CN115745788B 一种可电离脂质化合物及其制备方法和应用 （国家纳米科学中心）

一种可电离脂质化合物及其制备方法和应用本发明提供一种可电离阳离子脂质化合物其中，n为1～5的整数；R1为_CH3，_CH2CH3，_R46各自独立的为包含或不含杂原子物能更好地适用于递送生物活性分子尤其是具核酸预防剂及治疗剂的发展和应用提供更佳选21.一种可电离阳离子脂质化合物在制备靶向脾脏的生物活性物质递送系统中的应用，所述可电离阳离子脂质化合物具有式I所示;其中，n为1～5的整数；R1为CH3，CH2CH3，CH2CH2CH3，CH2OH，CH2CH2O2.一种可电离阳离子脂质化合物在制备靶向肺部的生物活性物质递送系统中的应用，所述可电离阳离子脂质化合物具有式I所示10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述生物活性物质选自DNA、mRNA、3[0006]其中，n为1～5的整数；R1为_CH3，_CH2CH3，_CH2CH2CH3，_CH2OH，_CH2CH2OH，_R2为_H3为4一个为当R3、中至少两个46基团各自独立的为直链或支链C1020烷基，直链或支链3为R45为[[0012]其中每条支链上的n2各自独立的选自1～8的整数优选4～8的48的5[0014]其中每条支链上的n3各自独立的选自1～8的整数优选4～8的48的特定新型化合物具有比现有四条疏水尾链分子结构的化合物具有更高的细胞转染率效果，溶酶体逃逸。并且在此基础上同时优化X基团能提供具有更优异的特异性靶向效果的非肝水极性头部)与三当量或三当量以上的疏水脂质尾链化合物在合适的条件下反应形成。可电离脂质化合物的合成是在有或无溶剂的情况下进行，并且所述合成可在25_120℃范围[0018]在本发明的一些实施方式中提供所述可电离阳离子脂质化合物的制备方法，包6[0026]在本发明的一些实施方式中，所提供的所述可电离阳离子脂质化合物的制备方7[0037]本发明还提供了所述的可电离阳离子脂质化合物在制备生物活性物质递送系统所述的可电离阳离子脂质化合物在制备特异性的靶向脾脏的生物活性物质递送系统中的备特异性的靶向肺脏的生物活性物质递送系统中的应[0040]其中每条支链上的n2各自独立的选自1～8的整数优选4～8的[0042]其中每条支链上的n3各自独立的选自1～8的整数优选4～8的8[0045]本发明还提供了含有所述的可电离阳离子脂质化合物的小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)、适配体9[0052]根据本发明的一些优选实施方式，式I的可电离脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30一60mol例如可以为30mol31mol32mol33mol%,34mol35mol36mol37mol38mol39mol40mol41mol42mol%,43mol44mol45mol46mol47mol48mol49mol50mol51mol%,[0054]根据本发明的一些优选实施方式，所述中性脂质分子选自磷脂酰胆碱类化合物脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺例如可以为5mol6mol7mol8mol9mol10mol11mol12mol%,[0061]根据本发明，胆固醇类脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30一50mol例如可以为30mol31mol32mol33mol34mol35mol36mol%,37mol38mol39mol40mol41mol42mol43mol44mol45mol%,1,2二肉豆蔻酰基sn甘油3磷酸乙醇胺中的一种或多种；所述PEG的数均分子量为130具有独立地包含约C4至约C30饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基酯或PEG一聚丙烯(参见例如J.MiltonHarris,Poly(ethyleneglycol)chemistry:基(聚乙二醇)2000](DMGPEG2000)、1,2二硬脂酰基sn甘油甲氧基聚乙二醇(DSG[0066]根据本发明，PEG化的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为0.5一5mol例如可以为0.5mol0.6mol0.7mol0.8mol0.9mol1.0mol%,1.1mol1.2mol1.3mol1.4mol1.5mol1.6mol1.7mol1.8mol%,1.9mol2.0mol2.1mol2.2mol2.3mol2.4mol2.5mol2.6mol%,2.7mol2.8mol2.9mol3.0mol3.1mol3.2mol3.3mol3.4mol%,3.5mol3.6mol3.7mol3.8mol3.9mol4.0mol4.1mol4.2mol%,4.3mol4.4mol4.5mol4.6mol4.7mol4[0067]在本发明的一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒中含有式A所示的可电离阳离子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为8一20mol优选为8一18mol更优选为9一16mol%;纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为0.5一5mol优选为0.5一2.5mol更优选为1.2一胆固醇和PEG化的脂质分子摩尔比为45胆固醇和PEG化的脂质分子摩尔比为40[0076]在本发明的一个实施方式中，式A可电离阳离子脂质分子为化合物N34一O18一2脂质分子，胆固醇类脂质分子，和PEG化的脂质分子占总体脂质分子摩尔％比进行了最优以及所属领域的普通技术人员熟知的其它方法来制备脂质纳米[0091]由本发明的可电离脂质化合物形成的递送系统可与一种或一种以上医药赋形剂同的含义，旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当在本文中使用术语这种精确度的区间为±10％。[0097]图2为本发明实施例中化合物(9Z,12Z)_9,12_二烯十八烷丙烯酸酯(a3)的氢谱[0107]图12为本发明实施例中N34_O18_2(3T)，N34_O18_2(4T)制备的LNP包封LuciferasemRNA(LucRNA)转染293T细胞24h后Luciferase[0108]图13为本发明实施例中N34_O18_2(3T)制备的LNP包封LuciferaseDNA(pDNA)转染293T细胞24h后Lucifera[0109]图14为本发明实施例中N34_O18_2(3T)制备的LNP包封LuciferasesiRNA(siRNA)转染293T细胞24h后Luciferase蛋白[0111]图16为本发明实施例中N34_O18_2(3T)_LNP和ALC_0315_LNP对293T的细胞毒性[0112]图17为本发明实施例中小鼠通过静脉注射N34_O18_2(3T)_LucRNA6h后各器官[0113]图18为本发明实施例中小鼠通过静脉注射N34_N18_2(3T)_LucRNA6h后各器官[0121]1HNMR(400MHz,Chloroform_d)δ5.47_5.26(m,4H),3.加入(9Z,12Z)_9,12_十八碳二烯_1_醇(3.2g)、三乙胺(3.64g)，随后将含有丙烯酰氯HNMR(400MHz,Chloroform_d)δ6.40(dd甲烷/甲醇洗脱来纯化目标产物，得到N34_O18_2(3T)45mg，N34_O18_2(4T)66mg，化合物分别按照摩尔比45％:15％:38.5％:1.5％配置乙醇溶液作为有机相，把LuciferasemRNA[0147]从实施例4的结果可以看出，由新型脂质化合物N34_O18_2(3T)制备的脂颗粒LucRNA_LNP粒径在120nm左右，LucRNA_LNP粒径分布较窄(PDI较小)，包封率高达104个细胞/well，当细胞融合度为30％_50％转染24h后使用多功能酶标仪检测蛋白表达量。阴性对照为不添加LucRNA_LNP的细胞培养[0149]从实施例4的结果也可以看出，由新型脂质化合物N34_O18_2(3T)制备的脂质纳45％:15％:38.5％:1.5％配置乙醇溶液作为有机相，把Lucifera的水溶液作为水相。按照水相和有机相的体积[0155]用多功能酶标仪(BioTek,型号为SLXFATS)荧光素报告基因法来检测制备的pDNA_LNP293T细胞的转染效率。体外转胞/well，当细胞融合度为30％_50％进行转染。使用转染试剂Lipofectamine2000外细胞转染效率如图13所示，表明由可电离脂质N34_O18_2(3T)制备的LNP包裹DNA具有很[0156]从实施例5的结果可以看出，由新型脂质化合物制备的脂质纳米颗粒pDNA_LNP的45％:15％:38.5％:1.5％配置乙醇溶液作为有机相，把LuciferasesiRNA(siRNA)溶于pH[0159]使用ZetasizerPro纳米粒度电位仪(马尔文帕纳科)进行siRNA_LNP粒径和Zeta电位的表征。实施例6的检测结果如表3所示。新型脂质化合物配伍制备的脂质纳米颗粒[0162]用多功能酶标仪(BioTek,型号为SLXFATS)荧光素报告基因法来检测制备的进行转染操作。转染24h后使用多功能酶标仪检测蛋白表达量。阴性对照为不添加siRNA_[[0168]按照实施例4所述的方法，分别使用N34_O18_2(3T)和ALC_0315制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为：N34_O18_2(3T):DSPC:Cholesterol:DMG_PEG2000＝45:15:385:[0172]由上表可见，N34_O18_2(3T)制备的脂质纳米颗粒包封率高达98.[0176]实施例8N34_O18_2(3T)_LNP，N34_N18_2(3T)_LNP脂质纳米颗粒在动物体内的转[0177]采用纳米脂质颗粒小鼠尾静脉注射的方式，按照实施例3所述的方法，使用N34_O18_2(3T)或N34_N18_2(3T)制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为：N34_O18_2(3Cholesterol:DMG_PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1,N34_N18_2(3T):DSPC:荧光蛋白的mRNA，mRNA的用量为10μg，N34_O18_2(3T)或N34_N18_2(3T)、DSPC、器官中的荧光表达量主要分布在脾脏约100心脏0肝脏0肺部0肾脏0可见颗粒后，小鼠各器官中的荧光表达量主要分布在脾脏约0心脏0肝脏0肺部100肾脏0可见其可以特异性的靶向肺部。可见，本发明基于三条脂质疏水尾链形成以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；