鲎试剂)是从鲎循环变形细胞的水提取物得到，制备成一种复合的专门试剂一—鲎试剂，用于凝胶形成。用检品的稀释液直接与参考内毒素稀释液做平行比较来确定反应终点，内毒素含量用内毒素单位来表示。因为鲎试剂也可用比浊法或比色法的读数来表达，所以这些试验方法如符合要求也可做为替代方法。这类试验要求建立一条标准回归曲线，然后通过内插法定出检品的内毒素含量：实验过程包括内毒素及对照品溶液与鲎试剂在预定的反应时间中孵育(保温)，及在分光光度计的适当波长中读取光吸收度。比浊法测定可在孵育终止时立即得到数据，在动力学检测中，(比浊法和比色法)反应期间自始至终测量光吸收值，并算出它们的比值。对于比色法，则在读数前加入适量终止反应的酶试剂，使反应终止在预定的反应时间终点上。参考标准和对照标准内毒素(内毒素参考标准品和对照标准品)参考标准内毒素(RSE)系指美国药典内毒素参考标准品，已确定其效价为每瓶10000个美国药典内毒素单位(EU)，每整瓶参考标准内毒素用5ml的鲎试剂用水溶解，并在旋涡混合器上，间歇地混匀30分钟，并用此浓度溶液制备随后一系列稀释液，混匀的参考标准内毒素可在冰箱中保存不超过14天，以备用。每次用此液作稀释前均应在旋涡混合器上强有力地混合3分钟以上，每次制备下一步稀释液前，应混匀稀释液不少于30秒。吸附能使内毒素活力损失，故不要贮存稀释液，反之缺乏支持的论据。对照标准内毒素(CSE)是已被参考标准内毒索标定的另种内毒素制品，每批新的对照标准内毒素用于试验前均应进行标定，用参考标准内毒素标定对照标准内毒素必须用试验中所用的特定鲎试剂。由于分析的是很少量的1瓶对照标准内毒素和1瓶参考标准内毒素，可能会影响凝胶过程。但按“试验程序”规定，稀释参考标准内毒素系列的每一浓度水平都必须用4支重复试管；每瓶对照标准内毒素或等比稀释液，同样也用4支重复试管。参考标准内毒素反应终点对数的均数与对照标准内毒素反应终点对数的均数之差的反对数，就是标定对照标准内毒素的效价，然后再转换并表达为对照标准内毒素在干燥状态下每ng所含内毒素单位和每个包装所含内毒索单位，无论那种表达方式都可行。合适的对照标准内毒素效价范围为每ng2—50EU。预试验使用有确定标示灵敏度的鲎试剂，将使用的容器或用具经烤箱250复核鲎试剂灵敏度试验复核灵敏度试验至少用1瓶鲎试剂，制备成2λ、λ、0.5λ和0.25λ的参考标准内毒素(或对照标准内毒素)双份稀释液系列。这里λ是鲎试剂的标示灵敏度，用每毫升含内毒素单位表示，将上述4个浓度分别做4支重复试管试验及阴性对照。终点浓度的几何均数(见计算和判断)必须大于或等寸0.5λ，且少于或等于2.0λ。每一批新的鲎试剂，在用于试验前都要复核其标示的灵敏度。增强/抑制试验取部分检品或不超过最大有效稀释度(倍数)的稀释液(未经处理已不能测出内源性内毒素)，用不加及加有最终浓度为λ、λ、0.5λ和0.25的内标素的检品进行试验，遵照”试验程序”进行，对未经处理的检品和加有内毒索的样品，每个浓度均不少于4支重复试管。平行试验用水加相同浓度内毒索重复试验并做阴性对照，如“计算和判断”项所描述的那样，计算检查品反应终点内毒索浓度的几何均数，如果检品反应终点的几何均数大于或等于0.5λ，且小于或等于2.0λ，则该检品的增强/抑制试验是有效的；如果加有内毒索的检品得出的结果超出规定的范围，则该检品不适用于细菌内毒素检测。在中和、灭活或排除干扰物质或将检品做不超过最大有效稀释倍数的稀释液后，重做增强／抑制试验(所用稀释液，不超过最大有效稀释倍数)足以克服已知加入的内毒索对检品在检测过程中的增强／抑制干扰：在试验中，未经处理的样品，若察有内源性内毒素，则检品不宜做增强／抑制试验，或通过超滤法或适当稀释以消除山毒素的作用，使其变成能用此法检测。把未经处理的检品稀释到不超过最大有效稀释倍数的水平、且察觉不到内毒素时，用此稀释液重复检品的增强／抑制试验。最大有效稀释(MVD)最大有效稀释适用于注射剂或经整倍稀释的非肠道给药的溶液及—些给药剂量按重量计算而给药量的体积是可改变的药物，内毒索的限值浓度是依据每个检查品里的含量所定。用λ除以限值得到最大有效稀释系数，λ是在检验溶解物时标定的灵敏度(以EU／训表示)，这里每个检查品的内毒素限值都是按该检品的活性单位或按重量表示(即EU／mg或EU／unit)。用被检测样品的溶解浓度或用该检品按标签标示的浓度(mg／m1或units／m1)乘以限值的积再除以λ得到最大有效稀释系数，二种方法都可以。所得最大有效稀释系数是作为有效检验制备的最低稀释浓度溶液。试验步骤在试验的准备和进行过程中，要格外小心避免微生物污染样品。通过按几何系列即每一浓度都比下一浓度大一个恒定比率，逐次稀释，以降低待测样品的浓度来控制样品小内毒索含量。另应有阴性和阳性对照及阳性样品对照，试验中每个样品的每一稀释浓度不得少于2支重复反应管，包括一系列标准品内毒素稀释液做平行试验时也不少于2支重复反应管。对每个试管架上的样品，都应有—套内毒素标准品稀释液系列管—块孵育。当环境条件能保持—致时，也可伴多个试管架的样品一齐孵育。准备由于标准内毒素和鲎试剂的包装和装量可能不同，含量和(或)稀释应按标签所示。样品和鲎试剂混合后的pH值范围应在6.0—8.0，除非个别样品另有特别规定。pH可通过实验前在样品中加无菌、无内毒素的NaOH或HCl或合适的缓冲剂来调节。操作程序在110*75mm试管或单个试瓶中，分别加入一定量的阴性对照、标准内毒索浓液、样品和阳性检品对照。阳性检品对照制品或溶液洗涤液或提取液组成，其中加入浓度为2λ的参考标准内毒素或已标定的对照标准内毒素。除非用中个试瓶，试管中均应加适量的鲎试剂。混合样品／鲎试剂的混和物均放人孵育装置，如水浴箱或加热箱小，准确记录试管放入的时间，在37±1℃无振动孵育60上2分钟，然后小心取出观察。阳性反应的特点是坚实的凝胶形成，翻转脂180℃时保持不脱落，记作阳性(十)。阴性结果的特征是缺乏这样的凝胶或形成粘性胶状但不能保持完整，结果记作阴性(—)，拿取试管如果阳性产品对照为阴性或内毒素标准品剂量在货试剂标示灵敏度的±1个二倍稀释度内仍不显示终点浓度；或任—阴性对照呈阳性则试验无效。若测定试验样品中存在的内毒索量需做含量计算。计算和判断(解释)几何均数计算反应终点是在内毒索、样品或加有内毒素的样品的系列递减浓度小，最后呈阳性试验结异的浓度，记录每—稀释系列重复试验的终点浓度E，确定终点浓度的对数e，并用下面的公式计算终点浓度的几何均数。终点浓度的几何均数：(∑e／f)的反对数这里∑e是所用稀释系列反应终点浓度的对数和，f是重复试验组数(反应管数)。内毒素含量计算计算检测样品中或制品表面内毒素浓度(EU／m1或g或mg)，首先计算反应终点的浓度E，每—稀释系列的反应终点浓度由每—反应终点稀释系数的倒数乘以λ得到。这里λ是试